结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂技术审查Word文档格式.docx

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综述资料应符合《体外诊断试剂注册管理办法》（国家食品药品监督管理总局令第5号，以下简称《办法》）和《关于公布体外诊断试剂注册申报资料要求和批准证明文件格式的公告》（国家食品药品监督管理总局公告2014年第44号）的相关要求。

（二）主要原材料的研究资料

应提供主要原材料如抗原肽/重组抗原、抗体、阴性对照、阳性对照、标准品（γ-干扰素）、酶、以及企业参考品等的选择与来源、制备过程、质量分析和质量控制标准等的研究资料。

若主要原材料为企业自己生产，其生产工艺必须相对稳定；

如主要原材料购自其他供货商，应提供的资料包括：

供货商提供的质量标准、出厂检定报告或性能指标证书，以及该原材料到货后的质量检验资料。

企业参考品：

申请人应提供企业参考品的详细的来源、制备和确定等资料。

对于采用ELISPOT方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：

阴性参考品、阳性参考品和重复性参考品。

其中，阳性参考品建议采用结核病患者（菌阴和菌阳）的全血，阴性参考品建议采用随机健康人群和非结核病患者的全血，重复性参考品建议采用结核病患者的全血。

鉴于冻存循环会损害全血样本中细胞的免疫功能，不建议采用冻存的全血作为企业参考品。

对于采用ELISA方法的申报试剂，企业参考品至少应包括：

阴性参考品、阳性参考品、最低检测限参考品、线性参考品、准确度参考品和精密度参考品等。

其中，阴性参考品、阳性参考品和精密度参考品的设置可参考采用ELISPOT方法的申报试剂的相关要求；

最低检测限参考品、准确度和线性范围参考品，主要考察ELISA部分的性能，可采用含有γ-干扰素的溶液（建议采用血浆作为基质溶液）。

对于阴性/阳性对照：

申报试剂的质控体系通过设置阳性、阴性对照来实现，申报资料应详细描述各种对照的原料选择、制备、定值过程等试验资料。

本指导原则的技术要求是基于ELISA和ELISPOT方法建立的，对于采用上述方法学的结核细胞类检测试剂，建议至少设置阳性对照和阴性对照。

阳性对照一般采用单核细胞非特异性刺激物，用于质控外周血单核细胞功能是否正常，避免产生假阴性。

阴性对照一般为检测过程所用培养基，用于控制细胞在活化过程中所产生的各种因子的非特异性影响，避免产生假阳性。

校准品（如适用）的选择及质量标准：

应详细描述校准品的来源、制备、纯度、浓度、分子量、功能活性等的确定和验证资料。

多肽/重组抗原的选择及质量标准：

应详细描述多肽的来源（来自何种抗原）/重组抗原的来源、组成、分子量、纯度、浓度、内毒素含量、刺激活性、特异性等的确定和验证资料。

如为冻干抗原，还应设置水分含量的质控标准。

抗体的选择及质量标准：

应详细描述抗体的来源、纯度、浓度、分子量、免疫原性、效价和功能活性等的确定和验证资料。

（三）主要生产工艺及反应体系的研究资料

主要生产工艺包括：

配制工作液、分装和包装等，可用流程图表示。

应提供主要生产工艺的确定依据，包括试验方法和数据等。

反应体系研究资料应能对产品说明书中检验方法部分涉及到的基本内容，如样本用量、试剂用量、反应条件等，提供确定的依据，包括试验方法和数据等。

（四）分析性能评估资料

企业应提交对申报试剂进行的所有性能验证的研究资料，包括具体的试验方法、内控标准、实验数据和统计分析等。

对于结核分枝杆菌细胞免疫反应检测试剂，建议着重对以下分析性能进行研究。

1、对于采用ELISA方法的申报试剂

检验方法分为两大部分：

（1）将结核分枝杆菌特异性抗原与全血样本共培养，获得含有γ-干扰素的血浆样本；

（2）以γ-干扰素标准品做校准曲线，对第

（1）步的血浆样本采用ELISA方法进行定量检测。

基于该方法学的分析性能，需要对上述两方面的性能均进行验证。

1.1最低检测限

建议采用含有系列γ-干扰素稀释浓度的血浆样本，对每个浓度样本进行多次重复检测，选取（测定平均OD值-2SD）大于（0浓度测定的平均OD值+2SD）的浓度作为最低检测限浓度。

申请人也可采用其他合理方法确定申报试剂的最低检测限。

1.2线性范围

线性范围确定的研究应使用高值样本（采用血浆基质，采用可溯源至国际校准品的方法对血浆样本中的γ-干扰素进行定量）进行梯度稀释，稀释液应使用血浆，应包含接近最低检测限的临界值浓度。

通过评价一定范围内的线性关系确定申报试剂的线性范围。

1.3准确度

可采用如下方法进行评价，如：

与国际标准品的偏差分析、回收试验或方法学比对等方法，企业可根据实际情况选择合理方法进行研究。

1.4分析特异性

1.4.1交叉反应

交叉反应的验证主要考虑全血自身含有的细胞因子或全血刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。

需要进行交叉反应验证的细胞因子包括：

IL-1α、IL-1β、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-12、IL-10、TNFα、IFN-α和IFN-β等。

建议在0浓度γ-干扰素水平和最低检测限浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

同时，建议申请人采用一定数量的其他常见分枝杆菌感染患者的全血样本进行试验，评价申报试剂的特异性。

1.4.2干扰物质

应对全血样本中常见的干扰物质进行验证，包括：

抗凝剂、甘油三酯、血红蛋白、胆红素、类风湿因子、抗核抗体、抗线粒体抗体和免疫抑制剂等。

建议采用含有不同浓度γ-干扰素的血浆样本分别进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。

1.5精密度

1.5.1采用全血样本进行试验的精密度：

分别采用阳性全血样本和阴性全血样本，进行多次重复检测，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。

1.5.2采用含有γ-干扰素的血浆样本进行试验的精密度：

建议在γ-干扰素0浓度、低浓度和中等浓度3个浓度水平分别进行验证。

1.5.2.1阴性样本（0浓度）：

不含γ-干扰素的样本，CV≤15%（n≥20）。

1.5.2.2低浓度样本：

γ-干扰素浓度略高于试剂盒的最低检测限，CV≤15%（n≥20）。

1.5.2.3中等浓度样本：

采用中等浓度的样本进行重复检测，CV≤15%（n≥20）。

1.5.3申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

1.6阴性参考品符合率

建议选择至少15份健康人和非结核病患者的全血样本进行试验，阴性参考品符合率不低于75%。

1.7阳性参考品符合率

建议选择至少20份结核病患者（至少10例细菌学阳性，至少10例细菌学阴性）全血样本进行试验，阳性参考品符合率不低于80%。

1.8校准品的溯源资料

γ-干扰素具有国际标准品，建议检测结果的量值溯源至国际标准品。

申请人应提供从国际标准品到产品标准品的溯源链以及各级赋值资料。

2、对于采用ELISPOT方法的申报试剂

检验方法为：

将结核分枝杆菌特异性抗原与分离的单核细胞（PBMC）共培养，活化刺激PBMC分泌的γ-干扰素被微孔板上包被的单克隆抗体捕获，再用酶标记的另一个单克隆抗体进行反应显色，一个斑点即代表一个细胞，计数斑点的多少，从而判断是否存在结核分枝杆菌特异性的细胞免疫反应。

基于该方法学的分析性能，需从下述几个方面进行性能验证。

2.1分析特异性

2.1.1交叉反应

交叉反应的验证主要考虑PBMC刺激培养过程中产生的细胞因子与申报试剂所用γ-干扰素抗体对是否存在交叉反应。

建议在0浓度γ-干扰素水平和低浓度γ-干扰素水平分别进行交叉反应的验证。

2.1.2干扰物质

建议采用全血样本进行干扰物质的验证，给出不产生干扰的最高干扰物浓度。

2.2精密度

采用全血样本（包括高斑点数样本、中等斑点数样本和cut-off值附近斑点数样本）分别进行精密度评价，进行多次重复试验，判断检测结果的阴阳性，多次重复检测结果应一致。

同时，还应计数斑点数，计算其CV值。

cut-off值附近斑点数样本的CV值差异可能最大，但也不能超过25%。

申请人应设置合理的精密度评价周期，以便对批内/批间、日内/日间以及不同操作者之间的精密度进行综合评价。

2.3阴性参考品符合率

建议选择至少15份健康人和非结核患者的全血样本进行试验，阴性参考品符合率不低于75%。

2.4阳性参考品符合率

建议选择至少20份结核病患者（10例细菌学阳性，10例细菌学阴性）全血样本进行试验，阳性参考品符合率不低于80%。

（五）阳性判断值的研究资料

此类试剂的阳性判断值较为复杂，阳性判断值对应产品说明书中“检验结果的解释”部分的内容，申请人应对产品说明书中“检验结果的解释”部分所涉及的各个数值提供详细的确定和验证资料。

该部分资料应采用临床样本进行试验，请注意临床样本的选择应与申报产品声称的预期用途相一致。

建议采用受试者工作特征（ROC）曲线的方式进行确定。

（六）稳定性研究资料

稳定性包括申报试剂稳定性和样本稳定性（包括全血样本稳定性和血浆样本稳定性）。

前者主要包括实时稳定性（有效期）、运输稳定性、开封稳定性及冻融次数限制（如适用）等。

稳定性研究资料应包括研究方法的确定依据、具体的实施方案、详细的研究数据及结论。

对于实时稳定性研究，应提供至少三批样品在实际储存条件下保存至成品有效期后的研究资料。

试剂稳定性和样本稳定性两部分内容的研究结果均应在说明书【储存条件及有效期】和【样本要求】两项中进行详细说明。

（七）临床试验

临床试验总体要求及临床试验资料的内容应符合《体外诊断试剂临床试验指导原则》、《办法》和“44号公告”的规定，以下仅结合结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂的具体特点对其临床试验中应重点关注的内容进行阐述。

1、临床试验机构的选择

申请人应当选定不少于3家（含3家）临床试验机构，按照法规要求开展临床试验。

2、对比试剂的选择

如果申报产品预期用于结核病的辅助诊断，申请人可选择境内已批准上市、临床普遍认为质量较好的同类产品作为对比试剂，采用试验用体外诊断试剂（以下称申报试剂）与对比试剂进行比较研究试验，证明本品与已上市产品等效或优于已上市产品。

3、临床试验对象的选择

如果申报产品预期用于结核病的辅助诊断，临床试验对象应包括如下几类：

（1）临床试验总病例至少1000例；

（2）具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者病例；

（3）最终临床诊断为结核病患者的病例中，应包括肺结核患者和肺外结核患者，并且涂片阴性的肺结核患者占所有肺结核患者的比例不应小于50%；

肺外结核至少50例；

（4）非结核的其他呼吸道疾病患者以及其他易混淆疾病的患者病例（最终临床诊断不是结核病），包括肺炎、肺癌、支气管炎、支气管扩张、非结核分枝杆菌病等，其中肺癌至少50例；

（5）上述人群均不应进行PPD筛选，应包括PPD阴性和阳性人群，不能人为选择PPD阴性人群进行临床试验；

（6）各临床试验机构的样本量和样本分布应相对均衡。

全血样本不能冻融，临床试验应采用新鲜样本，样本采集和保存等应满足申报试剂和对比试剂说明书的相关要求。

4、临床试验方法、临床原始数据及统计分析

4.1分别依据申报试剂和对比试剂各自的说明书对入组临床样本进行检测，记录结果。

4.2临床报告中，应明确：

总样本例数；

临床诊断为肺结核患者的总例数，说明涂片阴性和涂片阳性的肺结核患者例数；

肺外结核患者的例数，说明各类肺外结核患者的例数；

非结核的其他呼吸道疾病患者以及易混淆疾病样本例数，说明各类非结核疾病的患者例数；

其他人群。

4.3临床原始数据应以列表的方式表示，包括每个病例样本的年龄、性别、临床诊断结果、申报试剂的结果以及对比试剂的结果等。

4.4对临床试验数据的统计应选择合适的统计方法，如受试者工作特征（ROC）曲线分析、阴性/阳性符合率等。

常选择四格表的形式总结两种试剂的定性检测结果，对定性结果进行四格表卡方或kappa检验以验证两种试剂定性结果的一致性，统计分析应可以证明两种方法的检测结果无明显统计学差异。

4.5申报试剂对涂片阴性的肺结核患者和肺外结核患者均应有一定的检出率；

明确申报试剂的临床特异性不低于75%。

5、结果差异样本的验证

对于两种试剂检测结果不一致的样本，应采用临床上公认较好的第三方试剂或其他合理方法进行复核，同时结合患者的临床病情对差异原因及可能结果进行分析。

6、临床试验方案

各临床试验机构的方案设置应基本一致，且保证在整个临床试验过程中遵循预定的方案实施，不可随意改动。

整个试验过程应在临床试验机构的实验室内并由本实验室的技术人员操作完成，申报单位的技术人员除进行必要的技术指导外，不得随意干涉实验进程，尤其是数据收集过程。

试验方案中应确定严格的样本入选/排除标准，任何已经入选的样本再被排除出临床试验都应记录在案并明确说明原因。

各临床试验机构选用的对比试剂应保持一致，以便进行合理的统计学分析。

7、其他问题

如果申报产品的预期用途为结核感染的辅助诊断，申请人应按照法规要求，设置合理的对比方法，选择合适的预期适用人群，进行临床试验。

（八）产品技术要求

产品技术要求应符合《办法》和《医疗器械产品技术要求编写指导原则》的相关规定。

内容主要包含产品性能指标和检验方法，并在附录中明确主要原材料、生产工艺及半成品检定要求。

对于采用ELISA方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：

外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率、线性范围、准确度、最低检测限和精密度。

其中，阴性参考品符合率建议采用至少15份随机健康人的新鲜全血样本进行试验，阴性参考品符合率应不低于75%；

阳性参考品符合率建议采用至少20例结核病患者（菌阳和菌阴样本分别至少10例）的新鲜全血样本,阳性参考品符合率应不低于80%；

精密度应采用1份结核病患者的新鲜外周全血样本进行多次重复检测，结果均为阳性。

除此之外，精密度还应采用γ-干扰素溶液进行精密度研究，计算CV值。

对于采用ELISPOT方法的申报试剂，产品技术要求的性能指标至少应包括：

外观、阴性参考品符合率、阳性参考品符合率和精密度。

阳性参考品符合率应采用至少20例结核病患者（菌阳/菌阴样本分别至少10例）的新鲜全血样本,阳性参考品符合率应不低于80%；

精密度应采用1份结核病患者的新鲜外周全血样本进行多次重复检测，结果均为阳性，且斑点数CV不大于25%。

（九）产品注册检验报告

根据《办法》要求，首次申请注册的第三类产品应在具有相应医疗器械检验资质和承检范围的医疗器械检验机构进行连续三个生产批次样品的注册检测。

（十）产品说明书

产品说明书的格式应符合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，境外试剂的中文说明书除格式要求外，其内容应尽量保持与原文说明书一致，翻译力求准确且符合中文表达习惯。

产品说明书的所有内容均应与申请人提交的注册申报资料中的相关研究结果保持一致。

结合《体外诊断试剂说明书编写指导原则》的要求，下面对结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂说明书的重点内容进行说明。

1.【预期用途】

应至少包括以下几部分内容：

1.1本产品用于体外检测人新鲜外周静脉抗凝血中结核分枝杆菌特异性的T细胞免疫反应，用于结核感染的辅助诊断或者用于结核病的辅助诊断（根据临床试验等研究资料确认预期用途）。

1.2说明与预期用途相关的临床适应症背景情况，说明相关的临床或实验室诊断方法。

1.3待测人群特征介绍：

具有结核病相关体征/症状的疑似结核病患者、地域要求或年龄限制（如有）等。

2.【主要组成成分】

2.1说明试剂盒包含组分的名称、数量、比例或浓度等信息，说明不同批号试剂盒中各组分是否可以互换。

2.2试剂盒中不包含但对该项检测必须的组份，企业应列出相关试剂/耗材的名称、货号及其他相关信息。

2.3真空采血管作为非体外诊断试剂的医疗器械进行管理，与体外诊断试剂遵循不同的法规，申报试剂的注册单元不应包括真空采血管。

3.【检验原理】

3.1详细说明试剂盒所用的刺激抗原/抗原肽（名称、是否多肽抗原/重组抗原），以及所用抗原/抗原肽在卡介苗和非结核分枝杆菌中的存在情况。

3.2试剂盒技术原理的详细介绍，建议结合适当图示进行说明。

4.【储存条件及有效期】

说明试剂盒的效期稳定性、开封稳定性、复融稳定性、冻融次数要求（如适用）等，应明确具体的储存条件及有效期。

5.【样本要求】

重点明确以下内容：

5.1样本的采集：

明确所用抗凝剂。

5.2样本的保存：

5.2.1对于采用ELISPOT方法的申报试剂，应明确：

全血样本进行单核细胞分离前的保存温度与时间；

分离后单核细胞在与抗原孵育培养前的保存温度与时间；

培养后血浆的保存温度与时间。

5.2.2对于采用ELISA方法的申报试剂，应明确：

全血样本在与抗原孵育培养前的保存温度与时间。

6.【检验方法】

该类产品的检测步骤繁多，应详细描述从全血采集开始到结果判读前的每个步骤，并明确注意事项。

重点关注以下问题：

6.1对于采用ELISPOT方法的申报试剂，明确培养时所用单核细胞的数量以及所用培养基类型；

6.2对于采用ELISA方法的申报试剂，明确所用培养基类型。

7.【检验结果的解释】

结合阳性对照、阴性对照以及样本管检测结果，以列表的形式对所有可能出现的结果组合及相应的解释进行详述，明确灰区结果的处理方式。

8.【检验方法的局限性】

8.1本试剂盒的检测结果仅供临床参考，对患者的临床诊治应结合其症状/体征、病史、其他实验室检查及治疗反应等情况综合考虑。

8.2有关假阴性结果的可能性分析，如：

某些免疫功能受损的患者，可能导致假阴性。

8.3有关假阳性结果的可能性分析，如：

与其他分枝杆菌是否存在交叉反应。

9.【产品性能指标】

9.1最低检测限（如适用）：

说明试剂的最低检出浓度，简单介绍最低检测限的试验方法及结果。

9.2企业阴阳性参考品的检测符合情况：

简单介绍阴阳性参考品的组成和符合率结果等信息。

9.3精密度：

明确精密度参考品的组成及结果。

9.4分析特异性

9.4.1交叉反应：

明确可能产生交叉反应的其他细胞因子的验证情况；

9.4.2干扰物质：

明确样本中常见干扰物质对检测结果的影响；

9.5对比试验研究（如有）：

简要介绍对比试剂（方法）的信息、所采用的统计学方法及统计分析结果。

9.6境外（如适用）和境内临床试验数据总结。

四、名词解释

1.分析特异性analyticalspecificity

测量程序只测量被测量物的能力。

分析特异性用于描述检测程序在样本中有其他物质存在时只测量被测量物的能力。

通常以一个被评估的潜在干扰物清单来描述，并给出在特定医学相关浓度值水平的分析干扰程度。

注：

潜在干扰物包括干扰物和交叉反应物。

2.精密度precision

在规定条件下，相互独立的测试结果之间的一致程度。

精密度的程度是用统计学方法得到的测量不精密度的数字形式表示，如标准差（SD）和变异系数（CV）。

3.最低检测限detectionlimit,limitofdetection

样品中以一定概率可被声明与零有差异的被测量的最低值。

五、参考文献

1.《体外诊断试剂注册管理办法》，（国家食品药品监督管理总局令第5号），2014年7月30日

2.《体外诊断试剂临床试验技术指导原则》，（国家食品药品监督管理总局2014年第16号），2014年9月11日

3.《体外诊断试剂说明书编写指导原则》，（国家食品药品监督管理总局2014年第17号），2014年9月11日

4.中华医学会结核病学分会，《中华结核和呼吸杂志》编辑委员会.γ-干扰素释放试验在中国应用的建议，《中华结核和呼吸杂志》，2014,37（10）：

744-747。

5.LeiGao,WeiLu,etal.LatenttuberculosisinfectioninruralChina:

baselineresultsofapopulation-based,multicentre,prospectivecohortstudy.LancetInfectiousDiseases,2015,15（3）:

310.

6.https:

//www.accessdata.fda.gov/cdrh_doc