细菌分类鉴定方法的研究进展Word文档格式.docx

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1.1.3免疫荧光技术7

1.1.4放射免疫测定技术7

1.1.5免疫胶体金标记技术7

1.2　蛋白质图谱分析7

2、细菌的数值分类和自动化鉴定8

3、化学分类鉴定法8

3.1磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6]8

3．2高效液相色谱（HPLC）[7]8

3.3气相色谱（GC）[7]8

4、分子遗传学分类鉴定法9

4.1细菌染色体DNAG+Cmol%含量测定9

4.2核酸杂交技术9

4.3限制性核酸内切酶分析法9

4.4质粒图谱分析法9

4.5脉冲场凝胶电泳分析法9

4.6PCR技术9

4.716SrRNA序列和16S～23SrRNA间区序列分析法10

4.8微生物全基因组测序10

6、参考文献10

摘要

细菌分类鉴定方法包括表型鉴定法和分子遗传学鉴定法两大类,分成4个水平:

细菌形态和生理生化水平、细胞组分水平、蛋白质水平和核酸水平。

表型鉴定法是对前3个水平的鉴定,包括常规鉴定法、数值分类鉴定法和化学分类鉴定法。

分子遗传学鉴定法[1]是核酸水平的鉴定,对细菌染色体或质粒DNA进行分析,核酸杂交、PCR技术、16SrRNA和16～23SrRNA序列分析、全基因组测序等,此类方法使细菌种属定位和亲源关系判别由表型特征深化为基因型鉴定。

本文主要来介绍各种分类方法以及每种方法的优缺点。

关键词：

细菌分类鉴定表型鉴定分子遗传学鉴定

Bacterialclassificationandidentificationoftheresearchprogress

ABSTRATC

Bacterialclassificationandidentificationmethodtwocategories,includingthethephenotypeidentificationmethodandmoleculargeneticidentificationmethodisdividedintofourlevels:

thebacterialmorphologicalandphysiologicalandbiochemicallevel,thelevelofcellularcomponents,proteinlevelandthenucleotidelevel.Thephenotypicidentificationlawistheidentificationofthefirstthreelevels,includingconventionalidentificationmethod,numericalclassificationandidentificationandchemicalclassificationidentificationmethod.Identificationofmoleculargeneticsmethod[1]istheidentificationofthenucleicacidlevel,analysisofthebacterialchromosomeorplasmidDNA,nucleicacidhybridization,PCR,16SrRNAandthe16~23SrRNAsequenceanalysisofwhole-genomesequencing,suchpositioningmethodbacterialspeciesandphylogeneticdiscriminationbythedeepeningofthephenotypiccharacteristicsofgenotyping.Thispaperismainlytointroducethevariousclassificationmethodsaswellastheadvantagesanddisadvantagesofeachmethod.

Keyword：

Bacterialclassificationandidentification

PhenotypicidentificationMoleculargeneticidentification

1、引言

1.1细菌分类鉴定

1.1.1细菌常规鉴定方法

细菌常规鉴定法是细菌形态和生理生化水平及蛋白质水平的鉴定,前者是最经典、最常用的分类鉴定指标,也是现代化分类鉴定的依据,后者包括免疫诊断技术、蛋

白质图谱分析和氨基酸序列分析等。

1.1.2　细菌的数值分类和自动化鉴定

目前应用较多的自动化鉴定系统主要有:

Vitek-AMS（AutomatedMicrobicSystem）[2]、Biolog、MicroScan、Entero2tube、MIDI、Sensititte、Autosceptor、Crystal等鉴定系统。

数值分类法是近20年来发展起来的细菌分类理论,它应用大量已知菌对相关生化试验反应出现的频率得出数据进行分析,优化组合数10项生理生化指标集合成套试剂,根据相似系数大小判断细菌种属间的亲源性。

自动化微生物鉴定系统即采用数值分类原理。

微生物数值分类鉴定集数学、电子、信息及自动分析技术于一体,具有系统化、标准化、微量化和简易化等优点,采用商品化的鉴定测试卡,将未知菌鉴定到属、种、亚种或生物型,可不同来源的临床标本进行针对性鉴定,所得结果以数字方式表达,与数据库数据（手册或软件）对比得出鉴定结果。

1.1.3　化学分类鉴定法

20世纪50年代中期由Cummins和Harris建立起来的化学分类鉴定法[3]主要通过细菌细胞壁化学成分即氨基酸和糖的分析进行分类鉴定,属的分类主要测定各种氨基酸组分,种的鉴定主要是对糖的分析。

另外,还有全细胞水解液糖型分析、脂肪酸分析、磷酸类脂成分分析、枝菌酸分析、醌类分析和光合色素成分分析等,常使用红外光谱、气相色谱、高效液相色谱和质谱等新技术。

1.1.4　分子遗传学分类鉴定法

分子遗传学分类法是以微生物的遗传型（基因型）特征为依据，判断微生物间的亲缘关系，排列出一个个的分类群。

目前较常使用的方法有：

细菌染色体DNAG+Cmol%含量测定、核酸杂交技术、　限制性核酸内切酶分析法、质粒图谱分析法、脉冲场凝胶电泳分析法、　PCR技术、　16SrRNA序列和16S～23SrRNA间区序列分析法、微生物全基因组测序

1.2细菌分类鉴定方法的前景

每种鉴定方法均有其优点和缺陷,常规鉴定法常出现表型表达不稳定、敏感性不高、测试项目多、费时费力等问题;

免疫诊断技术若无相应抗体则无法鉴定;

细菌自动化鉴定适于快速鉴定,但目前数据库中模式菌种数量有限,部分细菌只能鉴定至属,对革兰氏阳性菌和厌氧菌的鉴定效果较差;

分子遗传学鉴定是从本质上阐明细菌间的亲源关系,但所需试剂和仪器昂贵,鉴定时间较长,专业性强,适于科研上的细菌分类研究,不适于基层和临床微生物的快速鉴定。

因此,细菌分类鉴定必须同时使用几种方法或系统全面鉴定,表型鉴定和分子遗传学鉴定结合可对未知菌进行准确合理定位,目前应充分利用和完善现有鉴定技术,继续积累核酸数据库资源,研究和推广新的分子遗传学鉴定法,使其在敏感性、特异性和实用性上更适合细菌快速准确鉴定的需要,使其发挥应有的和更大的作用。

随着细菌鉴定方法的不断建立和完善,将为科研和临床工作者提供简便、快速、准确、微量、灵敏和成本低廉的检测方法和更先进、更全面的检测手段。

细菌的鉴定方法的介绍与总结

1、细菌常规鉴定方法

1.1免疫诊断技术

1.1.1凝集试验

目前常用的是葡萄球菌协同凝集试验（SPA-CoA）,金黄色葡萄球菌细胞壁的A蛋白（SPA）能与动物血清中IgG的Fc结合,成为致敏的颗粒载体,特异性IgG的Fc与SPA结合后,F（ab’）2段暴露在葡萄球菌表面,与相应细菌反应呈现凝集现象,此法用于细菌快速鉴定和分型。

1.1.2免疫酶技术

免疫酶技术（EIA,Enzymeimmunoa2ssay）是将酶标记的抗抗体与抗原—抗体复合物结合形成抗原-抗体-酶标记抗抗体复合物,加入酶底物产生有色产物。

以酶联免疫吸附测定（ELISA）和斑点酶联免疫吸附技术（Dot-ELISA）应用较广泛。

1.1.3免疫荧光技术

免疫荧光技术（FIA,Fuorescenceimmunoassay）是将一抗滴加于待检抗原上,再加一抗的荧光抗体（二抗）,呈现特异性的荧光抗原抗体复合物以鉴定病原菌。

此法比ELISA更直观,可直接观察到菌体形态。

1.1.4放射免疫测定技术

放射免疫测定（RIA,Rad2ioimmunoassay）是用放射性同位素标记抗原或抗体,与相应的抗体或抗原结合后通过放射自显影定性和定量抗原或抗体。

1.1.5免疫胶体金标记技术

胶体金是继酶、荧光素和放射同位素后免疫标记技术中令人瞩目的新标记物。

胶体金是氯金酸（HAuCl4）在还原剂如白磷、枸橼酸钠等的作用下,聚合成特定大小的金颗粒,通过静电作用与抗体或抗原形成一种稳定的胶体状态,即为免疫金,免疫金与相应的抗原抗体结合后,呈现特定的颜色反应。

1.2　蛋白质图谱分析

蛋白质图谱分析主要采用聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE,PolyacrylamideGelElectrophoresis）和SDS-PAGE。

聚丙烯酰胺凝胶是单体丙烯酰胺（Acr）和

N,N’-亚甲双丙烯酰胺（Bis）在催化剂过硫酸铵和加速剂四甲基乙二胺（TEMED）作用下聚合为含酰胺基侧链的脂肪族长链,相邻长链通过甲叉桥连接形成三维网状结构物质,PAGE根据电荷、形状和分子大小分离和定性、定量分析蛋白质和多肽。

SDS-PAGE根据分子量的不同分离蛋白质,SDS是一种阴离子表面活性剂,与蛋白质疏水部分结合使蛋白质带大量负电荷且使蛋白质的形状趋向一致,抵消了蛋白质本身所带电荷和形状的影响,因此,样品分子量的对数与其在凝胶中的迁移率呈直线关系。

2、细菌的数值分类和自动化鉴定

法国生物-梅里埃（Bio-Merieux）公司的Vitek-AMS系统是应用最普遍的细菌自动化鉴定系统之一,品种齐全,鉴定范围广,可鉴定18000多种细菌。

它的系列主要有Vitek30、Vitek60、Vitek120及半自动鉴定仪ATBexpression[4]全自动鉴定是从接种、培养、读数到报告的全过程自动完成,利用负压将菌液加入测试卡各孔,封口机封口,置孵箱孵育,阅读器以665nm波长每小时将测试卡拉出1次对各孔底物进行光扫描,动态观察其变化,计算机将判读结果与标准数据库比较得出鉴定结果。

ATBexpression细菌鉴定系统包括ATB光电比浊仪、ATB接种器、ATB阅读器、ID32E测试卡、计算机与打印机6部分,用于肠杆菌科及其他革兰氏阴性菌的鉴定。

此系统配制菌液和接种测试卡由人工完成,结果由阅读器和计算机模式株数据库判读,测试卡的32项生化试验形成11位数的生物编码,与标准数据库比较得出细菌的鉴定概率%id和模式频率T值。

该系统可在4～24h鉴定600多种细菌,操作简便、结果准确,适用于医院及科研单位。

“Biolog”细菌鉴定系统[5]由不同氧化还原指示剂和发酵性碳源的培养基干粉组成96孔细菌培养板。

将待检菌的新鲜纯培养物配制成适当浓度的菌悬液,由多头接种器快速完成96孔接种,37℃培养4～24h,置检察室的分光光度计中检测,计算机自动分析该菌的“指纹图谱”得出鉴定结果。

此系统适用于动植物检疫,医学临床检验及食品、饮水卫生的监控等。

MicroScan细菌鉴定系统包括全自动系列Walkway40、Walkway96和半自动系列AutoScan-4。

全自动Walkway系列采用RENOK真空接种器接种菌悬液,一次完成96孔接种,自动孵育、自动判读结果。

此系统可鉴定近500种细菌,为临床诊断和院内感染控制提供了良好途径。

3、化学分类鉴定法

3.1磷脂脂肪酸分析技术（PLFA）[6]

磷脂脂肪酸（Phospholipidfattyacid,PLFA）分析技术是基于不同物种PLFA的不同而进行的分析技术。

PLFAs的提取,鉴定和定量分析可以提供水环境中总的生物群体的有关信息。

群体中生物的大体代谢地位和此群体的应力也可以表现出来。

对样品中磷脂脂肪酸的常规分析可以与放射标记的特定菌种结合起来应用，再对放射性的PLFAs进行分析。

此技术提取了微生物放射性标记的指纹图谱。

它可用于研究生物群落中代谢选择的自然生物和非生命物质的混合物。

目前PLFA技术还不能很好地对微生物群落进行准确分类，因为一些微生物也可能含有差别不大的PLFA，这成为应用此技术的一大障碍。

3．2高效液相色谱（HPLC）[7]

应用于放线菌的分子鉴定和细胞化学成分分析可直接测定菌株DNA的碱基组成和甲基萘醌型,为菌种的分类鉴定提供有利的证据。

3.3气相色谱（GC）[7]

应用于放线菌的鉴定，可直接测定菌株主要脂肪酸的组成及含量，该分析是化学鉴定中重要的指标之一。

4、分子遗传学分类鉴定法

4.1　细菌染色体DNAG+Cmol%含量测定

细菌染色体DNAG+Cmol%含量测定对表型相似的疑难菌株鉴定、新的分类单位建立和细菌亲源关系判定等是一项重要的分类鉴定指标和参考标准,包括纸层析法、浮力密度法、高效液相色谱法[8]、热变性温度（Tm）[9]法和荧光法等。

4.2　核酸杂交技术　

核酸杂交技术[10,11]根据碱基互补配对原理,将2条不同来源的单链核酸进行复性以鉴定菌株间的亲源关系,用于DNA-DNA（Southern杂交）、DNA-RNA、RNA-RNA（Northern杂交）和PNA-DNA杂交（PNA为肽核酸）。

DNA-DNA杂交适用于种水平的研究,而DNA-rRNA杂交用于属和属以上水平的分类研究。

核酸杂交目前常采用固相杂交法,将待测菌株双链核酸解成单链固定在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上,置入含有经同位素标记、酶切并解链的参照菌株的单链核酸（探针）液中复性,形成新的双链核酸,测定杂合双链的相对放射性强度来确定菌株间的同源性程度。

一般认为核酸杂交同源性小于20%为不同菌属,20%～60%为属内紧密相关的种,60%～70%为同种内不同亚种,大于70%为同一亚种。

另外,对线粒体DNA（mtDNA）进行杂交分析将对种内和种间的分类更加灵敏。

4.3　限制性核酸内切酶分析法

限制性核酸内切酶分析法（REA,RestrictionEnzymeAnalysis）是用限制性内切酶消化不同细菌染色体DNA产生不同长度限制性片段的酶切图谱,将图谱与已知菌进行比较鉴定细菌。

4.4　质粒图谱分析法　

质粒是独立于细菌染色体之外进行复制的辅助性遗传单位,不是细菌生长繁殖所必需的,但质粒可使宿主菌具有某些非染色体决定的生物学性状如耐药性、溶血性、细菌毒力等。

质粒图谱分析（PP分析,PlasmidProfileAnalysis）是通过比较电泳图谱上质粒DNA数目和分子量分析细菌,该法特异性好、分析周期短、稳定可靠,几乎适用于所有细菌的分型,特别适用于尚未建立标准分型方法和缺乏血清型的菌属（种）的鉴定和分型。

4.5　脉冲场凝胶电泳分析法

脉冲场凝胶电泳分析法[12]（PFGE,Pulsed-fieldGelElectrophoresis）采用定时改变电场方向的交变电源,每次电流方向改变后持续1～5s再改变电流方向,如此反复循环。

PFGE运用罕见切点的内切酶切割染色体DNA,产生10～800kb长的5～20条大的DNA片段。

PFGE是目前分辨力最高的分型方法之一,但技术要求高。

4.6　PCR技术　

PCR技术是在模板、引物和4种脱氧核苷酸存在的条件下依赖DNA聚合酶的酶促反应,包括高温变性、低温复性和中温延伸3个阶段,经25～30个循环,原始模板可扩增106以上。

PCR技术具有高度的特异性和敏感性,是临床微生物检验的理想工具,用于细菌和病毒感染的早期诊断、遗传性疾病的诊断、肿瘤基因分析和法医学诊断等,现已衍生出多种PCR技术,如:

锚定PCR、反向PCR、多重PCR、原位PCR、不对称PCR、重复序列PCR、巢式PCR、反转录PCR、差异显示PCR、免疫PCR、PCR-ELISA、随机扩增DNA多态性分析（RAPD）和扩增片段长度多态性（AFLP）等。

RAPD又称为随机引物PCR法（AP-PCR）,可用于未知菌株的快速鉴定和流行病学调查,细菌种间、亚种间乃至株间的亲缘关系分析。

AFLP技术1995年由Vos等首次报道,用于各种大小的基因组指纹分析,为研究物种间尤其是原核生物属以下及株间的亲缘关系提供有效手段。

4.7　16SrRNA序列和16S～23SrRNA间区序列分析法　

rRNA是研究细菌进化和亲源关系的重要指标,含量大（约占细菌RNA总量80%）,素有“细菌化石”之称,是细菌系统分类学最有用和常用的分子钟。

原核生物的5SrRNA、16SrRNA和23SrRNA位于同一操纵子上,其中16SrRNA为细胞所共有,分子大小适合操作,其功能同源且最为古老,既含保守序列又含可变序列。

保守性反映生物物种的亲源关系,为系统发育提供线索;

高变性则揭示生物物种的特征核酸序列,是种属鉴定的分子基础,其序列变化与进化距离相对应,在细菌种属分类鉴定中广泛应用。

16SrRNA[13]序列分析是一种非培养分析技术,能快速鉴定目前尚不能人工培养的微生物。

若两菌的16SrRNA同源性大于99%,且染色体DNA杂交率大于70%,基因水平上为同一种细菌。

16S～23SrRNA间区[14]（ISR,IntergenicSpacerRegion）近几年来在细菌分类鉴定中倍受关注,已成为新热点。

16S～23SrRNA的ISR序列作为16SrRNA序列系统分类的一个有力补充,可根据细菌间ISR的数目、长度、种类和序列的不同进行分类。

16S～23SrRNA的ISR序列作为细菌分类新的目标基因具有属、种、型、株的特异性与灵敏性,ISR作为细菌分类鉴定的研究热点,将具有无可比拟的优越性,为细菌系统发育学带来新的飞跃。

4.8微生物全基因组测序　

微生物全基因组测序[15]是当前国际生命科学领域中掌握微生物全部遗传信息的最佳途径。

1990年10月1日人类基因组计划（HGP,HumanGenomeProject）的正式启动极大地推动了微生物基因组学和微生物蛋白质组学的飞速发展,1995年7月首次报道了流感嗜血杆菌的全基因组序列（1.8Mb）,至今已正式公布的微生物基因组序列有53种,正在进行的至少有100余种,由此迎来了“后基因组生物学时代”。

5、结束语

每种鉴定方法都有各自的适用范围及优缺点，我们应充分利用和完善现有鉴定技术,继续积累核酸数据库资源,研究和推广新的分子遗传学鉴定法,使其在敏感性、特异性和实用性上更适合细菌快速准确鉴定的需要,使其发挥应有的和更大的作用。

6、参考文献

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