1株黑鲷致病性假交替单胞菌的鉴定及毒力基因分析Word文档格式.docx

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D2013-5-2）。

　　作者简介：

乔毅（1987―），男，硕士研究生，主要从事水产养殖病害防治技术研究。

E-mail：

qiaoyishou@。

　　通信作者：

万夕和，研究员，主要从事水产养殖病害防治技术研究。

wxh1708@。

　　假交替单胞菌属是1995年Gauthier等根据细菌16SrRNA序列发现有别于假单胞菌（Pseudomonas）和交替单胞菌（Alteromonas）的一个新属[1]，目前已经发现30多个种。

该菌广泛分布于海洋沉积物以及共附生在一些海洋动植物中。

假交替单胞菌能产生胞外毒素、胞外多糖、胞外酶以及病毒活性物质等与致病相关的多种物质[2]，是一类条件致病菌。

研究表明，假交替单胞菌可感染海水养殖藻类和养殖动物等，引起藻类溶藻、绿斑、黄斑[3-5]等，养殖动物皮肤溃烂[6]等疾病。

黑鲷（Acanthopagrusschlegel）属于鲈形目鲈亚目鲷科鱼类，主要分布在西太平洋区，在我国沿海均有分布，是海水鱼养殖主要品种之一。

近年来，江苏沿海地区黑鲷在养殖过程中经常发生皮肤溃烂，并出现不同程度的死亡，给黑鲷养殖产业带来严重威胁。

2012年4月，江苏省海水增养殖技术及种苗中心人工养殖黑鲷过程中发生皮肤溃烂，并出现一定规模的死亡。

本试验从患病鱼体分离到1株优势菌LSHD-1，对该菌进行了鉴定和毒力基因的研究，并进行了药物敏感性试验。

　　1材料与方法

　　1.1材料

　　试菌株LSHD-1，分离自江苏省海水增养殖技术及种苗中心的池塘养殖患皮肤溃烂病黑鲷，该菌株已通过回复感染证实为该病的病原菌。

　　2216E培养基、细菌微量生化鉴定管、水解酪蛋白琼脂（MH琼脂）、质控菌（大肠杆菌ATCC25922）及药敏试纸购自杭州天和微生物试剂有限公司;

PremixTaq酶、DNAmarker购自TaKaRa公司;

引物（16SrRNA，毒力基因）由生工生物工程（上海）股份有限公司合成;

其他试剂均为分析纯。

　　1.2方法

　　1.2.1形态结构观察用接种环挑取少量细菌在载玻片上涂片固定，革兰氏染色，油镜观察形态。

挑取单菌落细菌用海水制成菌悬液，吸取1滴置于铜网膜上，通过醋酸铀染色，日立H-300型透射电子显微镜观察。

　　1.2.2生理生化试验参照《常见细菌系统鉴定手册》和《BergeysManualofDeterminativeBacteriology》进行生理生化试验。

　　1.2.3细菌16SrRNA基因扩增挑取单菌落于装有100μL灭菌去离子水的1.5mLEP管中，煮沸10min，4℃10000r/min离心5min，上清即为聚合酶链反应（polymerasechainreaction，PCR）模板DNA，-20℃保存备用。

采用通用引物扩增16SrRNA基因序列与测序，正向引物27F（5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′），反向引物1492R（5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′）。

25μL反应体系：

12.5μLPremixTaq酶，正、反向引物各1μL，模板DNA1μL，ddH2O补足25μL。

反应条件：

94℃5min;

94℃30s，54℃30s，72℃1.5min，35个循环;

72℃10min。

PCR产物经1%琼脂糖电泳（120V，35min）检测目的片段（约1500bp）后，送生工生物工程（上海）股份有限公司测序。

　　1.2.4系统发育分析利用NationalCenterforBiotechnologyInformation（NCBI）数据库中blast对LSHD-1细菌16SrRNA序列进行相似性比较。

使用ClustalX2.0软件与从GenBank数据库中获得序列相似性较高的序列进行多序列比对，通过MEGA4（molecularevolutionarygeneticsanalysis，MEGA）软件采用邻接建树法构建系统发育树，并通过Bootstrap法（1000次）检验。

　　1.2.5毒力基因检测通过PCR对LSHD-1菌黏附侵袭位点基因（ail）、耐热肠毒素基因（ystB）、黏附素基因（yadA）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌体整合酶基因（intB）、气溶素基因（aerA）、溶血素基因（hlyA）、丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）、肠毒素基因（altA）以及抗金属蛋白酶基因（ast）进行扩增。

扩增条件：

ail、ystB、yadA、virF、intB按照94℃预变性4min;

94℃变性45s、退火45s（退火温度见表1），72℃延伸40s，35个循环;

72℃终延伸5min。

aerA、hlyA、ahpA、altA、ast基因94℃预变性5min;

94℃变性30s、退火30s（退火温度见表1），72℃延伸30s，35个循环;

72℃终延伸10min。

PCR产物经1%琼脂糖电泳检测结果。

　　表1检测的毒力基因引物序列及反应条件

　　基因名称引物序列（5′→3′）长度

　　（bp）退火温度

　　（℃）

　　Ail[7]F：

TAATGTGTACGCTGCGAG;

R：

GACGTCTTACTTGCACTG;

35150

　　ystB[7]F：

CTTCAGATACTGGTGTCGCTGT;

ATGCCTGACTAGAGCGATATCC20056

　　yadA[7]F：

GGCAGAACAGCAGTCAGACATA;

GGTGAGCATAGAGAATACGTCG80056

　　virF[7]F：

GTACATTAGGCCAAGAGACG;

GCAACATACCTCACAACACC56145

　　intB[7]F：

TGCGCCATGCGGTCCATC;

GGTGCATAAGATTCTCGG71450

　　aerA[8]F：

CAAGAACAAGTTCAAGTGGCCA;

ACGAAGGTGTGGTTCCAGT30957

　　hlyA[9]F：

TGACAGGCAAGTAGAATAACGC;

TGTCCGCTTTCCACTCCC181553

　　ahpA[10]F：

GTTAGGCGTTGGCAATCTCG;

CGCTGGAGTAGGAGGAACG87460

　　altA[11]F：

ATCGTCAGCGACAGCTTCTT;

CTCATCCCTTGGCTTGTTGT44258

　　ast[12]F：

TGACCCAGTCCTGGCACGGC;

GCTGATCGATCACCACCAGC50457

　　1.2.6药物敏感性试验选择磺胺异唑、强力霉素、氧氟沙星、青霉素G、恩诺沙星、新霉素、头孢曲松、四环素、红霉素、诺氟沙星、氟苯尼考药敏试纸片对LSHD-1进行敏感性试验，采用世界卫生组织推荐的K-B纸片琼脂扩散法进行，结果按敏感（S）、中敏（I）、耐药（R）报告[13]。

　　2结果与分析

　　2.1细菌形态学特征

　　LSHD-1菌落在2216E琼脂平板上为浅黄色，凸透镜状，表面光滑湿润有光泽，边缘完整，不透明，圆形。

革兰氏染色阴性，呈短杆状（图1）。

负染后电镜观察，菌体呈短杆状，极端单鞭毛（图2）。

　　2.2生理生化特征

　　LSHD-1菌氧化酶试验阳性，L-鸟氨酸、L-精氨酸、L-赖氨酸和L-色氨酸反应阴性（表2），结合伯杰氏手册，该生理生化结果与假交替单胞菌基本符合。

　　2.3分子生物学鉴定及系统发育学分析

　　PCR扩增LSHD-1菌16SrRNA基因获得1条清晰的条

　　表2LSHD-1生理生化试验

　　反应（酶）结果反应（酶）结果

　　鸟氨酸脱羧酶-吲哚（产生）-

　　精氨酸双水解酶-N-乙酰-β-葡萄糖苷酶+

　　赖氨酸脱羧酶-β-半乳糖苷酶-

　　脲酶-葡萄糖（产酸）-

　　L-阿拉伯糖醇（产酸）-蔗糖（产酸）-

　　半乳糖羧盐（产酸）-L-阿拉伯糖（产酸）-

　　5酮基-葡萄糖酸（产酸）-D-阿拉伯醇（产酸）-

　　肢酶-α-葡萄糖苷酶+

　　酚红（产酸）-α-半乳糖苷酶-

　　β-葡萄糖苷酶+海藻糖（产酸）-

　　甘露醇（产酸）-鼠李糖（产酸）-

　　麦芽糖（产酸）-肌醇（产酸）-

　　侧金盏花醇（产酸）-纤维二糖（产酸）-

　　帕拉金糖（产酸）-山梨醇（产酸）-

　　β-葡萄糖酸苷酶-麦芽糖苷酶-

　　丙二酸-L-天冬氨酸芳胺酶+

　　带，经测序后发现为1438个碱基的基因片段，将该序列在NCBI数据库进行blast分析对比，发现LSHD-1与假交替单胞菌杀鱼亚种的同源性最近，达99%。

将测得序列与GenBank中已登录的16SrRNA序列进行匹配排列，构建系统进化树，结果LSHD-1与假交替单胞菌杀鱼亚种聚为1支（图3）。

　　2.4毒力基因检测结果

　　PCR扩增LSHD-1细菌毒力基因，经电泳检测发现：

altA、ail、intB、ahpA、ast、virF、hlyA基因（图4、图5）出现相应大小的条带，其中丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）条带最为清晰，altA、intB、virF条带比较清晰，ail、ast、hlyA条带相对较弱。

　　2.5药物敏感性试验

　　药敏试验结果表明，LSHD-1菌对氧氟沙星、恩诺沙星、头孢曲松、诺氟沙星、氟苯尼考敏感;

对磺胺异唑、强力霉素、青霉素G、四环素表现出耐药;

磺胺异唑和青霉素G对LSHD-1菌的抑菌效果较差（表3）。

　　3讨论

　　假交替单胞菌是海洋中常见的细菌，随着海水养殖业的发展，假交替单胞菌受到广泛的关注和研究。

目前，日本有关

　　于假交替单胞菌引起海带（Laminaria）孢子体红点病[14]和孔烂症[15]的报道，我国也有假交替单胞菌引起条斑紫菜（Porphyraeyezoensis）绿斑病[4]和黄斑病[5]的报道;

Pujalte等从患病的海鲈体内分离到1株Pseudoalteromonasundina，试验发现其毒性较弱，但是在养殖环境恶化时引起金头鲷和海鲈患病[16];

国内大量研究表明，假交替单胞菌可引起刺参（Apostichopusjaponicus）腐皮病[17-19]、溃疡病[20]等;

乔迁等报道假交替单胞菌引起七带石斑鱼（Epinephelusseptemfasciatus）皮肤溃烂[21];

白雪松等从群体死亡日本对虾（Penaeusjaponicus）蚤状幼体中分离到1株致病菌，经鉴定为Pseudoalteromonaslipolytica[22]。

本试验从患病黑鲷病灶处分离到1株优势菌LSHD-1，革兰氏染色和透射电镜观察结果与假交替单胞菌　　表3LSHD-1药物敏感性试验结果

　　药敏试纸

　　名称药物含量

　　（μg/片）

　　抑菌圈大小（mm）

　　ATCC25922LSHD-1

　　敏感性

　　磺胺异唑30024.60R

　　强力霉素3018.48.0R

　　氧氟沙星531.523.4S

　　青霉素G1015.70R

　　恩诺沙星1538.026.6S

　　新霉素3023.516.7I

　　头孢曲松3034.027.9S

　　四环素3021.513.5R

　　红霉素1535.615.8I

　　诺氟沙星1024.318.7S

　　氟苯尼考3034.622.4S

　　的特征基本一致;

根据生理生化表型特征，LSHD-1菌与假交替单胞菌相似度最高;

另外，LSHD-1细菌的16SrRNA基因序列在NCBI数据库中通过blast同源性检索，基因序列与假交替单胞菌杀鱼亚种的同源性最高，达到99%，从基因系统发育树来看，LSHD-1与假交替单胞菌杀鱼亚种聚为1支。

综合LSHD-1的形态学特征、生理生化和分子生物学鉴定结果，认为LSHD-1为假交替单胞菌杀鱼亚种。

　　黑鲷在养殖过程中，相关报道过有拟态弧菌（Vibriomimicus）引起的幼鱼腹水病[23]、哈维氏弧菌（Vibrioharveyi）[24]与迟缓爱德华氏菌（Edwardsiellatarda）[25]引起的大规模死亡。

假交替单胞菌杀鱼亚种感染黑鲷的研究未见报道，毒力人工回感试验结果表明，该株菌为引起黑鲷尾鳍基部溃烂病的病原菌;

通过扩增LSHD-1菌的毒力基因，结果检测到黏附侵袭位点基因（ail）、毒力活化因子（virF）、P4噬菌体整合酶基因（intB）、溶血素基因（hlyA）、丝氨酸蛋白酶基因（ahpA）、肠毒素基因（altA）、抗金属蛋白酶基因（ast）。

ail基因能够编码对宿主产生高度黏附并保护细菌不被宿主免疫系统杀灭的小分子黏附蛋白[26]，目前，ail基因在小肠耶尔森氏菌中研究较多[7，27-28]，有学者甚至认为，可将ail基因作为小肠耶尔森氏菌致病性指示基因[29];

ahpA基因是细菌重要的致病基因之一，其主要在病原入侵过程中通过活化毒力因子间接发挥作用[30]，张璐等利用缺失突变法构建迟缓爱德华氏菌ahpA基因突变菌株，通过与野生菌株的侵染试验的比较，认为ahpA基因对迟缓爱德华氏菌前期侵染宿主有关[31]，朱大玲等研究表明，ahpA基因阳性的嗜水气单胞菌（Aeromonashydrophila）为有毒菌[32];

hlyA基因是多数致病细菌的常见基因，关于其在致病过程中所起的作用，付乔芳等认为，hlyA基因与嗜水气单胞菌的致病力关系不大[33]，但黄钧等发现携带hlyA基因的气单胞菌致病力增强[34];

virF基因是编码毒力基因的调控因子[35]，在细菌致病性中起着重要作用，altA、ast基因在已有报道中证实与致病性关系不大[33]。

本试验还扩增到intB基因，与苟小兰等的试验结果[7]一致，说明LSHD-1染色体上存在高致病性毒力岛。

综上可以推断，本试验分离的致病性杀鱼假交替单胞菌的致病力可能主要由ail、ahpA、virF、intB基因决定。

毒力基因的量、毒力基因的表达机理以及毒力基因间的相互作用与致病性的关系非常复杂，引起黑鲷的致病机制尚需进一步研究。

　　LSHD-1药物敏感性试验结果与乔迁等的研究结论[21-22]基本一致，氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、头孢曲松、氟苯尼考对LSHD-1有较好的抑菌效果;

该菌对磺胺异唑、强力霉素、青霉素G、四环素表现出较强耐药性。

但是总体药物敏感性比淡水菌敏感，这可能是因为海水养殖抗菌药物使用的频率不高，细菌在没有抗菌素环境压力下保持了较高的药物敏感性。

该菌的药物敏感性试验结果可为防治该菌引起的水生动物疾病提供借鉴和参考。

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