杨梅素脂质体的体外释放及体内吸收实验研究Word格式.docx

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同时采用大鼠在体肠灌流法对杨梅素原料药及杨梅素脂质体的吸收动力学进行研究，通过测量灌流前后肠腔内药物浓度的变化来考察药物的小肠吸收状况，为研制杨梅素脂质体口服制剂提供制剂学基础.

1　材料与方法

1.1　材　料

杨梅素（质量分数为98.1%），浙江省宁波市中药制药有限公司；

大豆卵磷脂（质量分数为70%），江苏曼氏生物科技有限公司；

十二烷基硫酸钠（SDS），国药集团化学试剂有限公司；

酚红，上海试剂三厂；

SD大鼠，体重（200±

20）g，雄老鼠，浙江省医学科学院动物中心提供；

其他试剂均为分析纯.

1.2　仪器与设备

752型紫外可见光度计，上海光谱仪器有限公司；

SP-2500双光束紫外分光光度计，苏州市莱顿科学仪器有限公司.

1.3　杨梅素脂质体制备

精密称取20mg杨梅素、质量分数为70%的大豆卵磷脂和载体材料于梨形烧瓶中，单硬脂酸甘油酯为载体，m（质量分数为70%的卵磷脂）∶m（载体）=1∶1，加入10mL无水乙醇使三者充分溶解,置于旋转蒸发器中，0.085MPa真空度65℃下减压回收乙醇成膜，然后加入60mL质量分数为0.06%的吐温40水溶液，使膜溶解分散并且充分水合，800W超声10min，最终形成杨梅素脂质体.用激光粒径分析仪测得杨梅素脂质体平均粒径为（145.1±

33.4）nm（多分散系数为0.281），zeta电位为-36.62mV.

2　实验方法

2.1　体外释放度实验

2.1.1　杨梅素体外释放含量测定方法

杨梅素的结构式为

采用分光光度法测定杨梅素含量.通过杨梅素全波段扫描，确定357nm为吸收波长，称取杨梅素无水乙醇溶解定容，配置成一系列标准溶液，在357nm波长下检测吸光度，绘制标准曲线，得到回归方程：

A=0.051C+0.0059（R2=0.9995），在2～14μg/mL范围内，线性相关性良好.

2.1.2　体外释放度的测定方法

取适量的杨梅素脂质体及等剂量的杨梅素原料药，分别装于透析袋中，将透析袋两头扎紧，置于质量分数为0.5%的SDS介质溶液中（通过一系列浓度的SDS溶液的筛选，质量分数为0.5%的SDS溶液可满足体外释放及漏槽条件），按照50r/mim，（37±

2）℃水浴恒温，定时取样，同时加入等量的空白释放介质，则杨梅素累积释药百分率计算式为

杨梅素累积释放量：

Qn=Cn×

V+∑Ci×

Vs

（1）

杨梅素累积释药百分率：

P=Qn/Q0×

100%

（2）

式中：

Cn为第n次取样点时的杨梅素浓度；

Ci第i次取样点时杨梅素浓度；

V为溶出介质体积；

Vs为每次的取样体积；

Q0为初始杨梅素的量.

用释放模型方程对药物0～96h的体外累计释放数据进行拟合,以此描述杨梅素脂质体制剂的体外释放规律.

2.2　大鼠在体肠吸收实验

2.2.1　肠循环液中杨梅素含量的测定方法

为了避免实验过程中小肠吸收和分泌的水分对药物浓度造成的影响，通过加入“标示物”来测定水分的变化进行校正[26]，同时采用双波长等吸收消除酚红对杨梅素紫外吸收的干扰[27].

取200mg/L酚红供试液、杨梅素脂质体溶液、含酚红的杨梅素脂质体溶液以及在大鼠体内肠循环2h的K氏营养液，于200～600nm紫外扫描.结果表明酚红、辅料和肠循环液分别在杨梅素596，357nm特征吸收峰处对其没有干扰.故选择357nm为检测波长，596nm为参比波长，△A=A357-A596为定量信息测定杨梅素的含量.以△A对杨梅素质量浓度C进行线性回归，得标准曲线△A=0.0422C+0.1736（R2=0.9998），在0.5～14mg/L线性范围内相关性良好.

2.2.2　杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性

杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性直接影响实验的准确性，需要对其稳定性进行考察.取30mL杨梅素脂质体溶液，加入200mg/L酚红溶液和K氏营养液，用空白肠循环液定容至60mL，配置成供试液.37℃恒温水浴2h，分别在0，1，2h测定供试液中的杨梅素浓度.

2.2.3　肠壁物理吸附的影响

肠壁绒毛可能会因为吸附杨梅素和酚红对实验结果造成影响，需要测定肠壁物理吸附影响的大小.取大鼠小肠，清洗后置于60mL供试液中.在37℃的恒温振荡仪中2h，分别在0，1，2h测定供试液中杨梅素及酚红浓度.

2.2.4　大鼠在体肠灌流实验

取SD雄性大鼠，禁食不禁水12h，腹腔注射戊巴比妥钠溶液，麻醉后固定在手术台板上红外灯照射保持37℃体温.采用全肠段回流，沿腹中线剪开腹部约4cm，取出十二指肠上部至回肠下部肠段，两端切口后分别插管并结扎.用37℃生理盐水、K氏营养液依次冲洗肠道内容物后，将插管与恒流泵连接形成回路.以5mL/min流速将供试液在回路中循环10min再调至2.5mL/min，分别在0，15，30，45，60，90，120min时取1mL和0.5mL样各一份，同时补加1.5mL的37℃的K氏营养液，取样7次.实验装置见图1所示.

以小肠剩余药量的对数（lnX）对取样时间（t）做图得吸收曲线，从吸收曲线可得出速率常数（Ka）和相关系数（r），吸收半衰期（t1/2）和单位时间吸收率（P）计算式为

吸收半衰期:

t1/2=0.0639/Ka

（3）

单位时间吸收率:

P=（C0×

V0-Ct×

Vt）/（C0×

V0×

t）

（4）

Ka为吸收速率常数；

C0为灌注液中药物初始质量浓度；

Ct为t时刻灌注液中药物质量浓度；

V0为灌注液初始体积；

Vt为t时刻灌注液体积.

3　实验结果与讨论

3.1　体外释放度实验结果

在（37±

2）℃恒温，质量分数为0.5%的SDS释放介质中加入杨梅素脂质体，相同条件进行三组实验，以杨梅素原料药为对照，得到体外累积释放曲线，如图2所示.

由图2可知：

从12h开始杨梅素原料药和杨梅素脂质体的释放规律逐渐出现差异：

杨梅原料药释放速度加快，48h后累积释药百分率已达到100%；

杨梅素脂质体累积释药百分率平稳增加，96h后，药物释放量只达到30%.说明杨梅素制备成脂质体后药物呈缓慢持续释放.

分别按照零级动力学模型、一级动力学模型和Higuchi方程模型进行拟合，求出相关系数r、释放常数K及SD值.比较杨梅素原料与杨梅素脂质体的体外释放规律，结果如表1所示.

注:

1）代表零级动力学的释放常数；

2）代表Higuchi方程的Higuchi系数.

由表1可知：

杨梅素原料药遵循零级动力学规律释放；

杨梅素脂质体Higuchi方程模型拟合的相关系数r最大，遵循Higuchi规律释放，符合缓释制剂的释药要求.因此将杨梅素制备成杨梅素脂质体之后，减慢了药物的释放速度，延长了药物在体内的滞留时间，有利于提高药效.三组脂质体的平行实验SD值为1.9，说明实验结果稳定.

3.2　杨梅素脂质体在空白肠循环液中的稳定性结果

将杨梅素脂质体溶液在37℃恒温水浴放置2h，分别在0，1，2h时测定杨梅素浓度，实验结果表明，与0h相比，1h后杨梅素的质量分数降低1.3%，2h后杨梅素的质量分数降低3.8%，可能由于杨梅素自身降解导致.因此认为2h内杨梅素脂质体在空白肠循环液中较稳定，不会干扰肠灌流实验.

3.3　肠壁物理吸附的影响结果

大鼠小肠浸泡在37℃的60mL供试液中，分别在0，1，2h时测定杨梅素浓度，实验结果表明：

与0h相比，1h后杨梅素的质量分数降低0.9%，2h后杨梅素的质量分数降低3.0%，可能由于杨梅素自身降解导致，由此推测肠壁对杨梅素脂质体无物理吸附；

与0h相比，1h后酚红的质量分数不变，2h后酚红的质量分数仅微量减少0.3%，可认为无变化，故肠壁对酚红无物理吸附.综上所述，大鼠小肠壁对杨梅素和酚红均无物理吸附，不会影响二者含量的测定.

3.4　大鼠在体肠灌流实验结果

通过对大鼠小肠剩余药量的测定，得到杨梅素脂质体与杨梅素原料胶束溶液在大鼠小肠2h吸收曲线，如图3所示.

由图3可知：

杨梅素脂质体的透过速率方程为lnX=7.5384-0.0034t，杨梅素原料的透过速率方程为lnX=7.5767-0.0009t，与表观一级速度方程lnX-lnX0-Kat线性吻合，因此杨梅素的吸收为被动转运，依靠生物膜两侧的药物浓度梯度被吸收，不需要载体和能量.由吸收曲线得到吸收速率常数Ka、相关系数r、吸收半衰期t1/2以及单位时间吸收率P，见表2.

Table2　TheresultsofMyricetinmicrocapsulesandmyricetinwithinmicellarinintestineabsorption

实验结果显示：

与杨梅素原料药相比，杨梅素脂质体在小肠吸收速率常数Ka和吸收率P均显著提高，说明经脂质体化杨梅素更容易被在体吸收；

计算得到的杨梅素脂质体吸收半衰期明显少于杨梅素原料药，可以预测经脂质体化的杨梅素在体内消除速率加快.

4　结　论

本实验以实验室制备的杨梅素脂质体为研究对象，考察其体外释放规律和体内吸收状况.实验结果表明：

杨梅素脂质体遵循Higuchi规律缓慢持续释放，延长了药物在体内的滞留时间，有利于提高药效；

杨梅素在体内的吸收为被动转运，与杨梅素原料药相比，脂质体化的杨梅素在体内吸收速度和消除速度均明显增大.说明经脂质体化的杨梅素更容易被吸收，有利于提高药效.本实验为今后制造口服杨梅素脂质体提供了制剂理论基础.

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（责任编辑：

陈石平）