螺旋藻遗传育种研究进展Word下载.docx

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下面就螺

旋藻的分类和生态、化学组成和功能、生物活性物质、遗传育种、应用潜力和前景等几方

面来研究开发进展做一综述。

1螺旋藻的分类和生态

1.1螺旋藻的分类

螺旋藻是蓝藻门（Cyanophyta），蓝藻纲（Cyanophyceae），颤藻目（Oscillatoriales），颤藻科（Oscillatoriaceae）的一个属，是一类丝状、多细胞、不分枝、无异型胞、缠绕成螺旋状的蓝藻。

它生长于水体中，在显微镜下可见其形态为螺旋丝状，故而得名。

螺旋藻种类主要有极大螺旋藻、钝顶螺旋藻、盐泽螺旋藻三大类。

钝顶螺旋藻和极大螺旋藻两个品种是螺旋藻中最优良的品种。

极大螺旋藻和钝顶螺旋藻的区别，极大螺旋藻藻丝更长，螺距更宽。

但从营养成分来说，钝顶螺旋藻的营养成分更高和更易于吸收，所以国际上食用的螺旋藻都是钝顶螺旋藻。

1.2螺旋藻的生态条件　

钝顶螺旋藻原生长在碱性水中，可以被驯化培养在正常的海水中。

它最适温度范围在30～37℃之间，最适光照强度约在30000～35000勒克斯之间，最适酸碱度范围约在pH8.6～9.5之间[4]。

世界天然能够自然生长螺旋藻的三大湖泊，非洲的乍得湖（TchadLake）、墨西哥的特斯科科湖（TexcocoLake）、中国云南丽江的程海湖。

经过多年宣传，现在知名度很高，但实际仅剩程海湖还在保持生产，另两个湖几乎干涸。

2螺旋藻的化学组成和功能

2.1螺旋藻的化学组成

在自然界中，螺旋藻是迄今为止发现的营养最丰富、最全面的绿色天然食品，螺旋藻含有丰富的氨基酸，维生素，矿物质等人体需要的营养成分，因具有广泛而高效的药用价值[5]。

2.1.1蛋白质

螺旋藻含蛋白质为58.5%～83.4%，且氨基酸组成比例恰当，其中8种人体必需氨基酸含量接近或超过联合国粮食及农业组织（FAO）推荐的组成比例标准，螺旋藻的蛋白消化率达75.0%，生物利用率达68.0%，所以，它被认为是目前人类已知的蛋白质含量最高、质量最好的食品[6]。

2.1.2脂肪

螺旋藻属于低脂食品，脂肪含量为6%～9%，其脂肪酸多以不饱和脂肪酸为主，含量为4.9%～5.7%（表1），尤其是必需脂肪酸的含量较高，而且具有多种保健功能的γ-2亚麻酸含量高达8.75～11.97g/kg，而且脂肪中不含有胆固醇。

表1螺旋藻的脂肪含量及脂肪酸组成

Table1ThecompositionoffatandfattyacidinSpirulina

脂肪名称

含量/（mg.kg）

月桂酸

180~229

肉桂酸

520~664

棕榈酸

16500~21141

硬脂酸

微量~353

甘油软脂酸

1490~2035

十七碳二烯酸

90~142

2.1.3维生素

由于螺旋藻细胞分裂活跃，生长迅速，代谢旺盛，因而与生长发育直接相关的各种维生素（B1，B2，B12，E）含量也很丰富，尤其是β-胡萝卜素、维生素E和B12含量较高，每100g中维生素含量分别高达150～170mg，5～20mg，0.05～0.2mg。

β-胡萝卜素是所有食物之冠，比胡萝卜的含量还要高出10倍，维生素B12的含量是动物肝脏的3.5倍。

在所有生物体中也是最高。

2.1.4矿物质

螺旋藻的矿物质含量相当高，也含有丰富的微量元素，（如钙、铁、锌、硒等）相对于普通陆生食物来说硒含量尤为丰富。

这些微量元素和矿物质均与有机物结合，易被人体吸收利用，能有效地调节机体平衡及酶的活性。

2.1.5生物活性物质[7]

2.1.5.1螺旋藻多糖

从螺旋藻中可以分离出一种水溶性多糖－螺旋藻多糖。

它有很强的生物活性，是螺旋藻体碳水化合物存在的主要形式。

螺旋藻多糖是螺旋藻中具有抗肿瘤、抗辐射和具有免疫调节作用的生物活性物质。

2.1.5.2活性蛋白质

研究表明，从螺旋藻中提取的藻蓝蛋白，不但是很好的天然色素，而且能提高生物体的免疫力，对抑制癌细胞的生长有明显的功效。

2.1.5.3不饱和脂肪酸

螺旋藻中的脂肪酸主要是不饱和脂肪酸，亚油酸和γ-2亚麻酸，亚油酸是人体必需脂肪酸，通过EFA途径可形成γ-2亚麻酸，并最终生成前列腺素，从而参与调节人体的各种基本生理过程，包括调节血压、胆固醇合成等，可防止糖尿病、癌症、肥胖症及皮肤老化等。

2.1.5.4β2胡萝卜素

螺旋藻中的β2胡萝卜素的含量是胡萝卜中的10倍。

β2胡萝卜素是一种良好的天然食用色素，而且还有很高的营养价值和药用价值，β2胡萝卜素是VA的前体，它还具有抗衰老和预防癌症的作用。

3遗传育种

螺旋藻的生活周期很简单，无有丝分裂和有性生殖，由一个成熟的藻丝断落成几个碎段（裂殖段），这些碎段随后形成特化的细胞，然后细胞溶解为两面凹的分离的盘状，藻丝的碎片在分化过程中产生滑动的短的（2个到4个细胞）连串细胞，连锁体离开母体细丝，形成新的藻丝。

因此螺旋藻不能像种子植物那样进行杂交育种。

目前螺旋藻育种方法主要有以下一些途径[8]。

3.1原生质球的制备与再生[9]

植物原生质体（protoplasts）是遗传操作的有力工具，是育种工作中利用基因工程和诱发突变等现代生物技术对种质进行遗传改良的理想材料。

因此，制备高质量且具再生能力的螺旋藻原生质球，对开展螺旋藻的分子遗传学和育种研究都是至关重要的。

1994年P.Sethu等以甘露醇为渗透稳定剂，在pH6.8的磷酸缓冲液中用溶菌酶酶解藻丝28h，再用蔗糖密度梯度离心获得了原生质球，但以这种原生质球的再生率未作报道。

2006年彭国宏等做了多次实验未在上述条件下分离出原生质球，而对上述有关螺旋藻原生质球的分离报道产生了怀疑。

此后，他们又尝试了其他方法但最终也未报道其再生率。

此外，秦松等用超声波处理Splatrnsis藻丝制得了原生质球并再生成功。

2007年,银红梅，张学成，王志刚等[10]用改进的超声波—溶菌酶法制备钝顶螺旋藻原生质球,但也因此法原生质球的深离太低而难以应用于遗传育种研究

总之，国内外在螺旋藻原生质球的制备和再生方面虽然作了一些工作，但到目前为止，尚不能可靠地制备出质量高且具再生能力的螺施藻原生质球，供育种所需。

3.2基因工程育种

基因工程是改良和创建生物技术良种的有力武器。

有关螺旋藻的基因识别和克隆研究方面已取得了不少有意义的结果。

光合作用过程中固定CO2的关键酶—核酮糖—1,5二磷酸（Ribulose-1,5-BisphosphateCarboxylase）大亚单位和小亚单位的基因已成功地从S.platensis中克隆出来，并在E.Coli中获得表达。

秦松等已从螺旋藻中分离出别藻蓝蛋白基因，并实现了其在E.Coli中的高效表达。

同时，在螺旋藻质粒研究方面也取得了一些进展，秦松等已分别从SplatrnsisS6和F3藻株中分离到2.4kb和1.78kb的CCC（共价闭合环状）质粒。

藻类基因工程作为基因工程的一个分支，相应地包括以下几个主要步骤:

1.获得带有目的基因的DNA片断　

用限制性内切酶切割生物染色体DNA，得到大小不同的DNA片段，其中的某一片段上可能刚好有所需要的目的基因；

以mRNA为模板，用反转录酶进行反转录合成互补DNA（即cDNA），克隆后构建成cDNA文库，再通过一定的方法，找到目的基因所在的cDNA克隆，并以此为探针，从真核生物基因文库中钓取理想基因；

再根据已知序列，用化学合成法直接合成某个基因。

2.重组DNA分子的构建　

一般将带有目的基因的DNA片段连接到能够独立复制并具有选择标记的载体上，如质粒、噬菌体和病毒等，以形成重组DNA分子。

DNA片断与载体的连接方式主要有同聚末端连接、粘性末端连接、平齐末端连接及人工接头分子连接。

3.重组DNA分子的转化及扩增　

重组DNA必须进入宿主细胞DNA中，才能得到扩增和表达。

根据载体的性质不同，可采用转染、转化、转导等方式，将重组DNA分子导入宿主细胞内，并使其大量繁殖。

4.对重组克隆（recombinantclone）进行筛选　

在转化实验中，一些细胞被转化，一些细胞未被转化，因此需要筛选出被转化的宿主细胞。

筛选可利用载体的遗传标志，如抗菌素抗性等来进行选择。

3.2.1常用遗传转化方法:

3.2.1.1接合转移

接合转移是指利用广谱宿主接合质粒，使DNA通过细胞接触从一种细菌转移到蓝藻。

这个系统需先构建含有目的基因、大肠杆菌、蓝藻质粒复制起点及转移起点、选择标记的杂交质粒，转化含有辅助质粒的E.coli菌株，再通过接合引入一个具有编码接合装置的基因，使3种质粒由于无法复制或整合而逐渐丢失；

杂交质粒或以自主复制形式存在，或与蓝藻染色体发生同源重组而稳定存在。

转化时将带有前述三种质粒（穿梭质粒，辅助质粒，接合质粒）的宿主菌与受体藻株混合，借助宿主菌与目标藻细胞的接合作用实现基因转移，通过抗生素筛选获得抗性藻落。

接合转移相对于其他转移系统来说具有如下特点：

（1）是蓝藻中应用最为普遍的基因转移系统之一，它适合于大多数的单细胞、丝状蓝藻；

（2）对于能够自然转化的蓝藻来说，接合转移也是转移大分子DNA的方法之一；

（3）转化效率较高，三亲接合转移系统的发现使蓝藻的转化效率比自然转化提高了1-2个数量级。

但接合转移也存在一些缺点，如大肠杆菌与蓝藻细胞的接触容易导致转化子被污染。

3.2.1.2天然转化与诱导转化

天然转化是指蓝藻在指数生长期不经过处理直接吸纳外源DNA。

目前发现的可天然转化的蓝藻绝大多数属于聚球藻和集胞藻两个属。

蓝藻天然转化的机制虽不太清楚，但估计绝大多数单细胞品系可能具有天然感受态，其机制可能与细菌具有相似之处。

诱导转化是指通过人工诱导感受态进行遗传转化，如Ca2+可有效诱导集胞藻感受态的形成。

相对于自然转化，诱导转化可通过人工诱导感受态来扩大其适应范围，就转化效率而言，对同种藻株采用诱导转化要比用克隆的DNA进行自然转化的效率高（闵红涛等，1995），而且诱导转化的重复性较好，但由于影响诱导转化的因素较多，需要不断摸索并改善影响转化效率的相关条件，使之达到较高水平。

诱导转化主要适用于缺乏天然感受态的蓝藻株系，如集胞藻S.6308。

其它一些具有天然感受态的蓝藻株系也可以通过诱导转化来提高其转化效率，如聚球藻S.6301、7002等

3.2.1.3电击法

电击法是将宿主细胞置于高强度电场中，通过电场脉冲在细胞膜上形成瞬间可逆性孔洞，为外源物质（如DNA、RNA、蛋白质等多种生物分子）提供了通道。

电击法适用宿主十分广泛，包括原核生物、植物原生质体以及动物细胞。

电击法在藻类中具有普遍适用性，已成功应用的门类包括蓝藻、红藻、绿藻，对单细胞或丝状体受体类型无特殊要求。

需要注意的是，由于大型褐藻的原生质体制备与再生技术仍有待改进，从而限制了电击法在褐藻中的应用。

电击转化具有如下独特的优点：

（1）只需要供体DNA和宿主细胞，大肠杆菌与蓝藻细胞不接触，转化子不会被大肠杆菌所污染；

（2）缺乏bom位点〔活化位点〕的载体也可作为供体；

（3）较大的DNA分子也可作为供体；

（4）在转化前可对供体DNA进行甲基化修饰等遗传操作；

（5）转化效率较高。

3.2.1.4基因枪法

基因枪法又称微粒子轰击法，基本原理：

利用基因枪的火药爆炸、高压放电或高压气体作驱动力，将吸附或包裹有DNA的金粉或钨粉微粒高速发射，击中并高速穿透真空室中受体的细胞壁及原生质膜到达细胞内，从而达到将吸附于微弹上的外源DNA导入受体细胞或原生质体，并获得整合和表达基因。

虽然这种方法不受材料限制，但是转化效率偏低。

影响基因枪转化效率的因素主要是轰击压力以及轰击距离。

对于不具有感受态或难以诱导出感受态的蓝藻细胞来说，上述的电击法和基因枪法是可以选择的转化方法。

与接合转移相比，该方法不需要复杂的质粒系统作支持，只需供体DNA和藻细胞，而且供体DNA可直接来自于大肠杆菌、蓝藻或体外遗传操作的产物。

3.2.1.5超声波转化

尝试使用超声波转化法分别在聚球藻S.和钝顶螺旋藻中成功实现基因转移。

目前超声波法尚不成熟，这种方法的缺点是容易造成受体细胞的死亡，因此转化条件有待于进一步优化。

然而，至今还不能像高等植物那样，将基因工程这一先进技术应用于螺旋藻的品种改良，是因为利用基因工程技术创建螺旋藻生物技术良种的基础研究工作不够深入，造成目前尚不能解决的困难：

（1）螺旋藻完整的基因图谱尚未构建，对其整个基因组尚缺乏系统认识；

（2）还没有找到合适的限制性内切酶来对所发现的CCC质粒进行深入研究，也未发现该质粒的功能（隐秘型质粒），更未构建出理想的转基因载体；

（3）虽然在外源DNA导入螺旋藻细胞方法上已取得了一些有意义的结果，但尚不能制备出外源DNA易导入且具再生能力的原生质球。

3.3诱变育种

诱发突变技术及相关生物技术是改良和创建生物技术良种的另一重要手段。

国内外在螺旋藻诱变良种方面进行了较深入的研究，并已获得了一些有价值的突变体。

物理诱变因子（γ-射线、紫外线等）和化学诱变因子（EMS、MNNG等）均能使螺旋藻藻丝或细胞发生变异，产生高产，耐低温、耐盐、富含某些氨基酸或藻蓝蛋白及藻丝超长等突变体。

这些突变体不仅是基础理论研究的好材料，而且也是应用于螺旋藻养殖和深加工的理想品系。

3.3.1物理诱变

物理诱变剂应用于螺旋藻育种的有+Co—射线[11.12]、He—Ne激光[13]、YAG激光[14]、半导体激光等。

+Co—射线是常用的诱变辐射源，由它引起的遗传效应有码组移动、A：

T—G：

C及DNA巨大损伤（重复、缺失、异位、倒位）。

目前，+Co—射线作为物理诱变剂在螺旋藻育种中应用最广。

3.3.2化学诱变

在螺旋藻育种中得以使用的化学诱变剂有亚硝基胍（NTG）和甲基磺酸乙酯（EMS）[15]等，它们都属于烷化剂。

烷化剂能与藻丝体的许多部位发生作用，使DNA分子增加了烷基侧链．从而改变DNA分子的内部结构，在DNA复制时导致碱基配对错误而引起突变。

虽然诱发突变技术对遗传物质DNA的操作不具有基因工程那么强的针对性，但诱变育种具有所需仪器设备简单、操作简便、成本低、效率高等优点。

因此，在当前开展螺旋藻基因操作所需的技术和条件还不完备的情况下，诱变育种仍不失为一种创建螺旋藻生物技术良种的有效而实用的技术手段。

4螺旋藻的应用潜力及前景

4.1食疗与医药业

螺旋藻由于含有丰富而均衡的营养，故即可治疗营养不良又可作为食品添加剂提高谷物的生物效率和蛋白质的利用率。

不少研究表明，成人每天服食8g螺旋藻即可获得人体所需的全部氨基酸与维生素。

据Tragut.V报道，美国夏威夷的Cyanotee公司的研究人员经过10年3500代的精心筛选，从原来的钝顶螺旋藻中筛选了一个叫“太平洋螺旋藻”的新品系。

该品系能充分吸收阳离子，产生更高水平的胡萝卜素，并比原种多出四种独特的酶。

最近对该种进行水解分离，得到能抑hela细胞中HSV（贺普氏简体病毒一号）病毒的提取物，这种提取物本身并不能杀死病毒，但能阻止病毒渗透进入寄主细胞内。

对提取物进行提钝，又发现了一种新的硫酸多糖化合物，它被命名为Spindina（Ca-SP）。

对Cs-SP的特性进一步研究表明，它不仅能控制贺普氏简体病毒，而且能抑制其他感染人类的病毒，例如：

流感一号，艾滋病一号等。

4.2饵料与饲料业

螺旋藻是一种营养价值高的优质饵料，可提高水产动物特别是海珍品育苗成活率，降低育苗成本，提高幼体的免疫力和活力，还可使观赏鱼类体色鲜艳。

对鲍鱼、对虾、鱼、鲷鱼、鲂鱼、扁贝、珍珠贝等均有良好的营养效果。

在国际上，螺旋藻作为优质饵料已占很大的比重。

日本DIC公司在泰国兴建的螺旋藻养殖场年产150t，其中作饲料的就有50t-60t，墨西哥XCOCO公司年产藻粉300t，其中有100t用于饵料和饲料，我国台湾省年产藻粉300t，其中有120t用于虾苗和其他海珍品、观赏鱼类、多类的饲料。

我国已是螺旋藻的养殖大国，又是水产养殖的大国，故在这方面的应用存在十分大的潜力。

4.3美容与化妆品业

螺旋藻由于营养丰富，有较好的护肤能力，不但有很好的润肤，护扶效果，同时由于螺旋藻有清除和抑制自由基的能力，故能起到防皱、防晒、抗幅射、祛斑、抗衰老的作用。

根据北京医科大学药物所、昆明医学院、昆明市中医院、昆明医学院第一附属医院等皮肤科和医学美容中心等单位进行的236例临床试用表明[16]螺旋藻营养液能提供皮肤所需要的氨基酸、藻多糖、SOD等多种营养活性成分，有增加皮肤水弹性、润肤保湿、除皱、祛斑等功效，用时由于螺旋藻化妆品的透过性较好，能起到皮肤表面和深层营养及护理作用，而且使用十分安全，对皮肤没有刺激和致敏作用。

4.4废水处理和环保业[17]

把螺旋藻培养应用于废水处理是很有发展前景的。

因为丝状的螺旋藻比较容易从培养液中分离出来，是一种用于废水处理很有前途的微藻。

用各种来源的，经过一定处理的污水培养螺旋藻，不但可以使污水得以净化，减少环境污染，还可以将得到的藻生物量用作饲料、肥料，甚至还可以用于生产有用的化学物质。

在这方面已作了许多研究工作。

例如，利用城市污水、糖蜜发酵废水，动物排泄物，以及缫丝废水、制药、酿造、制单等工业有机废水，造纸废水、有机印染废水、味精肌废水等配制成培养基，用于养殖螺旋藻，这说明螺旋藻应用于上述废水的二级处理是可行的。

5螺旋藻科研和生产的发展趋势

当前国外螺旋藻生物技术产业化的进一步发展受到生产成本过高的限制。

除此之外，学者们对影响产品质量各种环境因素进行深入研究，并通过各种现代生物学技术手段提高螺旋藻营养价值和产量。

①充分利用各种自然资源进行工厂化生产仍然被许多国家的学者和企业家所重视。

因为这是降低生产成本最直接、最有效的措施。

乍得湖是世界上最大的碱水湖泊，是现在使用的钝顶螺旋藻的原产地，生产螺旋藻的自然条件十分优越。

②研制高光合效率的光反应器，提高单位面积产量，降低生产成本。

目前国外的螺旋藻工厂均为开放、跑道式培养池，单位面积产量7-10克/米2·

天，也就是说光合作用效率只有0.7%-1%，光合效率低是生产成本高的主要原因，因此，提高光合效率是降低生产成本的高的主要原因，因此，提高光合效率是降低生产成本的有效途径。

③螺旋藻不饱和脂肪酸的研究受到广泛的重视。

螺旋藻一直是以高蛋白（65%-70%）著称，脂肪含量只占7%左右（干重），而这7%的脂类中的80%为不饱和r-亚麻酸（GLA）又是其中的主要成分，它能刺激前列腺素的合成。

近年来对螺旋藻脂类特别是不饱和脂肪酸合成的机制以及与培养环境的关系的研究了取得了意义的结果，为控制产品质量提供科学依据。

④应用遗传和分子遗传学技术培育各种不同特性、富含某种成分的优良品系。

这项研究目前受到越来越多的学者，特别是遗传学者的重视，因为它是提高单产的重要措施之一，而且它还能增加产品种类，扩大市场的需要。

目前国外培育的优良品系或突变株有如下几种类型：

高光合作用低呼吸作用以及抗氧饱和等高产品系：

抗性品系；

耐渗透压等和富含某种成分的品系。

螺旋藻分子遗传学已有了一个良好的开端，相信在不久的将来会取得更多的研究成果。

运用分子遗传学的技术，培育更多优良品系是指日可待的。

当前国内外螺旋藻生物技术产业化的焦点仍然是成本和产品多样化的问题。

解决这两个问题的途径是多种多样的、综合性的。

相信这些科学技术问题的解决将会推动螺旋藻产业的进一步发展。

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