第十三章 可见和紫外分光光度法Word文档格式.docx
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它们都是不连续的线状光谱。
不同元素的原子其电子结构不同，能级结构不同，因而有其特征的光谱线。
利用此类性质的分析法称为原子光谱法。
分子是由多个原子结合而成，分子及其内部粒子存在着三种与光的吸收或发射有关的运动形式：
价电子在分子轨道上的运动；
原子或原子团相对于连接它们的化学键的振动和分子绕着其重心转动。
因此，一个分子的与光的吸收或发射有关的能量也包括三部分，即分子的价电子能级的能量Ee、分子振动能级的能量Ev及分子转动能级的能量Er。
在每一电子能级上有许多间距较小的振动能级，每一振动能级上又有许多更小的转动能级。
分子中价电子能级间的能量差
约为1eV～20eV，这恰好是可见光和紫外光的能量。
研究物质在可见、紫外光区的分子吸收光谱的分析方法称为可见-紫外分光光度法（visibleandultravioletspectrophotometry,VIS-UV）。
由于可见-紫外吸收光谱主要产生于价电子在电子能级间的跃迁，所以也将其称为电子光谱方法。
振动能级间的能量差
约为0.05eV～1eV，相当于红外光的能量。
而转动能级间的能量差
约为10-4eV～0.05eV，相当于远红外光及微波的能量。
红外光谱是分子的振转光谱。
分子光谱是带状光谱。
图13-1高锰酸钾水溶液吸收光谱
不同物质由于结构上的差异，所需跃迁能量不同，于是呈现出不同的吸收光谱。
通过分子的吸收光谱可以研究分子结构并进行定性和定量分析。
可见光谱常用于有色物质含量的测定。
紫外光谱常用于具有紫外吸收基团的无色物质含量的测定。
红外光谱常用于研究有机化合物的结构。
（二）吸收光谱
将不同波长的单色光依次通过被分析的物质溶液，分别测得不同波长下的吸收程度，即吸光度（absorbance）A。
然后以波长为横坐标，吸光度A为纵坐标作图，可得一曲线，即为吸收光谱（absorptionspectrum）。
如图13-1所示KMnO4的吸收光谱。
吸收光谱中，吸光度最大处的波长为最大吸收波长，用max表示（图13-1中max为525nm）。
图中的几条曲线分别代表不同浓度时的吸收光谱，它们的形状基本相同，最大吸收波长均为525nm。
溶液浓度愈大，吸收光谱的峰值愈高，两者成正比关系。
若采用最大吸收波长测定吸光度，则灵敏度最高（响应值随浓度的变化幅度最大），所以一般定量测定时选择max波长作为入射波长。
吸收光谱体现了物质的特性，是进行定性、定量分析的基础。
二、透光率和吸光度
图13-2光与吸收池和介质的相互作用
一束强度为I0的单色光通过溶液时，一部分能量被吸收（Ia），一部分透过溶液（It），还有一部分被吸收池表面反射（Ir）。
如果样品混浊或辐射荧光，则透射光中还包括样品的散射光（Is）和荧光（If），见图13-2。
如果样品为透明溶液，不发射荧光，又由于所有的分光光度法中是将被测溶液和参比溶液分别置于两个同样材料和厚度的吸收池中，所以反射光Ir、荧光If和散射光Is均可被忽略或相互抵消。
则：
I0=Ia+It（13-1）
透射光强度It（transmissionintensity）与入射光强度Io（incidentintensity）之比称为透光率（transmittance），用T表示
（13-2）
透光率愈大，溶液对光的吸收愈少；
反之，透光率愈小，溶液对光的吸收愈多。
透光率的负对数称为吸光度，用符号A表示。
A愈大，溶液对光的吸收愈多。
（13-3）
吸光度与溶质、溶剂、波长、温度、浓度及液层厚度等因素有关。
三、朗伯－比耳定律
1729年法国科学家布给（P.Bouguer）阐明了吸光度和液层厚度的关系，1760年德国科学家朗伯（J.Lambert）提出：
当一定波长的单色光通过一固定浓度的溶液时，其吸光度与光通过的液层厚度成正比，即
A=k1b（13-4）
式中b为液层厚度。
k1为比例系数，它与被测物质性质、入射光波长、溶剂、溶液浓度及温度有关。
朗伯定律对所有的均匀介质都是适用的。
德国科学家比耳（A.Beer）于1852年根据一系列的实验证明：
当一定波长的单色光通过溶液时，若液层厚度一定，则吸光度与溶液浓度成正比，即：
A=k2c（13-5）
式中c为物质的量浓度（或质量浓度），k2是与吸光物质种类、溶剂、入射光波长、液层厚度和溶液温度有关的常数。
比耳定律仅适用于单色光。
合并式（13-4）和式（13-5），得：
A=κbc（13-6）
式中b的单位为cm，c为物质的量浓度（molL-1），
为摩尔吸光系数（molarabsorptivity），读作['
kæ
pә]，单位为Lmol-1cm-1。
若用质量浓度（gL-1）表示溶液的组成标度，则朗伯－比耳定律可表示为：
A=abρ（13-7）
式中的a为质量吸光系数（massabsorptivity），单位是Lg-1cm-1。
a和κ可通过下式相互换算：
κ=aMB（13-8）
式中MB表示被测物质的摩尔质量。
吸光系数κ（或a）随不同的物质、波长、溶剂及温度而异，所以它可以表示一个物质的吸收特征。
吸光系数的大小反映出吸光物质对光的吸收程度，κ愈大，表示该物质对某波长光的吸收能力愈强，测定的灵敏度就愈高，测定时选择具有最大κ值的波长作为入射光。
一般κ值大于103Lmol-1cm-1即可进行分光光度法测定。
通常所说的吸光系数也指的是在吸收光谱中max时的κ。
由朗伯－比耳定律可知，吸光度与溶液浓度（或液层厚度）之间为正比关系，而透光率与溶液浓度（或液层厚度）之间为指数函数关系：
-lgT=κbc
T=10-κbc（13-9）
在化合物组成不明的情况下，物质的相对分子质量无从知道，物质的量浓度无法确定，也就不便使用摩尔吸光系数，为此医药学实际中有时也用比吸光系数。
比吸光系数是指100mL溶液中含被测物质1g，液层厚度b为1cm时的吸光度值，用
表示，它与a的关系为：
（13-10）
【例14-1】朗伯－比耳定律计算
根据朗伯－比耳定律求摩尔吸光系数：
已知含Fe2+浓度为1.810-5molL-1的溶液，用邻二氮菲与Fe2+显色*后，用分光光度法测定铁，吸收池厚度为2.0cm，在波长508nm处测得吸光度A=0.38，计算摩尔吸光系数。
【解】κ=
=
=1.1104Lmol-1cm-1
【归纳】κ是通过标准物质稀溶液测得的，它的数值愈大，表明溶液对入射光愈容易吸收，测定的灵敏度就愈高。
κ与溶液的浓度及液层厚度无关。
第二节可见-紫外分光光度法
一、可见及紫外分光光度计
可见及紫外分光光度计通常由五个部分组成（图13-3）。
图13-3可见及紫外分光光度计组成示意图
（一）辐射光源
辐射光源（lightsource）在所需光谱区域内能发射连续的具有足够强度和稳定的辐射光，并且辐射能随波长的变化尽可能小，使用寿命长。
在可见和近红外区的常用光源为白炽光源，如钨灯。
可使用的波长范围320nm~2500nm。
紫外区主要采用氢或氘放电灯，在波长165nm~350nm范围内发出连续光谱。
必须指出的是，由于受石英窗吸收的限制，通常紫外光区波长的有效范围为200nm~350nm。
（二）单色器
单色器（monochromator）是从光源辐射的复合光中分出单色光的装置。
最常用的色散元件有棱镜和光栅。
棱镜通常用玻璃、石英等制成。
玻璃适用于可见光区，石英材料适用于紫外光区。
光栅的分辨率在整个光谱范围内是均匀的，使用起来更方便。
（三）吸收池
可见及紫外分光光度法中，将被测液体放在分光光度计光束通过的液体池中，用来盛放溶液的容器称为吸收池（absorptioncell）。
可见光区的吸收池用普通光学玻璃制成，而紫外光区则应为石英吸收池。
吸收池的两个透光面必须严格平行并保持洁净，切勿直接用手接触。
吸收池的液层厚度有10-2cm~10cm或更厚，常用为0.5cm、1cm、2cm，视分析需要选用。
（四）光敏检测器
分光光度计中的光敏检测器（photosensitivedetector）一般用光电管（photoelectriccell），当光照射到阴极时，表面金属发射电子，流向电位较高的阳极而产生光电流。
光愈强，阴极表面发射的电子愈多，产生的光电流也愈大。
光电管因敏感的光谱范围不同而分为蓝敏和红敏光电管两种。
前者可用波长范围为210nm~625nm，而后者可用范围为625nm~1000nm。
常用的光敏检测器还有光电倍增管，光电倍增管比普通光电管更灵敏，对光谱的精细结构有较好的分辨能力。
分光光度计光敏检测器要求在测定的光谱范围内应具有高的灵敏度，对辐射强度呈线性响应，响应快，高稳定和低“噪音”水平。
二、测定方法及应用
分光光度法常用于定量测定，根据朗伯－比耳定律，在一定波长条件下，吸光度与浓度成正比，因此在分光光度计上测出吸光度，通过下列方法即可求出被测物质含量。
（一）标准曲线法
标准曲线法是分光光度法中最为常用的方法：
取标准品配成一系列已知浓度
图13-4KMnO4的标准曲线
的标准溶液，在选定波长处（通常为max），用同样厚度的吸收池分别测定其吸光度，以吸光度为纵坐标，标准溶液浓度为横坐标作图，得一直线标准曲线（standardcurve）（图13-4）。
然后将被测溶液置于吸收池中，在相同条件下，测量其吸光度，根据吸光度即可在标准曲线上查得其对应的含量。
该方法对于经常性批量测定十分方便。
另外由于被检测的样品浓度实际上是与多个标准溶液的浓度相比较而得出的结果，所以更准确和可信。
采用此法时，应注意使标准溶液与被测溶液在相同条件下进行测量，且溶液的浓度应在标准曲线的线性范围内。
在测定溶液吸光度时，为了消除溶剂或其它物质对入射光的吸收，以及光在溶液中的散射和吸收池界面对光的反射等与被测物吸收无关的因素的影响，必须采用空白溶液（blanksolution）作对照。
在可见光区常用的空白溶液有下列三种：
1.溶剂空白当显色剂以及制备试液的其它试剂均无色，可用溶剂作空白溶液。
2.试剂空白若显色剂有色，试样溶液在测定条件下无吸收或吸收很小时，可用试剂空白进行校正，也就是按显色反应相同的条件加入各种试剂和溶剂（不加被测试样溶液）后所得溶液，相当于标准曲线法中浓度为“0”的标准溶液。
3.试样空白当试样基体有色（如试样溶液中混有其它有色离子），但显色剂无色，且不与试样中被测成分以外的其它成分显色时，可用试样空白校正。
也就是不加显色剂但按显色反应相同条件进行操作的试样溶液。
（二）标准对照法
先配制一个与被测溶液浓度相近的标准溶液（其浓度用cs表示），在max处测出吸光度As，在相同条件下测出试样溶液的吸光度Ax，则试样溶液浓度cx可按下式求得：
（13-11）
此方法适用于非经常性的分析工作。
（三）比吸光系数比较法
比吸光系数比较法是利用标准的
值进行定量测定的，我国药典（2005年版）中规定某些药物的测定一般采用此法。
即将样品的比吸光系数与标准物质的比吸光系数（可从手册上查得）比较，计算出样品含量（质量分数或体积分数）。
例如：
广谱抗菌药呋喃妥因的
（367nm）=746，在相同条件下，测定呋喃妥因样品的
（367nm）=738，因此，该样品中呋喃妥因的质量分数为
。
（四）差示分光光度法（differentialspectrophotometry）
希斯金（Hiskey）提出：
用已知浓度的标准溶液c1（应与它的待测样品浓度相近）作参比溶液调零，然后测定同种未知浓度c2样品的吸光度，可以减少相对误差。
差示法测定的是两者浓度之差：
（c2-c1），若测定误差为x%，差示法所测得结果是c2（c2-c1）·
x%，非差示法所测得结果是c2c2·
x%，显然差示法相对误差较小。
在分光光度法测量中，当在吸光度很高或很低的范围内进行定量分析时，相对误差比较大。
差示分光光度法是用比试样溶液浓度稍小或稍大的溶液作参比溶液，这样测得的吸光度A实际上是试样溶液吸光度Ax和参比溶液的吸光度As的差值：
A=（Ax-As）=
b（cx-cs）=
bc（13-12）
式（13-12）表示A与c成正比，据此，即可计算试样溶液的浓度。
在实际操作中配置一系列不同的浓度溶液，浓度增加量相等，以最稀的溶液作参比，测定出对应的浓度差与吸光度的标准曲线。
最后从标准曲线上得出待测样品的浓度。
设按普通分光光度法测得的某标准溶液的透光率为10%（A=1），其待测样品溶液的透光率为5%（A=1.30），若将该标准溶液代替空白溶液作参比时，透光率扩展为100%（A=0），此时试样溶液的透光率亦被扩展为50%（A=0.3），从而提高了测量的准确度。
实际上差示法是将量程范围扩展，因此也称为扩展量程光度法（expandedscalespectrophotometry）。
但差示吸收光度法也不是无限度的应用，它还受到仪器本身灵敏度及测量噪音的限制。
三、测定误差的分析
分光光度法的误差来自于溶液吸光物质的不稳定、仪器的单色器性能不好，还有仪器测定误差。
仪器测定误差是由光电管的灵敏性差、光电流测量不准、光源不稳定及读数不准等因素引起的。
它使测得的透光率T与真实值相差T，从而引起浓度误差c。
由朗伯－比耳定律可推导得出浓度的相对误差与溶液透光率的关系式为：
RE=
（13-13）
图13-5相对误差与透光率的关系
普通分光光度计由于读数分辨率引起的透光率测量误差T一般约为0.01~0.02。
若T=0.01，则将不同的T值代入式（13-13），可得到相应的相对误差（RE）和透光率的关系图（图13-5）。
由图13-5可见，溶液透光率很大或很小时，所产生的浓度相对误差都较大，只有在中间一段T为20%~65%（也即A为：
0.2~0.7）时，所产生的浓度相对误差较小，溶液透光率为36.8%（A=0.434）时所产生的浓度相对误差最小。
在实际工作中，对于一般的仪器常通过调节溶液浓度或选择液层厚度适宜的吸收池，将溶液的透光率控制在20%~65%之间，即吸光度在0.2~0.7之间。
需要特别说明的是浓度测量误差既依赖透光率T的读数分辨率，又依赖其它多种测量环境。
对于普通分光光度计读数分辨率有限造成的误差T，浓度测量的相对误差与吸光度的关系如图13-5，但对于高质量、精确度高的分光光度计，由于读数分辨率不是误差主要来源，而是由于光电倍增管及光电管输出的随机波动，那么这类仪器的吸光度可以用到2.0或更大，但是吸光度小于0.02时，数据不可靠。
应该指出的是：
一份严谨的科学实验报告中，需要指明所用仪器的型号和厂家，以增加实验数据的可靠性。
*阅读资料：
第三节原子吸收分光光度法
一、原子吸收分析发展史
在1802年乌拉斯顿（Wollaston）观察到太阳光谱中存在着许多暗线，但是不能解释暗线的本质。
直到1859年克希霍夫（Kichoff）和本生（Bunsen）在研究火焰中的光谱时，确定了光谱与化学成分有关。
并指出太阳光谱中的暗线是太阳外围冷的蒸气圈中钠原子蒸气吸收的结果。
直到20世纪30年代之后，由于工业广泛应用汞，它易气化且毒性大，在当时大气中测汞困难大，所以人们利用原子吸收光谱的原理设计了测汞仪。
瓦尔什（Walsh）提出了原子吸收光谱作为一般分析方法广泛应用的可能性，并讨论了吸光度与原子浓度之间的关系。
此后，原子吸收光谱（atomicabsorptionspectrometry）作为一种分析方法才发展起来。
20世纪60年代后，发展了非火焰原子吸收—石墨炉，使原子吸收分析的元素范围和灵敏度达到了新阶段。
二、原子吸收分析工作原理
当光源（空心阴极灯）辐射出的含有待测元素特征频率的光穿过试样蒸气时，被蒸气中待测元素基态原子所吸收，由辐射光波强度减弱的程度可测定试样中待测元素的含量。
若光源辐射出的特征频率的光波的光强度为I0，穿过原子蒸气后测得吸收后的光强度为I，透过率为T=I/I0，I0与I符合朗伯-比耳定律：
I=I0
K为吸收系数，N为自由原子总数（近似于基态原子数），L为吸收层厚度。
A=-lgT=lg
=0.4343KNL
此式表明，A与N成正比。
在实际分析过程中，当实验条件一定时，N正比于待测元素的浓度c。
因此，以标准系列做出工作曲线后，即可依据吸光度的大小，求得待测元素的含量。
图13-6原子吸收分光光度仪器组成示意图
三、原子吸收分光光度计
原子吸收分光光度计由光源、原子化器、单色器、检测器四个主要部分组成（如图13-6所示）。
1.光源：
使用广泛的是空心阴极灯（hollow-cathodelamp），它是一种阴极呈空心圆柱形的气体放电管。
阴极内壁用待测元素或含待测元素的合金制作。
阳极为钨棒，管内充入惰性气体（氖或氩），在两极间加100-400V的直流电压，即可产生放电。
从而产生阴极物质的线光谱，光束强度大。
2.原子化器（atomizer）：
主要作用是使试样中待测元素转变成处于基态的气态原子。
入射光束在这里被基态原子吸收。
因此，它可视为“吸收池”。
原子化器主要有两大类：
火焰原子化器（flameatomizer）：
是将液体试样经喷雾器形成雾滴，这些雾滴在雾花室中与气体（燃气和助燃气）均匀混合，再进入燃烧器形成火焰。
此时，试液便在火焰中产生原子蒸气。
非火焰原子化器：
广泛应用的是石墨炉（graphitefurnace）。
3.单色器
单色器（monochromator）的作用是将灯发射的被测元素的共振线与其它波长辐射分开。
4.检测系统
在火焰原子吸收光谱法中，通常采用光电倍增管为检测器（detector）。
交流放大，读数装置显示数值。
而在非火焰原子吸收光谱法中，使用记录仪记录测量信号，适宜采用峰高法和面积积分法进行测定。
四、定量分析方法
1.标准曲线法：
配制一系列合适浓度的标准溶液，由低到高浓度依次喷入火焰，分别测定吸光度A,以A为纵坐标，被测元素浓度（或含量）c为横坐标，绘制标准曲线。
在相同条件下，喷入被测样品，测定其吸光度，在标准曲线中求得样品中被测元素的浓度或含量。
2.标准加入法：
当样品基体影响较大，又没有纯净的基体空白或测定纯物质中极微量的元素时，可以采用此方法。
分别取等量的n份被测样品，第一份不加，其余的加入已知浓度的被测元素系列，测定吸光度。
画出浓度与吸光度的曲线，直线的外延线与横坐标相交处到原点的距离，即为被测样品的元素浓度。
五、灵敏度和检出限
原子吸收分光光度法的灵敏度（sensitivity）定义为标准曲线的斜率：
它表示当被测元素浓度改变一个单位时吸光度的变化量。
仪器或多或少的有噪音，而一个有用信号能被检测出来，直接同噪音的大小有关。
表征仪器对一个元素能被检出的最小量的术语是检出极限—检出限（detectionlimit）。
一般定义为3倍噪音电平所对应的待测元素浓度（也即A=3时对应的被测元素的浓度）。
由于原子吸收分光光度法具有测定灵敏度高，检出限小，干扰少，操作简单，快速等等优点，已在医药、环保、冶金等各个领域中获得广泛应用。
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