高中生物 第六章基因重组与基因工程.docx

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高中生物第六章基因重组与基因工程

第六章基因重组与基因工程

教学大纲要求

1.熟悉基因工程、基因文库、载体、限制性核酸内切酶、PCR等概念；

2.掌握以质粒为载体进行DNA克隆的基本过程；

3.了解重组DNA技术在医学上的应用。

教材内容精要

一、自然界的基因转移和重组

自然界不同物种或个体之间的基因转移和重组是经常发生的，它是基因变异和物种演变、进化的基础。

基因重组的方式有：

接合作用、转化、转导、转座。

1．接合作用（Conjugation）当细胞（细菌）与细胞（细菌）相互接触时，质粒DNA就可从一个细胞（细菌）转移到另一个细胞（细菌）。

2．转化与转导作用

（1）转化作用（Transformation）：

由外源性DNA导入宿主细胞，并引起生物类型改变或使宿主细胞获得新的遗传表型的过程，称为转化作用。

（2）转导作用（Transduction）：

当病毒从被感染的（供体）细胞释放出来，再次感染另一（受体）细胞时，发生在供体细胞与受体细胞之间的DNA转移及基因重组称为转导作用。

3．转座（转位）（Transposition）可移动的DNA序列包括插入序列和转座子。

故由插入序列和转座子介导的基因转移或重排称转座。

转座是指一个或一组基因从一个位置转到基因组的另一个位置。

可分为插入序列（insertionsequenceIS）转座和转座予（transposons）转座。

4．基因重组不同DNA分子间发生的共价连接称基因重组。

基因重组有两种类型：

位点特异的重组（sitespecialrecombmatlon）和同源重组（homologousrecomblnation）。

二、重组DNA技术’

1．重组DNA技术的相关概念

（1）DNA克隆：

克隆（Clone）就是来自同一个体的相同的集合。

DNA克隆（DNAclone）：

应用酶学方法在体外将目的基因与载体DNA结合成一具有自我复制能力的重组DNA分子，通过转化或转染宿主细胞、筛选出含有目的基因的转化子细胞，再进行扩增，提取获得大量同一DNA分子的过程。

DNA克隆又称基因克隆或重组DNA。

DNA克隆也指将DNA重组体引进受体细胞中，建立无性系的过程。

因此，又称为基因克隆（genecloning）、基因工程（gentreengneering）、重组DNA技术。

（2）工具酶；常用的有：

内切酶、连接酶、聚合酶I、反转录酶等。

在所有工具酶中以限制性内切核酸酶最重要。

限制性内切核酸酶（Restrictionendonuclease）是指能识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。

根据组成和作用特性的不同，常用的限制性核酸内切酶可分为三类。

，重组DNA技术用到的为Ⅱ类。

其特点为：

①具有识别特异性：

识别DNA分子上特定的核苷酸序列，该序列一般呈回文结构（Palindrome），如：

E．CoRI识别的序列为5GAATTC3。

②具有切割特异性：

从某一特定位点或其周围切割，产生后产生粘性本端或钝性末端，如：

E．CoRI从G和A之间切开，产生两个粘性本端（5G↑AATTC3）。

不同的限制性内切核酸酶识别DNA中的核苷酸长短不一，切割位点的多少也不同，产生的片段大小各异。

（3）目的基因：

目的基因（targetgene）是我们要研究或利用的DNA序列或基因，称为目的基因。

目的DNA有两种类型：

cDNA和基因组DNA。

cDNA（ComplementaryDNA）是以RNA为模板，经反转录合成的与RNA互补的单链DNA。

以cDNA为模板经聚合反应可合成双链cDNA。

基因组DNA（genomicDNA）是指代表一个细胞或生物体整套遗传信息的所有DNA序列。

（4）基因载体：

也叫克载隆体（cloningvector）是携带目的基因，实现目的基因的无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的一些DNA分子。

具有转录和翻译所必须的DNA序列，可以完成目的基因表达过程的载载体称为表达载体（expressionvector）。

作为载体，必须要有独立的复制能力，可导入宿主细胞，并且要便于检测。

常用的载体有质粒DNA、噬菌体DNA、和病毒DNA。

质粒（P1asmid）是存在于细菌染色体以外的环状DNA分子。

质粒大小适宜，拷贝数多，易于转化，利于筛选，有理想的酶切位点。

噬菌体（phage）是侵袭细菌的病毒。

常见的噬菌体有噬菌体和M13噬菌体。

基因工程所使用的噬菌体DNA均是经过人工改造的。

Ml3噬菌体的基因间隔区插入E．Co1i的调节基因及LacZN一端146个aa残基编码基因，其产物为-半乳糖苷酶的-片段。

而突变型Lac-EColi可表达-半乳糖苷酶的-片段（酶的C-端），单独的-片段及-片段均无-半乳糖苷酶的活性。

当舍有LacZ的M13噬菌体转化Lac-E．coli细菌时，-片段及-片段共同表达，宿主Lac—E．COli细菌才有-半乳糖苷酶活性，使特异的作用物变为兰色化合物，生长的细菌为兰色，这就是-互补。

可用于重组体的筛选。

如果目的基因插入lacZ基因内，则LacZ不表达，为白色菌落。

2．重组DNA技术

一个完整的DNA克隆过程包括目的基因的获取（分），克隆载体的选择和构建（切），目的基因与载体的连接（接），重组体导入受体菌（转），重组体的筛选（筛），克隆基因的表达（表）六个过程。

（1）目的基因的获取：

可以通过化学合成、文库筛选，PCR等方法获得。

基因组DNA文库（genomicDNAlibrary）：

转化细菌内，由克隆载体所携带的所有基因组DNA的集合称为基因组DNA文库。

构建方法是把生物体全部的DNA提纯后，用限制性内切核酸酶，随机切割成许多片段，将所有片段均重组入同一类载体上，得到许多重组DNA分于，继而全部转入受体酋扩增，使每个细茼内都携带一种重组DNA分子的多个拷贝，这样生长的全部细菌所携带的所有基因组DNA片段，即为整个基因组。

需要时用探针即可获得。

cDNA文库（cDNAlibrary）是与基因组DNA文库类似，以mRNA为模板，利用反转录酶合成与mRNA互补的cDNA。

以总mRNA制作的cDNA文库，包含了细胞的各种mRNAcDNA。

聚合酶链反应（p01ymerasechainreaction，PCR）是DNA迅速大量扩增的方法，短时间内获得大量DNA，有利目的基因的获得。

（2）克隆载体的选择和构建：

根据不同的目的基因，选择不同的载体。

并选用限制性内切核酸酶切割目的基因和载体。

（3）目的基固与栽体的连接：

利用DNA连接酶将目的基因DNA与载体DNA连接在一起，形成重组体。

其连接方式有：

粘性末端连接、平端连接、同聚物的加尾连接和人工接头连接等。

（4）重组体导入受体菌：

即把重组DNA导入受体菌的过程。

根据载体的性质不同导入方式有：

转化、转染、感染等早入方法如下：

选择适当的受体茵。

符合安全标准，为限制酶和重组酶缺陷型。

感受态细胞（competentcell）：

具备接受外源DNA的能力的经过特殊方法处理的受体菌。

（5）重组体的筛选：

筛选出含重组DNA的受体菌，有直接筛选法和非直接筛选法。

抗药性标志选择，标志补救及分子杂交属直接选择法；免疫化学湘酶联免疫检测法属非直接选择法。

通过转化、转染、感染等，导入重组体的受体细胞，经过培养得到大量的菌落或噬菌斑，因为每一个重组体只携带某一段外源基因，转化或转染时，每一受体菌仅接受一个重组体分子，所以要将它们区分，并鉴定那一菌落，含有带目的基因的重组体。

即得到目的基因克隆。

（6）克隆基因的表达：

可以生成有价值的蛋白质或多肽。

原核生物表达体系；E．coil是最常见的。

运用E．COti表达有用的蛋白质必须使构建的表达载体符合以下标准：

舍有大肠杆菌适宜的选择标志，具有强启动子，舍有适当的翻译控制序列，合有合理设计的多接头克隆位点。

真核表达体系常见的有酵母、昆虫、哺乳类细胞等。

3．重组DNA技术与医学的关系：

现代分子医学是重组DNA技术及其他分子遗传学技术、理论与医学实践相结合的结果，特别是在疾病基因的发现、发展生物制药、DNA诊断、基因治疗、遗传病的预防等方面有重要意义。

[测试题]

一、名词解释

1．基因工程

3．转化作用

4．转导作用

5．同源重组

6．限制性核酸内切酶

7．回文结构

8．目的DNA

9．互补DNA

10．克隆载体

11．表达载体

12．质粒

13．-互补

14．基因组DNA文库

15．感受态细胞

16．cDNA文库

二、填空题

1．自然界的常见基因转移方式有、、、。

2．不同DNA分子间发生的共价连接称为，有、两种方式。

3.由和介导的基因移位或重排称为转座。

4．基因工程的载体必须具备的条件有、、。

5．限制性内切核酸酶识别的核苷酸序列的个数为、和——，其切口有端和端。

6.基因工程常用的载体DNA分子有、和。

7．一个完整的DNA克隆过程应包括、、、、。

8．目的基因获取的途径或来源有、、、。

9．基因工程过程中重组体直接筛选法的方式有、、。

10．基因克隆真核生物表达体系常见的有、、表达体系。

11．根据重组体DNA的性质不同，将重组体DNA导人受体细胞的方式有、、等。

12．如果Mi：

的外源基因被插入到lacz基因内，则在含有X-gal的培养基上生长时会出现色菌落，如果在1acz基因内无外源基因插入，在同样的条件下呈现色菌落。

13．重组DNA技术中常用的工具酶有、、、。

三、选择题

A型题

1．cDNA文库包含

A．一个物种的全部基因信息

B．一个物种的全部mRNA信息

C．一个生物体组织或细胞的全部基因信息

D.一个生物体组织或细胞的全部mRNA信息

E．一个生物体组织或细胞所表达mRNA信息

2．关于接合作用正确的是

A．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，染色体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

B．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，某些较大质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

C．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，噬菌体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

D.细胞与细胞或细菌通过苗毛相互接触时，所有类型的质粒DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

E．细胞与细胞或细菌通过菌毛相互接触时，所有类型的噬菌体DNA从一个细胞（细菌）转移至另一细胞（细菌）

3．基因工程的特点是：

A.在分子水平上操作，在分子水平上表达

B．在分子水平上操作，在细胞水平上表达

C.在细胞水平上操作，在分子水平上表达

D．在细胞水平上操作，在细胞水平上表达

E．以上均可以

4．实验室内常用的连接外源性DNA和载体DNA的酶是：

A．DNA连接酶B．DNA聚合酶IC．DNA聚合酶1

D．DNA聚合酶IE．反转录酶

5．用来鉴定DNA的技术是：

A．Northern印迹B。

Southern印迹C．Western印迹

D．亲和层析E.离子交换层析

6．用来鉴定RNA的技术是：

A．Northern印迹B。

Southern印迹

E.Western印迹D．亲和层析E.离子交换层析

7．重组DNA技术中常用的工具酶下列那项不是：

A.限制性核酸内切酶B．DNA连接酶C.DNA聚合酶I

D．RNA聚合酶E．反转录酶

8．F一细胞与F十细胞混合培养，产生F+细胞的过程为：

A.转化B．转导C接合n突变E.转位

9．DNA致癌病毒感染宿主细胞后，使之发生癌变是因为发生了：

A．转化B．转导E.接合D．转座E．转位

10．关于基因