分子生物学实验方法与步骤1Word文档下载推荐.docx
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2.购买的限制性内切酶多保存于50%甘油中，于-20℃是稳定的。
进行酶切消化时，将除酶以外的所有反应成分加入后即混匀，再从-20℃冰箱中取出酶，立即放置于冰上。
每次取酶时都应更换一个无菌吸头，以免酶被污染。
加酶的操作尽可能快，用完后立即将酶放回-20℃冰箱。
3.尽量减少反应体积，但要确保酶体积不超过反应总体积的10%，否则酶活性将受到甘油的抑制。
4.通常延长时间可使所需的酶量减少，在切割大量DNA时可用。
在消化过程中可取少量反应液进行微量凝胶电泳以检测消化进程。
5.注意星号酶切活力。
DNA片段回收与纯化
质粒、噬菌体等经酶切，电泳；
PCR产物经电泳后，常常需要对一些DNA电泳片段进行回收和纯化，用于亚克隆、探针标记等。
DNA回收和纯化常用方法有压碎法、低融点琼脂糖法、冻融法等，也有现成的试剂盒供应。
一、冻融法
1.紫外灯下仔细切下含待回收DNA的胶条，将切下的胶条（小于0.6g）捣碎，置于1.5ml离心管中；
2.加入等体积的Tris-HCl饱和酚（pH7.6），振荡混匀；
3.-20℃放置5-10min；
4.4℃离心10000g×
5min，上层液转移置另一离心管中；
5.加入1/4体积H2O于含胶的离心管中，振荡混匀；
6.-20℃，放置5-10min；
7.4℃离心10000g×
5min，合并上清液；
8.用等体积酚/氯仿、氯仿分别抽提一次，取上清；
9.加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积预冷的无水乙醇，混匀；
10.-20℃，静置30min；
11.4℃离心13000g×
10min，弃上清，75%乙醇洗沉淀1-2次，晾干；
12.加适量H2O或TE溶解沉淀。
二、DNA回收试剂盒（QIAquickGelExtractionKitProtocol）
1.
紫外灯下仔细切下含待回收DNA的凝胶，置1.5ml离心管中，称重。
2.
加入BufferQG（每100mg凝胶加BufferQG300μl），置50℃水浴10min。
3.
若回收片段小于500bp或大于4kb，则需加入异丙醇（每100mg凝胶加异丙醇100μl），混匀。
4.
将小柱放在2ml收集管上，将上述溶液加于柱上。
5.
4℃离心13000g×
1min，弃去收集管中液体。
6.
加入500μlBufferQG于柱上，4℃离心13000g×
7.
加入750μlBufferPE于柱上，4℃离心13000g×
8.
1min。
弃去收集管。
9.
将柱放于一新1.5ml离心管上，加50μlEB于柱上。
放置1min，4℃离心13000g×
10.取5μl回收DNA电泳检测。
三、注意事项
紫外灯下切下含待回收DNA的凝胶时，要衬以干净的塑料薄膜，使用无DNA污染的新刀片，其目的在于防止外源DNA的污染。
mRNA差别显示技术
mRNA差别显示技术也称为差示反转录PCR（DifferentialDisplayofreverseTranscriptionalPCR）简称为ddRT-PCR。
它是将mRNA反转录技术与PCR技术二者相互结合发展起来的一种RNA指纹图谱技术。
目前已广泛应用于分离鉴定组织特异性表达的基因。
差别基因表达（differentialgeneexpress）是细胞分化的基础。
mRNA差别显示技术正是对组织特异性表达的基因进行分离的一种快速而行之有效的方法。
该方法的基本原理是首先选取不同的组织样品或不同发育阶段的同一组织样品或同一组织样品经不同药物处理诱导的样品，经总RNA提取后，进行mRNA反转录合成cDNA。
此cDNA的合成是采用Oligo（dT）12MN为引物，其中M为A，C，G中的任意一种，N为A，C，G或T中的任意一种，所以共有12种oligo（dT）12MN引物，其中M称为锚定碱基，起增大引物Tm值的作用，N称为分类碱基，对反转录进行分类。
用这12种引物分别对同一总RNA样品进行cDNA合成，即进行12次不同的反转录反应，从而使反转录的cDNA具有12种类型，也就是对cDNA进行12种归类（目前较为流行的方法是进行4种归类，即M为简并碱基的形式存在），在此基础上对每一类cDNA进行随机引物和反转录引物PCR扩增，通过对组织样品的同一类cDNA的PCR选择性扩增产物凝胶电泳分析，从而反映出不同样品间基因的时间和空间上组织特异性的表达。
如此众多种类的mRNA反转录产物经PCR选择扩增后其类型依然为数众多，很难用电泳系统加以快速准确地分离。
因而需要对反转录产物cDNA进行归类处理，减轻不同PCR产物电泳分离的难度，提高分离的准确率。
（见示意图）
一、实验流程：
对照组的总RNA提取
mRNA完整性鉴定
实验组的总RNA提取
↓↓
锚定引物逆转录成cDNA
采用随机引物和逆转录引物进行选择性PCR扩增
扩增产物进行凝胶电泳分析
差异性条带的回收与第二次扩增
Northern杂交，Southern杂交再次确定差异性条带的真实性
差异性条带的克隆、测序、分析，DNA及氨基酸序列联机检索
以差异性条带为探针克隆出基因组文库中的基因
序列及cDNA文库中的全长cDNA序列
基因功能的鉴定：
①knockout
②dominantnegativemutation
③原核系统或真核系统中的表达翻译。
抗体的制
备，细胞内的定位，抗体抑活等等。
④onehybrid判断出该基因的“启动”基因。
⑤twohybrid判断出该基因的产物的作用途径。
这里以CLONTECH公司生产的DeltaTMDifferentialDisplayKit为例，介绍具体的实验步骤。
该试剂盒中含有10种任意引物和9种Oligo（dT）引物。
操作步骤
1．总RNA的提取（见Northern杂交）
2．第一链合成：
（1）总RNA样品2μg；
cDNA合成引物1μl；
加ddH2O补至5μl。
将管标号为1A,2A,PCA等。
PC为阳性对照。
（2）混匀后稍离心。
（3）70℃孵育3min，冰浴2min后稍离心。
（4）准备dNTPmix（以5管为例）
每管5管
5×
第一链缓冲液2μl10μl
dNTPmix（各5mM）2μl10μl
MMLV逆转录酶（200u/μl）1μl5μl
总体积5μl25μl
（5）每管加入5μl，混匀后稍离心。
（6）42℃孵育1hr。
（7）75℃10min终止反应后置冰上，稍离心。
（8）将2μl反应液分别转至新管中（新管标号为1B,2B,PCB等）。
（9）将78μlddH2O分别加入B管中,混匀。
（10）将72μlddH2O分别加入A管中，混匀。
（11）将所有cDNA稀释液-20℃保存待用。
3．dd-PCR:
以引物P1,T9为例说明
（0.5mlPCR管,1代表对照组,2代表实验组）
管号cDNA样品引物
（1）1AP1,T9
（2）1BP1,T9
（3）2AP1,T9
（4）2BP1,T9
（5）H2OP1,T9
（6）RNA1P1,T9
（7）RNA2P1,T9
以下为阳性对照反应体系
（8）PC1AP10,T8
（9）PC1BP10,T8
（10）PC2AP10,T8
（11）PC2BP10,T8
（12）H2OP10,T8
（13）PCRNA1P10,T8
（14）PCRNA2P10,T8
在PCR管中加入:
①cDNA样品1μl
P引物1μl
T引物1μl
②准备其它PCR试剂的混合液:
（在另一管中加入）
成分每管（μl）所需管数（n=14）
buffer2.02n
ddH2O14.014n
dNTPmix0.20.2n
α-32PdATP0.40.4n
Taq酶0.40.4n
终体积17.017n
混匀后稍离心。
③将17μlPCR混合液加入各反应管，则各管总体积为20μl。
④开始PCR扩增。
⑤PCR循环参数：
在GeneAmpPCRSystems2400&
9600扩增仪上执行以下程序：
94℃5min
1cycles40℃5min
68℃5min
94℃30sec
2cycles40℃30sec
68℃5min
94℃20sec
23cycles40℃30sec
68℃2min
1cycles68℃7min。
⑥反应结束后置-20℃保存备用。
4．电泳和放射自显影
（1）配制6%变性聚丙烯酰胺凝胶，灌注测序板。
（2）预电泳30min。
（3）每个dd-PCR反应取出5μl于一新微量离心管中，加5μlloading
buffer，混匀，离心，置94℃变性2min。
立即置冰浴。
（4）停止预电泳，冲洗加样孔。
（5）加样2μl。
70W电泳2.75hr至二甲苯青到达胶的底部。
（6）下胶：
（同测序胶）
（7）干胶：
在胶表面覆上保鲜膜，80℃干胶30min。
（8）X光片-70℃曝光过夜或更长时间（根据射线强度而定）。
图2-6显示了dd-PCR放射自显影的X光片
5．差异条带回收再扩增
（1）X光片经D72显影、酸性定影液定影后，水洗晾干。
置X光片灯上比较寻找差异条带。
用一次性手术刀片在胶上切割差异条带，加ddH2O20μl，沸水浴15min，离心取上清为模板。
（3）以原引物扩增：
回收DNA7μl
PCRbuffer5μl
5mMdNTPmix0.5μl
引物P2.5μl
引物T2.5μl
Taq酶2μl
加ddH2O至总体积为50μl
执行PCR程序:
93℃3min；
93℃1min→60℃1min→68℃2min，20次循环；
68℃5min。
取PCR产物10μl2%琼脂糖电泳检测。
PCR产物乙醇沉淀，10μlddH2O溶解。
6．以PCR产物为探针，标记后进行Northern杂交，证实基因的真实性。
7．PCR产物的TA克隆。
8．DNA序列测定。
9．检索分析。
mRNA的分离与纯化
真核细胞的mRNA分子最显著的结构特征是具有5’端帽子结构（m7G）和3’端的Poly（A）尾巴。
绝大多数哺乳类动物细胞mRNA的3’端存在20-30个腺苷酸组成的Poly（A）尾，通常用Poly（A+）表示。
这种结构为真核mRNA的提取，提供了极为方便的选择性标志，寡聚（dT）纤维素或寡聚（U）琼脂糖亲合层析分离纯化mRNA的理论基础就在于此。
mRNA的分离方法较多，其中以寡聚（dT）-纤维素柱层析法最为有效，已成为常规方法。
此法利用mRNA3’末端含有Poly（A+）的特点，在RNA流经寡聚（dT）纤维素柱时，在高盐缓冲液的作用下，mRNA被特异地结合在柱上，当逐渐降低盐的浓度时或在低盐溶液和蒸馏水的情况下，mRNA被洗脱，经过两次寡聚（dT）纤维柱后，即可得到较高纯度的mRNA。
寡聚（dT）纤维素柱纯化mRNA
一、试剂准备
1．3M醋酸钠（pH5.2）
2．0.1MNaOH
3．1×
上样缓冲液：
20mMTris-HCl（pH7.6）；
0.5MNaCl；
1MEDTA（pH8.0）；
0.1%SLS（十二烷基氨酸钠。
配制时可先配制Tris-HCl（pH7.6）、NaCl、EDTA（pH8.0）的母液，经高压消毒后按各成分确切含量，经混合后再高压消毒，冷却至65℃时，加入经65℃温育（30min）的10%SLS至终浓度为0.1%。
4．洗脱缓冲液：
10mMTris-HCl（pH7.6）；
1mMEDTA（pH8.0）；
0.05%SDS
5．无水乙醇、70%乙醇
6．DEPC
二、操作步骤
1．将0.5-1.0g寡聚（dT）-纤维悬浮于0.1M的NaOH溶液中。
2．用DEPC处理的1ml注射器或适当的吸管，将寡聚（dT）-纤维素装柱0.5-1ml，用3倍柱床体积的DEPCH2O洗柱。
3．使用1×
上样缓冲液洗柱，直至洗出液pH值小于8.0。
4．将RNA溶解于DEPCH2O中，在65℃中温育10min左右，冷却至室温后加入等体2×
上样缓冲液，混匀后上柱，立即收集流出液。
当RNA上样液全部进入柱床后，再用1×
上样缓冲液洗柱，继续收集流出液。
5．将所有流出液于65℃加热5min，冷却至室温后再次上柱，收集流出液。
6．用5-10倍柱床体积的1×
上样缓冲液洗柱，每管1ml分部收集，OD260测定RNA含量。
前部分收集管中流出液的OD260值很高，其内含物为无Poly（A）尾的RNA。
后部分收集管中流出液的OD260值很低或无吸收。
7．用2-3倍柱容积的洗脱缓冲液洗脱Poly（A+）RNA，分部收集，每部分为1/3-1/2柱体积。
8．OD260测定Poly（A+）RNA分布，合并含Poly（A+）RNA的收集管，加入1/10体积3MNaAc（pH5.2）、2.5倍体积的预冷无水乙醇，混匀，-20℃放置30min。
9．4℃离心，10000g×
15min，小心吸弃上清。
用70%乙醇洗涤沉淀。
[注意：
此时Poly（A+）RNA的沉淀往往看不到]。
4℃离心，10000g×
5min，弃上清，室温晾干。
10.用适量的DEPCH2O溶解RNA。
1．整个实验过程必须防止Rnase的污染。
2．步骤（4）中将RNA溶液置65℃中温育然后冷却至室温再上样的目的有两个，一个是破坏RNA的二级结构，尤其是mRNAPoly（A+）尾处的二级结构，使Poly（A+）尾充分暴露，从而提高Poly（A+）RNA的回收率；
另一个目的是能解离mRNA与rRNA的结合，否则会导致rRNA的污染。
所以此步骤不能省略。
3．十二烷基肌氨酸钠盐在18℃以下溶解度下降，会阻碍柱内液体流动，若室温低于18℃最好用LiCl替代NaCl。
4．寡聚（dT）-纤维素柱可在4℃贮存，反复使用。
每次使用前应该依次用NaOH、灭菌ddH2O、上样缓冲液洗柱。
5．一般而言，107哺乳动物培养细胞能提取1-5μgPoly（A+）RNA，约相当于上柱总RNA量的1%-2%。
NorthernBlot
继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。
这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。
与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。
但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；
此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。
虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。
一、试剂准备
0.5MEDTA:
EDTA16.61g加ddH2O至80ml,调pH至8.0,定容至100ml。
2．50mMNaAc:
NaAc3.4g加ddH2O至500ml,加DEPC0.5ml,振荡,37℃过夜，高压灭菌。
3．5×
甲醛凝胶电泳缓冲液:
MOPS[3-（N-玛琳代）丙磺酸]10.3g加50mMNaAc400ml,用2NNaOH调pH至7.0,再加入0.5MEDTA10ml,加DEPCH2O至500ml。
无菌抽滤，室温避光保存。
4．20×
SSC:
NaCl175.3g、柠檬酸三钠88.2g，加ddH2O至800ml，用2NNaOH调pH至7.0，再用ddH2O定容至1000ml。
DEPC处理、高压灭菌。
5.6×
20×
SSC300ml加ddH2O至1000ml。
DEPC处理,高压灭菌。
6．50×
Denhardt:
聚蔗糖0.5g、聚乙烯吡咯烷酮0.5g、牛血清白蛋白（BSA）0.5g加ddH2O至50ml,无菌抽滤、分装。
7．1MNa2HPO4:
Na2HPO4·
12H2O35.81g,加ddH2O至100ml。
8.1MNaH2PO4:
NaH2PO4·
2H2O15.6g,加ddH2O至100ml。
9.0.1M磷酸钠缓冲液（pH6.6）:
Na2HPO435.2ml加NaH2PO464.8ml。
10.STE缓冲液:
1MTris-HCl（pH8.0）2.5ml,0.5MEDTA,0.5ml,5MNaCl5ml，加ddH2O至250ml。
11.预杂交液:
SSC5ml,甲酰胺10ml,50×
Denhardt4ml,1M磷酸钠缓冲液0.2ml（pH6.6）,10%SDS1ml,总体积20ml。
临用前加入变性鲑鱼精DNA（10mg/ml）,使终浓度为4μl/ml。
12.DEPCH2O:
1000mlddH2O中加入DEPC1ml，充分振荡，37℃过夜，高压灭菌。
1.总RNA提取：
见相关内容。
变性胶的制备：
取琼脂糖0.2g，加入DEPCH2O12.4ml，加热熔化，于保温状态下加入5×
甲醛凝胶电泳缓冲液4.0ml、37%甲醛3.6ml，混匀、制胶。
待胶凝固后，置1×
甲醛凝胶电泳缓冲液中预电泳5min。
3.样品制备：
取总RNA4.5μl（约20-30μg），加入5×
甲醛凝胶电泳缓冲液4.0μl、37%甲醛3.6μl、甲酰胺10μl，65℃温育15min、冰浴5min。
加入EB（1μg/μl）1μl、上样缓冲液2μl。
4.电泳：
上样，50V电泳（电泳时间约2hr左右）。
电泳结束后将胶块置紫外灯下，观察RNA的完整性，记录18S、28S条带的位置（离加样孔的距离）。
将RNA从变性胶转移到硝酸纤维素膜或尼龙膜：
（1）按胶块大小剪取膜一张，用DEPC水中浸湿后，置于20×
SSC中浸泡1hr。
剪去膜一角。
（2）将胶块切去一角，并在20×
SSC浸泡15min×
2次。
（3）用长和宽均大于凝胶的一块有机玻璃板作为平台，将其放入大的干烤皿上，上面放一张Whatman3MM滤纸，倒入20×
SSC使液面略低于平台表面，当平台上方的3MM滤纸湿透后，用玻棒赶出所有气泡。
（4）将凝胶翻转后置于平台上湿润的3MM滤纸中央，3MM滤纸和凝胶之间不能滞留气泡。
（5）用Parafilm膜围绕凝胶四周，以此作为屏障，阻止液体自液池直接流至胶上方的纸巾。
（6）在凝胶上方放置预先已浸湿的尼龙膜，排除膜与凝胶之间的气泡。
（7）将二张已湿润的、与凝胶大小相同的3MM滤纸置于膜的上方，排除滤纸与滤膜之间的气泡。
（8）将一叠（5-8cm厚）略小于3MM滤纸的纸巾置于3MM滤纸的上方，并在纸巾上方放一块玻璃，然后用一个重约500克的重物压在玻璃板上。
其目的是建立液体自液池经凝胶向膜上行流路，以洗脱凝胶中的RNA并使其聚集在膜上。
6.使上述RNA转移持续进行15hr左右。
在转膜过程中，当纸巾浸湿后，应更换新的纸巾。
7.转移结束后，揭去凝胶上方的纸巾和3MM滤纸。
将膜在6×
SSC中浸泡5min，以去除膜上残留的凝胶。
8.将凝胶置紫外灯下，观察胶块上有无残留的RNA。
9.膜置80℃，真空干烤1-2hr。
烤干后的膜用塑料袋密封，4℃保存备用。
10.探针标记（Prime-a-GeneLabelingSystem,Promega公司）：
（1）
取模板DNA25ng于0.5ml离心管中，95-100℃变性5min，冰浴5min。
（2）
dNTPmix的制备:
取dGTP1μl、dATP1μl、dTTP1μl混匀。
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