樱桃不同砧木抗寒性比较资料Word格式.docx
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为此，本文对6种大樱桃砧木的抗寒性进行比较及对抗寒性生理指标进行筛选。
1材料与方法
1.1试验材料
试验材料取自天水师范学院植物园的6种砧木，分别为莱阳矮樱桃、马扎德、考特（colt）、北京砧木、毛樱桃、四川砧木。
1.2试验处理与方法
试验共设6个处理，即每品种为一个处理，重复3次。
方法：
于砧木萌芽前（3月上旬）将6种砧木的枝条分成相等的4份，其中一份置室外（10℃）为对照.，其余3份作为重复。
将枝条剪成40cm左右的长度，枝条末端进行蜡封。
处理温度从4℃~-16℃，降温速度为4℃/h,达到后-16℃维持12h，然后逐步升温，升温速度亦为4℃/h，至4℃时进行测定各项生理指标。
1.3测定的指标与方法
1.3.1质膜透性测定
称取5g冷冻处理后直径为0.5cm的一段枝条，放入锥形瓶中，加入50mL蒸馏水，25℃下浸泡12h，中间不断摇动。
12h后摇匀，用DDS-307A型电导仪测定电导。
然后封口，在沸水中煮30min，冷却到室温（25℃）后摇匀，再测终电导。
相对电导率（%）=（初电导-蒸馏水电导率）/（终电导-蒸馏水电导率）×
100%[8]。
1.3.2超氧物歧化酶（SOD）活性测定
（1）酶液提取：
每处理取粗度较一致的枝段，剪碎混匀，称1g，分别加入10mL磷酸缓冲液，冰浴研磨后，转入离心管，10000r/min，离心15min，上清液即为酶液。
（2）SOD活性的测定：
以SOD抑制剂NBT（氮蓝四唑）在光下还原程度来确定SOD的活性大小。
活性单位以抑制NBT光化还原的50%为1个酶活性单位表示。
对照是以缓冲液代替酶液。
SOD活性计算公式：
SOD活性=（ACK-AE）*V*2/（ACK*W*Vt）式中：
SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；
比活力单位以酶单位/mg蛋白表示；
ACK—照光对照管的光吸收值；
AE—样品管的光吸收值；
V—样液总体积（cm3）；
Vt—测定时样品用量（cm3）；
W－样重（g）。
1.3.3过氧化氢酶（CAT）活性的测定
取剪碎的样品2.5g加入磷酸缓冲液（pH7.8）少量，研磨成匀浆，转移到50ml容量瓶中，将研钵冲洗干净，冲洗液转至容量瓶中，并用同一缓冲液定容，4000×
g离心10min，上清液为酶粗提液。
取50ml三角瓶4个（两个测定，两个对照），测定加入酶液2.5ml，对照为煮死酶液2.5ml；
再加入2.5ml0.1mol/LH2O2，同时计算时间，于30℃恒温水浴中反应10min，立即加入10%H2SO42.5ml。
然后用0.1mol/LKMnO4滴定，至出现粉红色（30min内不消失）为终点。
酶活性用每克鲜重样品在10min内分解H2O2毫克数表示。
酶活性（mgH2O2/gFW）=（对照KMnO4滴定ml数-酶反应后KMnO4滴定ml数）*酶提取液总量（ML）*1.7/[反应所用酶液量（ml）*样重（g）[9]。
1.3.4过氧化物酶（POD）活性测定及同工酶分析
1.3.4.1过氧化物酶（POD）活性测定
将样品剪碎，称取1g，加入酶提取液（0.1MpH8.5Tris-HCl缓冲液）5ml和少量石英砂，在研钵中磨碎，然后再次加入5ml酶提取液稀释。
转入离心管在10000r/min的速度下离心15min，上清液贮于冰箱中待用。
测定前，将酶液稀释400倍。
吸1ml酶液，加入2ml联苯胺醋酸－醋酸钠缓冲剂，在28～32℃水浴中保温5分钟。
测定时，加入1ml0.1M过氧化氢，立即摇匀，并转入比色皿中，用分光光度计在波长580nm下测定光密度的变化。
从加入过氧化氢起计时，每15s读数一次。
取第15～45s之间的光密度变化，计算样品中过氧化物酶活性[9]。
其计算公式：
E=O.D.（45-15）*2*总稀释倍数/样品质量（mg），E单位为△O.D./mgF.W./Min。
1.3.4.2过氧化物酶同工酶分析
用聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳技术分离POD同工酶[9]。
按7%的分离胶进行配制，先用刻度吸管准确地吸取30%Acr-0.8%Bis4.5ml和1MTris-HCl（pH8.8）15ml，再加入1%过硫酸铵溶液0.5ml和TEMED20μl，摇匀后，将凝胶加入凝胶板模具内，上面加一水层，在25～30℃的地方进行聚胶，约1h。
浓缩胶按3%进行配制，吸去分离胶上层的水层,用刻度吸管准确吸取30%Acr-0.8%Bis1.0ml和1MTris-HCl（pH6.8）1.0ml，再加入重蒸水7.7ml加入1%过硫酸铵溶液0.5ml和TEMED20μl，立即灌注隔层胶（凝胶板需要迅速加入蓖子），其中加一水层，约1h可聚合好。
样品制备：
每克鲜样加3.0ml0.1mol/L的磷酸缓冲液（pH＝7.0），研磨，用纱布粗过滤，滤液离心：
4000r/min，（0±
2）℃，取上清液作供试酶液。
用10伏/厘米预电泳三分钟后，用微量进样器吸取样品液分别每管加入50微升。
染色：
将脱下的凝胶，用去离子水冲洗凝胶板后，放入长方型白瓷盘中染色。
将配好的染色液倒入白瓷盘内凝胶板上，37℃保温30min，酶带呈紫红色。
取出漂洗后，7%醋酸中保存、照相。
参照全妙华[10]介绍的方法计算相对迁移率Rf值，迁移率（Rf）=酶带迁移距离/溴酚蓝迁移距离。
并应用Vaughan[11]的方法计算酶谱距离（酶谱相似性系数），即酶谱距离=两分类群不相同酶带数/两分类群酶带总数，最后计算相似率。
1.3.5丙二醛含量的测定
称取样品１g，加入2ml10%三氯乙酸（TCA）和少量石英砂，研磨至匀浆，再加8mlTCA进一步研磨，匀浆在4000×
g离心10分钟，上清液为样品提取液。
吸取离心的上清液2ml（对照加2ml蒸馏水），加入2ml0.6%硫代巴比妥酸（TBA）溶液，混匀物于沸水浴上反应15min，迅速冷却后再离心。
取上清液测定532nm、600nm和450nm波长下的吸光度。
计算公式如：
MDA的含量（nmol/gFW）=[6.45×
（D532nm-D600nm）-0.56×
D450nm]×
提取液体积（mL）/组织鲜重（g）。
式中光密度值为在532、450、600nm的吸光度值[12]。
1.3.6可溶性糖含量的测定
将样品剪碎混匀，称取0.5g，取样3份。
分别放入3支刻度试管中，加入10ml蒸馏水，塑料薄膜封口，于沸水中提取30min（提取2次），提取液过滤入50ml容量瓶，吸取0.5ml样品液于20ml刻度试管中（重复2次），加蒸馏水1.5ml，加入0.5ml蒽酮乙酸乙酯试剂和5ml浓硫酸，充分振荡，立即将试管放入沸水浴中，逐管均准确保温1min，取出后自然冷却至室温，以空白作参比，在630nm波长下测其光密度，根据标准曲线回归方程求出糖的量。
标准曲线回归方程：
y=0.0788x-0.0801。
按下式计算测试样品的糖含量，可溶性糖含量（%）=[（从回归方程求得糖的量/吸取样品液的体积）×
提取液量×
稀释倍数]/样品干重×
103。
1.3.7脯氨酸含量的测定
在不同低温处理的每个重复中各取1段粗度较一致的枝条，煎碎混匀，称取0.5g,共3份，分别加入3%的磺基水杨酸5mL，在试管（用保鲜膜封口）中加热煮沸15min。
冷却后吸取上清液2mL，加入2mL冰乙酸和3mL茚三酮显色液,再封口煮沸40min。
然后加入5mL甲苯，充分震荡，取上清液用722型分光光度计在520nm处测吸光值，根据标准曲线计算脯氨酸含量[13]。
y=0.2449x+0.0551计算公式如：
脯氨酸含量（μg/g）＝[X×
5/2]/样重（g）。
1.4数据统计分析
采用方差分析进行多重比较。
2结果与分析
2.1不同砧木枝条的相对电导率的比较
表1.1不同砧木枝条的相对电导率方差分析表
Table1.1Ddifferentrootstocksconductivityrateanalysisofvariancetable
差异源
SS
df
MS
F
F0.05
F0.01
不同砧木间
0.249
5
0.04972
13.557**
3.106
5.06
各自砧木内
0.044
12
0.00367
总计
0.293
17
表1.2不同砧木枝条的相对电导率显著性比较（LSD法）
Table1.2Differentbranchesoftherelativeconductivityrootstocksignificantcomparison（LSDmethod）
砧木品种
相对电导度%
差异显著性
Ⅰ
Ⅱ
Ⅲ
平均值
α=0.05
α=0.01
莱阳矮樱桃
83.81
79.97
80.74
81.51
a
A
四川砧木
76.99
81.91
69.96
76.29
ab
毛樱桃
63.85
69.66
63.77
65.76
b
考特（colt）
72.92
63.06
63.55
66.51
B
马扎德
65.51
53.28
43.61
54.13
c
北京砧木
52.13
44.33
45.88
47.45
C
由表1.1可看出：
不同品种枝条的相对电导率存在极显著差异性,其变化范围为81.85%-47.45%，进一步用LSD法进行多重比较表明（表1.2），莱阳矮樱桃、四川砧木、考特（colt）与毛樱桃、马扎德、北京砧木的差异性极显著；
莱阳矮樱桃和四川砧木没有显著差异性；
四川砧木、毛樱桃和考特（colt）在同一水平；
马扎德和北京砧木没有差异性。
据前人研究表明[14,15,16]先后用电导法测定苹果砧木抗寒性得到一致结果，试验均表明：
经低温冷冻导电性越大的，细胞膜受到伤害越重，其抗寒力越弱，实验室测定结果与砧木田间越冬表现趋势一致，电导法可以成为抗寒性的一种可靠的鉴定方法[17]。
因此，供试的6个测试品种的抗寒性强弱依次为马扎德、北京砧木>
四川砧木、毛樱桃、考特（colt）>
l莱阳矮樱桃。
2.2不同砧木枝条可溶性糖含量的比较
表2.1不同砧木枝条的可溶性糖方差分析表
Table2.1Differentbranchesofthesolublesugarstockanalysisofvariancetable
22.632
4.526
7.4469**
3.1059
7.294
0.608
29.926
表2.2不同砧木枝条的可溶性糖含量显著性比较（LSD法）
Table2.2thedifferentbranchesoftherootstocksignificantlysolublesugarcontentincomparison
可溶性糖含量mg/gFW
8.143
7.859
7.778
7.927
AB
6.235
6.052
6.133
6.140
5.676
5.108
5.297
6.793
6.600
5.778
6.390
8.559
8.336
6.366
7.754
9.057
6.935
9.361
8.451
由表2.1可看出：
枝条的可溶性糖含量存在极显著差异性，其变化范围是2.297mg/g-8.451mg/g，进一步用LSD法进行多重比较表明（表2.2），北京砧木与四川砧木、毛樱桃、考特（colt）有极显著差异性；
莱阳矮樱桃、马扎德、北京砧木差异性不显著；
四川砧木、毛樱桃、考特（colt）在同一水平。
糖在植物抗寒生理中，可以提高细胞液浓度、降低冰点，可以缓和细胞质过度脱水，保持细胞不致遇冷凝固，从而提高植物抗寒性[18]，可溶性糖含量越高，植物抗寒性越强[19,20,21,22]。
因此，供试的6个砧木品种的抗寒性强弱不同，抗寒性依次为莱阳矮樱桃、马扎德、北京砧木>
四川砧木、毛樱桃、考特（colt）。
2.3不同砧木枝条脯氨酸含量的比较
表3.1不同砧木枝条的脯氨酸含量方差分析表
Table3.1Differentbranchesoftheprolinecontentofstockanalysisofvariancetable
F0.05
F0.01
9.366
1.873
12.037**
4.387
8.750
0.934
6
0.156
10.299
11
表3.2不同砧木枝条的脯氨酸含量显著性比较（LSD法）
Table3.2Differentbranchesoftheprolinecontentrootstocksignificantcomparison
脯氨酸含量μg/gFW
4.040
4.918
4.479
4.816
4.878
4.847
4.081
4.714
4.398
2.918
3.244
3.081
4.673
4.122
2.121
2.652
2.387
由表3.1可得出：
枝条的脯氨酸含量存在极显著差异，其变化范围是2.387μg/g-4.847μg/g，进一步用LSD法进行多重比较表明（表3.2），可看出四川砧木与考特（colt）北京砧木差异性极显著；
马扎德、莱阳矮樱桃、四川砧木、毛樱桃差异性不显著；
北京砧木、考特（colt）在同一水平；
脯氨酸常被认为是植物逆境下的产物[22]。
一般认为，低温胁迫往往伴随着脯氨酸含量的增加。
游离脯氨酸能促进蛋白质的水合作用，它能维持细胞结构，调节渗透压，在低温胁迫时使植物具有一定抗性。
本试验中脯氨酸的积累与樱桃砧木的抗寒性有一定相关性。
因此，供试的6个砧木品种的抗寒性强弱不同，抗寒性依次为马扎德、莱阳矮樱桃、四川砧木、毛樱桃>
北京砧木、考特（colt）。
2.4不同砧木枝条丙二醛含量的比较
表4.1不同砧木枝条的丙二醛含量方差分析表
Table4.1DifferentbranchesoftherootstockMDAanalysisofvariancetable
518.964
103.793
8.839**
3.10
140.913
11.743
659.878
表4.2不同砧木枝条的丙二醛含量显著性比较（LSD法）
Table4.2DifferentbranchesoftherootstockMDAsignificantcomparison
丙二醛含量μg/gFW
17.809
13.136
15.918
15.621
11.712
20.436
21.591
17.913
bc
26.077
24.967
30.087
27.044
25.272
20.355
25.609
23.745
18.342
13.821
19.087
17.083
25.995
31.644
32.175
29.938
由表4.1可看出：
枝条的丙二醛含量存在极显著差异性，其变化范围是15.621μg/g-29.938μg/g，进一步用LSD法进行多重比较表明（表4.2），马扎德、四川砧木、莱阳矮樱桃与北京砧木、考特（colt）、毛樱桃差异性极显著；
北京砧木和毛樱桃的丙二醛含量差异性不显著；
四川砧木、考特（colt）的丙二醛含量在同一水平；
马扎德、莱阳矮樱桃的丙二醛含量没有差异性；
许多研究认为，植物材料中的丙二醛含量可以用来评价植物的抗寒性[6]。
植物器官衰老或在逆境条件下往往发生膜脂过氧化作用，其产物丙二醛会严重损害生物膜。
通常利用它作膜脂过氧化指标，表示细胞膜脂过氧化程度及对逆境的强弱，丙二醛含量高说明植物抗寒性弱，反之,则抗寒性强[20，21]。
因此，供试的6个砧木品种的抗寒性强弱不同，抗寒性依次为马扎德、莱阳矮樱桃>
四川砧木和考特（colt）>
北京砧木和毛樱桃。
2.5不同砧木枝条超氧化物歧化酶（SOD）活性的比较
表5.1不同砧木枝条的SOD活性方差分析表
Table5.1DifferentstockbranchSODactivevarianceanalyticaltable
52344.37
10468.87
25.67**
4893.826
407.82
57238.2
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