细胞生物学实验教学指导书Word格式.docx
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温度
效果*
小麦
42
0.2%秋水仙素水溶液
9:
00-11:
00
25℃
+++
小麦
对二氯苯饱和水溶液
10:
00-14:
室温
1～4℃冰箱
20-24小时
1～4℃
小黑麦
56
豌豆
14
30
烟草
48
8:
30-11:
蚕豆
12
0.05～0.1%秋水仙素水溶液
20:
00-23:
14:
30-17:
8℃
洋葱
16
7:
15℃
茄子
24
0.002M8-羟基喹啉
00-13:
大麦
++
*+++优++良。
（三）固定通常采用的是卡诺氏固定液。
固定的目的是用化学的方法把细胞迅速杀死，使蛋白质变性，并尽量保持原来的分裂状态，同时更易于着色。
固定时，将根尖投入固定液中室温处理3～24小时。
材料若不及时用，可经过90%酒精和70%酒精浸洗一次，再换入新的70%酒精中，置于冰箱内0～4℃保存备用。
经过较长时间保存的材料，在进行观察前可用固定液再处理一次，效果较好。
（四）解离目的是使分生组织细胞之间的果胶质层解掉，并使细胞壁软化，便于压片。
解离的时间视根尖的粗细老嫩不同而有差异。
方法是：
将固定后（或保存后）的根尖分装到青霉素小瓶子内，用清水洗几次，吸干水，加入1NHCl溶液，在60℃下水解8～20分钟（洋葱用8分钟，蚕豆侧根用10分钟，玉米用20分钟），解离成功的根尖，分生组织发白，伸长区已呈半透明，似烂状。
解离后的根尖用水轻洗2～3次，以利于着色。
（五）染色、压片将解离后的根尖放在凹面玻片内（根尖较长的切除伸长区部位），滴加改良苯酚品红染色液染色10分钟左右。
制片时，取一根尖放在洁净的载玻片上，用刀片切取1mm左右的生长区，其余部分弃掉，加半滴染色液，加盖玻片。
用镊子在材料的地方轻压几下，使生长区的细胞分散开来，再在盖玻片上覆盖一层吸水纸，用解剖针或铅笔上的橡皮头敲击根尖部位，重复几次，力一次比一次大，以盖玻片不破裂为准。
（六）观察将制好的标本片，置于显微镜下先作低倍观察，选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意核及染色体的动态变化。
（七）永久装片由临时压片材料做成永久玻片标本，一般以正丁醇法最为简单可靠。
步骤如下，取四个大培养皿，分别装入下列溶液：
1．
3/495%酒精+1/4冰醋酸
5～10分钟
2.
2/395%酒精+1/3正丁醇
3分钟
3.
1/395%酒精+2/3正丁醇
4.
纯正丁醇
最后用加拿大树胶封片
有丝分裂（Feulgen染色法）
一、实验原理：
细胞中的DNA受1NHC1，60℃水解作用以后，核酸中的嘌呤碱很快完全被除掉，使脱氧核糖中潜在的醛基获得自由状态。
水解后，组织要经水洗再移至希夫（Schiff）试剂中，希夫试剂即同露出来的醛基发生反应，呈现紫红色。
这个反应是Feulgen在1942年提出来的，是DNA的一个特异性检查法。
水解的时间很重要，因为核酸的水解有两个过程，第一，漂呤碱很快被除掉，脱氧核糖中潜在的醛基显露出来，第二，组蛋白和核酸愈来愈多地被除掉。
在短时间的水解作用以后，第一个过程占优势，这时候用希夫试剂染色，染色体的染色作用最强。
随着水解作用的继续进行，第二个过程逐渐变成优势，因此水解液中的希夫反应增强，而染色体中的希夫应减弱。
最后，第二个过程超过第一过程时，染色体也随之停止反应。
希夫试剂是碱性品红———亚硫酸溶液，呈无色。
与DNA醛基反应后，使碱性品红恢复原来的红色。
二、实验目的：
观察蚕豆根尖细胞或其它根尖细胞内染色体中的DNA，以及染色体在有丝分裂中的行为，掌握Feulgen染色方法。
三、实验材料：
上次实验制成了石蜡切片。
四、实验准备：
1．用具立式染色缸一套，镊子，盖玻片，小漏斗，铁架，毛边纸，玻璃棒，显微镜，恒温水浴锅，温度计，烧杯，棕色瓶，黑纸。
2．玻璃器皿的清洗主要是染色缸的清洗，一般用肥皂粉洗，用水冲净即可，如不能洗净时，要用洗液浸泡后，再冲洗，自来水洗后，再用少量蒸馏水过洗一次。
盛放100%酒精、二甲苯的染色缸必须干燥，缸盖内缘必须涂以几士林，以防止蒸发和收水分，影响浓度。
染色缸上要贴上标签。
3．实验所需药口及配制
浓盐酸（36—38%），碱性品红，偏重亚硫酸钠（Na2S2O5）;
亚硫酸钠（Na2SO3）,固绿（fastgreen），加拿大中性树胶乙醇（30—100%），二甲苯。
药品配制：
1各种浓度的乙醇配制.
21NHCI配制：
取浓HCI82.5毫升加蒸馏水至1000毫升，摇匀。
3Shiff试剂的配制
0.5克碱性品红，加到已经煮沸的100毫升蒸馏水中，再煮沸3—4分钟，待溶液冷却到50℃时过滤，再等溶液冷到25℃以下时，加入10毫升的1NHCI和1。
5克偏重亚硫酸钠，装在棕色瓶中，塞紧瓶子，用黑纸包好，放在暗处，第二天观察，溶液还是淡红色就不能用，只得重配。
偏重亚硫酸钠与1NHCI反应，放出SO2，SO2与碱性品红反应，生成碱性品红--亚硫酸溶液，呈无色。
4漂染液的配制
先配10%的亚硫酸钠溶液。
把10%亚硫酸钠溶液10毫升加200毫升蒸馏水，再加10毫升1NHCI，即成漂当液。
5固绿染色液
0.5克固绿溶于100毫升95%乙醇溶液。
五、实验步骤：
2．水解先在恒温水浴箱中准备好恒温60℃的1NHCI。
注意一定要控制好温度不能过高，高了醛基要破坏，低了小解不充分，醛基不能释放出来。
水解的时间长短要根据材料，以及固定液的种类而定。
根据试验结果，取一个适当时间。
因加拿大树胶溶于二甲苯，所以片子一定要经二甲苯透明后才进行封片，操作方法如下：
1.用镊子从二甲苯中取出载玻片，以毛边纸吸干余液。
2.左手开启树胶瓶，右手用瓶中玻璃棒蘸取树胶滴于载玻片上，并随即盖好瓶盖。
树胶的用量视盖玻片大小而定。
要使树胶在盖玻片下满布，不发生过多或不足。
3.镊取洁净盖玻片，以一边浇于载玻片上，然后徐徐放下，使树胶布满盖玻片与载玻片之间。
产生气泡的原因是覆盖太快树胶用量不足，或树胶过稠。
气泡侵入后，妨碍镜检，且使标本褪色。
如有气泡产生，则可以在靠近气泡的一边再滴树胶一滴，然后轻压盖玻片，使气泡逸出。
片子封片后，放在切片木框上，让其自然干燥，即可保存。
植物细胞周期观察
1．学会植物细胞、组织的固定、离析和压片方法，了解并初步掌握制作临时玻片和永久玻片的方法。
2．观察有丝分裂过程中染色体的形态特征和动态变化过程，着重了解分裂期内中、后期染色体变化的特征。
植物根尖分生组织的细胞，依一定的程序有规律地进行着有丝分裂过程，植物种类不同，细胞周期所需时间不同。
每天都有分裂高峰时间，此时把根尖固定，经过染色和压片，再放置在显微镜下进行观察，可以看到大量处于有丝分裂各时期的细胞和染色体。
一些植物根尖细胞的分裂周期（小时）
植物
总时数
G1
S
G2
M
温度（℃）
洋葱
12.7
1.5
6.5
2.4
2.3
24
葱
18.8
2.5
10.3
6.0
23
蚕豆
16.5
3.5
8.3
2.8
1.9
20
黑麦
11.6
1.2
5.2
4.3
0.9
小麦
14.0
0.8
10.0
2.0
玉米
10.5
0.5
5.7
根尖与茎尖是有丝分裂的高发部位，根尖由于取材方便，是观察植物染色体最常用的材料，根尖染色体压片法，是观察植物染色体最常用的方法，也是研究染色体组型、染色体分带、染色体畸变和姊妹染色单体交换的基础。
如果植物种子难以发芽，或仅有植株而无种子，也可以用茎尖作为材料。
实验结果显示：
植物细胞分裂周期的长短不尽相同，通常在十到几十小时之间，温度明显地影响细胞分裂周期，同时不同植物有丝分裂高峰时间不尽相同，洋葱根尖细胞以6点到9点分裂相较多。
适于取材。
大蒜、洋葱的鳞茎或蚕豆的种子
四、实验器具和药品
1．用具：
载玻片，盖玻片，指管，试剂瓶，滴瓶，镊子，解剖针，吸水纸。
2．药品：
无水酒精，冰醋酸，醋酸钠，改良苯酚品红。
五、实验过程
1．材料培养
先剪去洋葱的老根，然后置于盛有水的烧杯上，等不定根长出2cm时，进行预处理；
或将蚕豆等种子经过吸胀处理24小时后，平展于铺有吸水纸的白磁盘中，加入适当量的水，于25℃培养，待侧根长到2cm进行预处理。
2．预处理
预处理可以降低细胞质的粘度，使染色体缩短分散，防止纺锤体形成，使更多的细胞处于分裂中期，一般在分裂高峰前把根尖放到药剂中处理3—4小时。
可利用进行处理的药剂很多，如秋水仙素、对二氯苯、8—羟基喹啉等，也可以经过低温处理以达到同样的效果，较成功的例子主要是一些禾本科的农作物，例如：
小麦、黑麦、大麦用1~4℃，水稻和玉米用6~8℃，均获得较好的效果。
处理方法是将活体或切取根尖侵入自来水或蒸馏水中，放置在冰箱中合适的温度层处理20—40小时。
在野外或无冰箱条件下，可在保温瓶中装一些冰块做低温处理。
处理时机：
当根尖长到1.5cm～2cm左右时进行处理，此时分裂相较多，制片效果好。
另外，各种生物体细胞分裂高峰期也不尽相同，于细胞分裂高峰期取材效果为好。
例如洋葱根尖细胞以上午6—9时左右为分裂高峰期，蚕豆则每日有两个分裂高峰期，分别为上午9时左右和下午2—3左右。
3．取材固定
将预处理后的根尖剪下，放入卡诺固定液，固定2～24小时。
然后依次放入90％、80％和70％酒精溶液，最后保存于70％酒精溶液中放于冰箱中，但保存时间最好不超过2个月。
4．制片：
水洗：
将从保存液中取出的根尖用水冲洗掉酒精；
解离及制片：
解离的目的是使分生组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易分散压平，解离方法有酸解法和酶解法。
酸解法是用盐酸水解根尖，步骤简便、容易掌握，广泛应用于染色体计数、核型分析和染色体畸变的观察。
根尖分生组织经过酸解和压片后，都呈单细胞，但是大部分分裂细胞的染色体还包在细胞壁中间。
将水洗后的根尖放到0．1mol／LHCl中，在60℃水浴中解离8－10分钟，或用浓盐酸：
乙醇＝1：
1混合溶液处理根尖10分钟。
用蒸馏水漂洗酸解后的根尖，放在载玻片上。
将根冠和伸长区以上部位切去，保留分生组织细胞，并将生长点细胞切成细碎组织，根据分生组织的的大小，一般每一根尖可制片3～4片，加上1滴改良苯酚品红染色液，染色10～15分钟。
根尖着色后即可压片观察。
酶解法常用于染色体显带技术或姊妹染色单体交换等项研究，通过解离和压片，使分生细胞的原生质体，能够从细胞壁里压出，再经过精心的压片，使染色体周围不带有细胞质或仅有小量细胞质，易于进行观察。
将水中漂洗过的根尖用刀片切除根冠以及延长区（根尖较粗的蚕豆，可以把根尖分生组织切成2—3片），把根尖分生组织放到醋酸钠配制的纤维素酶（2％）和果胶酶（0．5％）的混合液中，在28℃温箱中解离4—5小时，此时组织已被酶液浸透而呈淡褐色，质地柔软而仍可用镊子夹起，用滴管将酶液吸掉，再滴上0．1mol／L醋酸钠，使组织中的酶液渐渐渗出，再换入45％醋酸。
酶解后的根尖，如作分带或姊妹染色单体交换，可用45％醋酸压片，如作核型分析或染色体计数等常规压片，可放在改良苯酚品红中染色，经过酶处理的组织染色速度快。
一个解离良好的材料，只要用镊子尖轻轻的敲打盖玻片，分生组织细胞就可铺展成薄薄的一层，再用毛边纸把多余的染色液吸干，经显微镜检查后，选择理想的分裂细胞，再在这个细胞附近轻轻敲打，使重叠的染色体渐渐分散，就能得到理想的分裂相。
5．观察：
选择细胞分散、分裂相较多以及染色体形态舒展的制片进行观察。
注意观察细胞有丝分裂各时期特点。
6．封片：
把压好的玻片标本，放在于冰或冰箱结冰器里冻结。
然后用刀片迅速把盖玻片和载玻片分开，用电吹风把玻片吹干后，滴上油派胶加上盖玻片封片，或经二甲苯透明后，滴中性树胶，加盖玻片封片，做成永久封片。
六、注意事项：
1．压片材料要少，避免细胞紧贴在一起，致使细胞和染色体没有伸展的余地；
2．解离时间不可过长，以免染色体结构受损；
3．用镊子敲打盖玻片时，用力要均匀，若在压片时稍不留意，会使个别染色体丢失，而被迫放弃一个良好的分裂相的细胞。
七、附录
1．卡诺固定液的配制：
用3份无水酒精，加入1份冰醋酸（现配现用）
2．酶液的配制：
以0.1ml／L醋酸钠为溶剂，配成纤维素酶（2％）和果胶酶（0．5％）的混和液。
3．酸解溶液：
1N盐酸或浓盐酸和乙醇各一份混合配成。
4．染色液的配制：
4．1配方1．石碳酸品红（Carbolfuchsin），先配母液A和B。
母液A：
称取3克碱性品红，溶解于100毫升的70％酒精中（此液可长期保存）。
母液B：
取母液A10毫升，加入90毫升的5％石碳酸水溶液（2周内使用）。
石碳酸品红染色液：
取母液B45毫升，加入6毫升冰醋酸和6毫升37％的甲醛。
此染色液含有较多的甲醛，在植物原生质体培养过程中，观察核分裂比较适宜，后来在此基础上，加以改良的配方II，称改良石碳酸品红，可以普遍应用于植物染色体的压片技术。
4．2配方II：
改良石碳酸品红
取配方1．石碳酸品红染色液2一10毫升，加入90—98毫升45％的醋酸和1．8克山梨醇（sorbitol）。
此染色液初配好时颜色较浅，放置二周后，染色能力显著增强，在室温下不产生沉淀而较稳定。
八、实验流程图：
培养（根部遮光培养）
↓
预处理
取材
固定
制片：
水洗酸解水洗染色压片
观察（注意观察有丝分裂各时期染色体特征）
减数分裂实验
通过植物花粉母细胞的制片和观察，了解小孢子的形成过程以及减数分裂中染色体的变化情况，并进一步掌握细胞染色体制片的基本技能。
在高等生物里雌雄性细胞形成的过程中，都是先由有性组织（如花药和胚珠、精巢和卵巢）中的某些细胞分化为孢母细胞（2n）,以及精母与卵母细胞（2n）。
进一步由这些细胞进行一种连续二次的减数分裂，即减数第一分裂和减数第二分裂，最终各自产生4个小孢子或精细胞，或是分别产生一个大孢子或卵细胞与三个退化的极体（1n）。
在分裂过程中，可以辩认染色体形态和数量上的动态变化，从而为遗传学研究中远缘杂种的分析、染色体工程中的异系鉴别、常规的核型分析以及三个基本规律的论证，提出了直接与间接的依据。
蚕豆、水稻、玉米等花药。
显微镜、镊子、解剖针、刀片、载玻片、盖玻片、量筒、滴瓶、切片架、切片盒、15cm培养皿、小培养皿、广口瓶、吸水纸。
甲醇、冰醋酸、95%乙醇、无水乙醇、树胶、改良苯酚品红染色液。
（一）取材固定取材的时间及材料大小必须十分恰当，才能获得更多的花粉母细胞分裂相，以供观察。
1．蚕豆 蚕豆现蕾后，于上午7～9时摘取茎顶幼小花序，将周围小叶和苞叶去掉，留长约1mm左右的花苞，放入内装有卡诺氏固定液的广口瓶中，固定3～24小时，转入70%酒精中置冰箱内保存。
2．水稻剑叶与其下一叶的叶枕平齐，即叶枕距为零时取材，早熟品种应适当提前，叶枕距可为负；
晚熟品种应延迟，叶枕距应为正。
通常穗长6～8cm，颖花长3mm为花粉母细胞分裂始期；
穗长13～15cm，颖花长4mm为减数分裂盛期；
穗长达全长，颖花长6mm时为减数分裂终期。
于上午6～9时依上述标准取材，固定保存方法同上。
3．玉米玉米孕穗初期，早熟品种约10片完全展开叶，中熟品种约12～14片展开叶，晚熟品种约14～16片展开叶时取材。
从喇叭口往下捏叶鞘，有松软感觉，即为雄花序所在部位，用刀片纵向划一切口，剖开取出数条花序分枝检查，如果先端小颖花长3～4mm,花药长2～3mm时，花粉母细胞减数分裂相较多，即可取用。
取材时间一般为上午7～9时，固定保存方法同上。
（二）制片方法先将玉米幼穗置于培养皿内，加进少许70%酒精，以防材料变干。
实验时，取某一分枝，从不同部位剥离出颖花放在载玻片上。
用解剖针或镊子剥开颖壳，取出花药，把颖壳清理干净后，用刀片把花药横切二至三段，滴一滴染液，用镊子将花粉母细胞从花药中挤压出来。
先用低倍镜检查，如有所需时期的细胞，即可将花药移到另一块载玻片上，滴上染液，再次将花粉母细胞挤出来，可重复做二至三张片。
待把空的花药壁清除干净后，再盖上盖玻片，换至高倍镜观察。
（三）制作永久切片
减数分裂过程的识别
观察并熟悉减数分裂各个时期的特征以及染色体的变化，为学习遗传基本规律奠定细胞学基础。
二、实验材料及器具
显微镜、若干张玉米减数分裂永久片。
三、实验说明
（一）概述减数分裂是形成性细胞前在性母细胞中进行的一种特殊方式的细胞分裂，在配子形成过程中发生的，是由连续两次细胞分裂所组成的统一过程。
这一过程的特点是，连续进行两次核分裂，而染色体只复制一次，结果形成四个核，每个核只含有单倍数的染色体，即染色体数减少一半，故称减数分裂。
另外一个特点是，前期特别长，而且变化复杂，可以区分细线、偶线、粗线、双线、终变等几个时期。
其中同源染色体将发生配对（联会）、纵裂和交换等现象，逐渐凝缩为二价体，到了中期，排列于赤道板上。
第一次分裂的后期，成对的同源染色体分开，各向两极移动，形成两个子细胞。
接着第二次分裂开始，很快的进入中期和后期，每一染色体的两个染色单体以均等方式分开，分别包在末期子细胞中。
故在两次分裂完成之后，形成四个子细胞中，各具有单倍数的染色体，每一细胞变成一个配子，再进一步发育成配子体。
（二）各分裂时期要点
1．前期Ｉ时间较长且复杂，一般分为下列五个时期
（1）细线期：
第一次分裂开始时，染色质浓缩为若干条细长的细线相互缠绕首尾难分，无法计数。
此时染色体已在分裂周期的Ｓ期复制。
每一染色体已有两个染色单体，但在细线期的染色体上还看不出双重性。
（2）偶线期：
染色体的形态与细线期没有多大变化。
同源染色体之间相互吸引而发生配对，先由两端开始，渐次到中部，这种配对是专一性的。
此时期很短，往往不易找到。
（3）粗线期：
配对的染色体逐渐缩短加粗。
可以数到单倍数目的染色体数，即原来是2n个染色体，经配对后形成几组染色体，每一组含有两条同源染色体，这种配对的染色体叫二价体，每个二价体有两个着丝点。
由于每个染色体早已复制为二，所以配对的每对染色体──二价体,实由四个染色单体所组成,故也称四分体。
同源染色体的非姐妹染色单体之间发生节段互换，从而导致杂合体基因之间的交换与重组。
（4）双线期：
染色体缩得较短较粗。
二价体中的两个同源染色体开始相互排斥而分开，有时能清楚的见到四分体的各条线。
不过在染色体发生互换的地点仍然连在一起，构成交叉结，是染色体发生交换的结果。
在双线期中，交叉数目逐渐减少，在着丝点两侧的交叉向两端移动，这个现象称为交叉移端化，或简称端化。
（5）终变期：
双线期到终变期的过渡表现为染色体继续缩短和交叉移端。
典型的终变期，染色体达到高度的浓缩，同源染色体仍有交叉联系着，所以仍为ｎ个二价体分散在细胞核中。
此时染色体计数最为方便准确。
2．中期Ｉ核膜和核仁已消失，各个二价体排列在赤道板上，成对染色体的着丝点朝向两极，纺缍丝出现，把着丝点拉向两极，从侧面看来，各二价体成排横列在纺缍体中部。
从极面来看，二价体呈分散排列在赤道面上，这时也是鉴别染色体的适当时期。
3．后期Ｉ双价体中的两条同源染色体分开，分别向两极移动。
随着丝点位置不同，后期染色体呈现各种不同的形状（丁形、Ｖ形及棒形等）。
由于此时每个染色体的着丝点尚未分裂，带着两条染色单体，每极各有n个染色体数，所以说在后期Ｉ时染色体发生减数了。
4．末期Ｉ移向两极的染色体又聚合起来，核膜重建，核仁重新形成，接着进行胞质分裂，成为两
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