地高辛标记探针的Southern杂交技术Word文件下载.docx

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2目的要求

掌握Southernblot方法的原理；

掌握随机引物法标记DNA探针，印迹法转移DNA至硝酸纤维素膜及膜处理。

3实验原理

Southern杂交技术是由EdwardM.Southern在1975年首先发明的用于检测DNA的一种核酸杂交技术，并因此而得名。

Southern杂交的原理是将待检测的DNA分子用限制性切酶消化，通过琼脂糖凝胶电泳进行分离，继而将其变性并按照其在凝胶中的位置转移到硝酸纤维素薄膜或尼龙膜上，固定后再与同位素或其他标记物标记的DNA探针进行反应。

如果待测物中含有与探针互补的序列，则二者通过碱基互补原理进行结合，游离的探针洗涤后用显影或其他合适的技术进行检测，从而显示出待检的片段及其相对大小。

Southern印迹杂交技术包括两个主要过程：

一是将待测定核酸分子通过一定的方法转移并结合到一定的固相支持物（硝酸纤维素膜或尼龙膜）上，即印迹（blotting）；

二是固定于膜上的核酸与同位素标记的探针在一定的温度和离子强度下退火，即分子杂交过程。

见图1。

图1.Southernblot印迹杂交原理示意图

（a）核酸切酶消化的基因组DNA；

（b）琼脂糖凝胶电泳分离DNA片段；

（c）凝胶中的DNA谱带转移到硝酸纤维素滤膜上；

（d）滤膜与标记的DNA分子探针杂交；

（e）显色显示杂交的DNA谱带。

Southernblot方法十分灵敏，在理想的条件下，用放射性同位素标记的特异性探针和放射自显影技术，即便每条电泳带仅含2ngDNA也能被清晰地检测出来。

一、实验仪器：

尼龙膜；

恒温水浴，塑料带，剪刀，平头镊子，封口机，烤箱，台式高速离心机，高压灭菌锅，电泳仪，水平电泳槽，微量移液器，摇床，吸水纸，3MMWhatman滤纸，干烤皿，玻璃平台等。

二、溶液配制

1．待检基因组DNA、DIG标记和检测试剂盒、各种限制性切酶等。

2．其他试剂

（1）20XSSC（1000mL）:

组分浓度3.0M的Nacl，0.3M的柠檬酸钠

NaCl175.32g

柠檬酸钠88.26g

NaOH调pH值到7.0，

（2）洗涤缓冲液Washingbuffer200ml

组分浓度：

0.1MMaleicacid,0.15MNacl;

pH7.5（20℃）;

0.3%（v/v）Tween20.

马来酸：

2.32g

Nacl：

1.75g

Tween200.6ml

NaOH固体约1.7g调pH值7.5

（3）马来酸缓冲液Maleicacidbuffer200ml

pH7.5（20º

C）

（4）检测缓冲液Detectionbuffer100ml

0.1MTris-HCl,0.1MNacl,pH9.5（20º

Tris1.21g,

NaCl0.584g

MgCl21.01g

调ph值到9.5

（5）变性溶液（500mL）：

1mol/LNaCl（43.83g）， 

0.5mol/LNaOH（10g），

（6）中和溶液（500mL）：

0.5mol/LTris（30.27g），3mol/LNaCl（87.66g），用1mol/LHCl调

（7）5×

TBE（250mL）：

13.5gTris 

6.9g硼酸,0.9gEDTA-Na2，定容250mL 

（8）6×

溴酚蓝载样液：

0.25％溴酚蓝，40％蔗糖

（9）1MTris-HCl（pH8.0）:

称取12.114gTris-base,溶于80ml蒸馏水中，用HCl调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

（10）0.5MEDTA（pH8.0）:

称取18.61gEDTA，溶于80ml蒸馏水中，用NaOH调pH至8.0后，用蒸馏水定容至100ml，高压灭菌，分装保存。

（11）TEbuffer：

取1MTris-HCl（pH8.0）5ml，0.5MEDTA（pH8.0）1ml，用蒸馏水定容至500ml，调pH至8.0后，高压灭菌，分装保存。

（12）10%SDS：

称取10gSDS，溶于90ml蒸馏水中，68℃加热溶解，用盐酸调pH至7.2，定容至100ml。

（13）低严谨度洗膜液：

将20X的SSC用蒸馏水稀释成2XSSC，并按照100:

1（2XSSC:

10%SDS）加入10%SDS，配成2XSSC0.1%SDS。

（14）高严谨度洗膜液：

将20X的SSC用蒸馏水稀释成0.5XSSC，并按照100:

1（0.5XSSC:

10%SDS）加入10%SDS，配成0.5XSSC0.1%SDS。

（15）BlockingSolution:

用Maleicacidbuffer将6#中的10XBlockingSolution稀释成1X的工作液，现配现用。

（16）AntibodySolution:

将4#试剂离心，按照1:

5000加入BlockingSolution，2-8℃可保存12小时，即每5mlBlockingSolution中加1ulAb抗体，与地高辛标记探针结合。

（17）Colorsubstratesolution（显色液）：

将5#试剂按照1:

50用Detectionbuffer稀释，即从5#中取100ul加入5mlDetectionbuffer，要避光，现配现用，用于显示抗体结合位点。

（18）杂交液DiGEasyHyb：

将64ml无菌去离子水分两部分倒入试剂7#瓶，37º

C摇动溶解5min。

三、基因组DNA的提取、酶切与电泳分离

（1）酶切反应体系

DNA1μg/μl 

15 

μg

10×

酶切buffer 

5μl

限制性切酶（10U/μl） 

6μl 

加ddH2O 

至50 

μl

（2）混匀后于37º

C酶切1-3h，酶切完成后，取3μl 

酶切反应物电泳分析，检测酶切效果

（3）酶切完成后，加入EDTA，65℃加热灭活限制酶,样品即可直接进行电泳分离，必要时可进行乙醇沉淀，浓缩DNA样品后再进行电泳分离。

四、琼脂糖凝胶电泳

（1）用0.5×

TBE配制0.8%的琼脂糖凝胶，凝胶厚度约为0.5cm。

（2）待凝胶充分凝固后，在点样孔中依次加入：

阳性对照：

质粒酶切产物，阴性对照：

水及检测样品。

（3）加入电泳缓冲液至刚好与胶面持平，加100V电压，电泳5min待溴酚蓝进入胶中后，将电压降至80V电泳30min，

（4）电泳结束后，染色，长波紫外线下观察电泳结果，用1保鲜膜覆盖在凝胶上，复制下各分子量参照物及各DNA样品带的位置，在凝胶旁置1标尺照像

五、变性与转膜

（1）将胶浸于4倍体积的变性溶液中，在摇床上温和摇动2×

15min，变性液要能没过胶。

（2）将胶在双蒸水中稍微洗涤，然后放入4倍体积的中和溶液中，在摇床上温和摇动2×

15min，中和液要能没过胶。

（3）转膜：

20×

SSC浸湿一whatman3mm滤纸放在支撑平台上，此平台要比凝胶稍大，形成一个“桥”，凝胶反放在浸湿的whatman3mm滤纸上注意两者之间不能有气泡。

（4）照凝胶的大小剪一硝酸纤维素滤膜/尼龙膜（长，宽略大0.2cm，剪去与凝胶对应的一角）。

膜放在凝胶上。

（5）尼龙膜上放一whatman3mm滤纸（长，宽略小0.2cm）一叠吸水纸、上置一玻璃板，其上放一重约0.2～0.5kg的物品。

在20×

SCC的转移缓冲液中充分转移18～24h及时换掉浸湿的吸水纸。

（6）固定：

将膜在2×

SSC溶液中短暂漂洗，除去过多的盐分，然后DNA结合面朝上，放在一干净的滤纸上晾干后，夹在两层滤纸中间，120º

C烘箱中30min，或者80º

C2h，促进DNA与硝酸纤维素滤膜/尼龙膜结合。

六、预杂交与杂交

（1）预杂交DiGEasyHyb：

C摇动溶解5min，预热一定体积的DiGEasyHyb（10ml/100cm2膜）至杂交温度42º

C。

预杂交60min，在不加探针的情况下，仅将膜放在杂交液中42º

C下充分润湿。

（此过程可以延长至数小时）

（2）探针变性：

Dig标记的探针1ul（约25ng/ml）加40µ

lH2O,95º

C变性10min后迅速放在冰上冷却10min。

（3）杂交：

将变性的探针加入预热的DIGEasyHyb（3.5ml/100cm2）中，混匀，避免泡沫，倒出预杂交液，加入探针和DIGEasyHyb混合液，继续在42º

C下温浴过夜（单拷贝探针）。

含有探针的DiGEasyHyb杂交液可重复利用，杂交结束后放入离心管中于-20º

C保存，可重复使用几次，只需在使用前于68º

C处理10min即可,不要煮沸DiGEasyHyb杂交液

七、洗膜与显色

（1）洗膜：

2×

SSC，0.1%SDS室温下洗涤5分钟，洗2次。

0.5×

SSC，0.1%SDS65-68º

C温和振荡15分钟，洗2次

（2）免疫与显色：

a.杂交和洗膜后，用马来酸缓冲液（WashingBuffer，Buffer1）浸泡1-5min

b.在100ml1×

Blocksolution（Buffer2）中温育30min

c.用1×

Blocksolution（Buffer2）稀释抗体–DIG-抗原偶联物至150mU/ml（1:

5000）

d.用10mlantibodysolution处理膜30min

e.用100ml马来酸洗膜15min，洗2次

f.在20mldetectionbuffer（Buffer3）中平衡2-5min

g.在8ml新鲜配制的colorsubstratesolution中处理膜5分钟，放在塑料袋或盒中，保持黑暗中。

注意不要在显色过程中摇动（颜色沉淀在几分钟开始出现，在16h完成显色反应（在显色过程中膜可在光亮处短暂暴露几次）。

h.5h后斑点出现，可在20ml水中洗膜5min中止反应。

i.结果照像

注意事项

1.膜的大小及预杂交、杂交过程中所用试剂的量可根据需要进行适当调整。

2．将凝胶中和至中性时，要测pH，防止凝胶的碱性破坏硝酸纤维素膜。

3.要注意赶走凝胶和滤纸及硝酸纤维素膜/尼龙膜之间的气泡。

思考题

1．什么是印迹技术？

2．说明什么是探针？

3．简述Southernblot技术的原理及应用。