防腐挑战实验Word格式.docx

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大肠埃希氏菌

镉绿假单胞菌

金黄色葡萄球菌

粪肠球菌

产气肠杆菌

表皮葡萄球菌

日勾维肠杆菌

洋葱假单胞菌

肺炎克雷伯氏菌

恶臭假单胞菌

荧光假单胞菌

表2CTFA化妆品微生物挑战试验的菌株选择

种类

数量

革兰氏阳性菌

至少选一种

发酵革兰氏阴性杆菌

至少选两种

阴沟肠杆菌

变形菌属

非发酵革兰氏阴性杆菌

铜绿假单胞菌

黄杆菌属

不动杆菌属

酵母

近平滑假丝酵母

霉菌

黄绿青霉

产芽孢菌

枯草芽孢杆菌

供选用

生产现场分离菌

适当菌株

一种以上

2.2培养基

牛肉膏蛋白胨培养基、琼脂培养基

2.3试验用菌液的配置

（1）标准悬液的配制

1%硫酸9.9ml与1%氯化钡0.1ml，混合后配制成的悬液浓度为3×

108cfu/ml，此悬液再做3倍稀释。

（2）细菌菌悬液的配制

实验前将菌株接种到各个培养基斜面上，36摄氏度恒温培养48小时。

将已培养好的活性菌种，用灭菌生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀。

用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作稀释，浊度和标准悬液的浊度（3×

108cfu/ml）相同为止；

此时的稀释菌液再做3倍稀释，即为所需的1×

108cfu/ml的菌悬液，做细菌总数确定细菌数。

（3）霉菌菌悬液的配制

将已培养好的活性菌种，用灭菌的生理盐水清洗到灭菌锥形瓶中，充分振荡摇匀；

用移液枪从锥形瓶中吸取菌液作依次的10倍稀释，每次的稀释用血球计数板计数，必须5个中格的霉菌总数在190～210，落在此范围内的菌悬液为我们所需的1×

108cfu/ml的霉菌菌悬液，做霉菌总数确定霉菌数。

2.4接种

2.4.1接种方式

（1）单菌接种：

每种测试菌株单独做一个挑战试验。

这种方法的优点是容易了解每种微生物对防腐体系的敏感性，在筛选产品的防腐体系时有较好的参考价值，但工作量大、费时、费工，和产品的实际污染菌情况也有差距（因来自自然界的微生物常常不是单一的种类）。

（2）混合菌接种：

西欧、德国等的许多国家和企业多采用这种方式，除了因工作量相对较小外，这种接种方法更能代表污染的状况。

2.4.2接种次数和时间

（1）一次接种：

只是在试验开始时接种一次，整个试验周期28天。

（一次加菌的28天微生物挑战实验）

（2）多次接种：

在试验开始接种一次后（重复加菌的微生物挑战实验）

a法：

第21天再接种一次，试验周期为28天。

（有实验表明，第21天接菌和不接菌时，第28天时的微生物含量并无显著的差别，评定结果也相同）

b法：

每隔两周接种一下，连续三次（即第1、3、5周接菌，每两周接菌前分离一次），试验周期为49天；

c法：

每周接种一次，连续5次，试验周期为35天。

M公司的资料介绍，采用此种方法评价认可的防腐体系，可保证产品30个月内的防腐安全）

2.4.3操作方法

称取待测样品30g，对应加入0.3ml浓度为1×

107～1×

108cfu/ml的细菌悬液及霉菌悬液，用干净的无菌勺子搅拌均匀后盖上保鲜膜，细菌在32.5±

2.5℃的培养箱中培养，霉菌在22.5±

2.5℃的培养箱中培养。

a.水溶性样品

10g加入90ml无菌生理盐水，稀释后取1ml样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；

取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml样液加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

b.油溶性样品

取10g样品，加入10ml无菌吐温-80和10ml无菌白矿油，再加70ml无菌生理盐水，用无菌玻棒充分混匀；

吸取1ml已稀释的样品液，加入9ml灭菌生理盐水中，做依次稀释，分别为10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等稀释度；

取三个合适稀释度的样液，分别吸取1ml加入已灭菌的平皿中，做菌落计数，并做两个平行。

2.5培养

细菌放在32.5±

2.5℃的培养箱中培养；

霉菌在22.5±

混合菌在28℃的培养箱中培养。

2.6菌落计数

分别在0、7、14、21、28天分离计算样品中活的细菌、霉菌；

每次计算完细菌总数、霉菌总数后将平皿放回培养箱，以待下次观察用，观察中切勿打开平皿，以免燃菌而使下次无法观察。

菌落计数的标准方法：

①先选取平均菌落数在30～300之间的平皿作为细菌菌落总数测定范围，选取平均菌落数在5～50之间的平皿作为霉菌菌落总数测定范围；

②有两个稀释度在30～300之间，求比值。

若比值≤2，报告平均数；

若比值>

2，以其中较小的稀释度计算细菌总数；

③所有稀释度都大于300，以稀释度最高的平均菌落数计算；

④所有稀释度都小于30，以稀释度最低的平均菌落数计算；

⑤所有稀释度均在30～300之外，其中一个大于300，而相邻的加一稀释度小于30，则以最接近30或300的平均菌落数计算；

⑥若平皿中有连成片状或花点样菌落蔓延生长时，不宜计算；

⑦若片状菌落不到平皿中的一半，而另一半中菌落均匀，则可将此平皿菌落计数后×

2，以报告全皿菌落数。

2.7评价标准

2.7.1CTFA推荐的一次加菌防腐挑战性试验及评价标准

CTFA的方法初始的霉菌和细菌的接种量分别为10000cfu/g（ml）和1000000cfu/g（ml）（CFU为菌落单位），要求在第7天时霉菌降低90%，细菌降低99.9%，并且在28天内菌数持续下降。

2.7.2美国评价标准

在CTFA评价方法的基础上提出的标准，如表3所示。

表3美国所用一次加菌的微生物防腐挑战实验评价标准

评价标准

一次加菌的28天微生物挑战实验

防腐效果优良

若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到100cfu/g（ml）以下，第28天全部为0。

防腐效果勉强通过

若单菌接种的三个平行试验中任何一种微生物数量的平均值，在第七天时下降到1000cfu/g（ml）以下。

防腐效果无效

若单菌接种的任何一种微生物，任何一个平行样达不到上述标准，也达不到CTFA的要求。

2.7.3国内评价标准

国内参照CTFA加菌防腐挑战性评价标准。

表4国内所用微生物防腐挑战实验评价标准

重复加菌的微生物挑战实验

防腐效果优良（W）

第28天化妆品中存货的细菌数量<

10CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较强的抑杀效果。

在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数<

100CFU/ml

防腐效果尚可（M）

100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有一定的抑杀效果。

1000CFU/ml

防腐效果差（P）

第28天化妆品中存货的细菌数量>

100CFU/ml，说明该样品防腐体系对细菌有较差的抑杀效果。

在三次加菌后，在每次加菌的第14天样品中存货的细菌数>

第二部分实验室可采取的方案

金黄葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、大肠埃希氏菌、铜绿假单胞菌、白假丝酵母、枯草芽孢杆菌

牛肉膏蛋白胨培养基

实验前，将各菌株接种于合适的培养基中，于37℃（细菌）和28℃（霉菌）培养箱中培养。

细菌培养2天，霉菌培养5天后，挑选典型的菌落于灭菌的生理盐水中，制成一定浓度的混合细菌（10^8CFU/ml）和霉菌悬液（10^6CFU/ml），置于4℃冰箱储藏备用。

2.4一次加菌的28天微生物挑战实验

量取样品30ml分别加0.3ml混合菌悬液，使得细菌浓度为10^6~10^7CFU/ml，霉菌浓度为10^4~10^5CFU/ml，充分混匀。

将样品在28摄氏度下保存，在接菌0、7、14、21、28d取样品分析含菌量（培养计数法）。

2.6评价标准

附：

实验中所需的仪器和药品

设备名称

需求数量

要求

用途

1

冰箱

易清洁消毒

存放菌种、标准悬液

2

电子秤

样品重量测试

3

浊度仪

检测细菌菌悬液之浓度

4

无菌操作台

微生物实验用，要求等级10000级

5

生化培养箱

细菌、霉菌培养各1台；

保存琼脂为液体状态及紧急烘干器皿，需用1台

6

显微镜

霉菌总数观测用

7

移液枪

100~1000uL

移取菌液用；

备用

8

恒温水浴锅

用于油性样品之充分溶解，规格待定

9

自动灭菌锅

自动

物品灭菌用

10

牛角勺

100

称取样品用；

11

酒精灯

无菌操作台配套用；

12

200ml烧杯

盛装样品用；

13

500ml烧杯

14

150ml

三角烧瓶

15

10ml试管

配备塞子

盛装无菌生理盐水；

16

移液枪枪尖

移液枪配套用；

17

培养皿

200（套）

细菌、霉菌总数测定用；

18

血细胞计数板

霉菌计数用；

19

革兰氏染色

配套盒

革兰氏染色用

20

普通营养琼脂

瓶装

自配培养基用；

21

虎红琼脂

22

氯化钠

分析纯

自配生理盐水用；

23

硫酸

用于配置标准悬液

24

氯化钡

25

保鲜膜

保存样品用；