生物技术大全.docx

生物技术大全.docx

《生物技术大全.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《生物技术大全.docx（33页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。

生物技术大全

一细胞培养技术过程：

1、复苏

1.把冻存管从液氮中取出来，立即投入37℃水浴锅中，轻微摇动。

液体都融化后（大概1-1.5分钟），拿出来喷点酒精放到超净工作台里。

2.把上述细胞悬液吸到装10ml培养基的15ml的离心管中（用培养基把冻存管洗一遍，把粘在壁上的细胞都洗下来），1000转离心5分钟。

3.把上清液倒掉，加1ml培养基把细胞悬浮起来。

吸到装有10ml培养基的10cm培养皿中前后左右轻轻摇动，使培养皿中的细胞均匀分布。

4.标好细胞种类和日期、培养人名字等，放到CO2培养箱中培养，细胞贴壁后换培养基。

5.3天换一次培养基。

二、传代

1.培养皿中的细胞覆盖率达到80%-90%时要传代。

2.把原有培养基吸掉。

3.加适当的胰蛋白酶（能覆盖细胞就行），消化1-2分钟。

4.细胞都变圆后加如入等体积的含血清的培养基终止消化。

5.用移液枪吹打细胞，把细胞都悬浮起来。

6.把细胞吸到15ml的离心管中，1000转离心5分钟。

7.倒掉上清液，加1-2ml培养基，把细胞都吹起来。

8.根据细胞种类把细胞传到几个培养皿中。

一般，癌细胞分5个，正常细胞传3个。

继续培养。

三、冻存

把细胞消化下来并离心（同上）。

用配好的冻存液把细胞悬浮起来，分装到灭菌的冻存管中，静止几分钟，写明细胞种类，冻存日期。

4℃30min，-20℃30min，-80℃过夜，然后放到液氮灌中保存。

冻存液的配制：

70%的完全培养基+20%FBS+10%DMSO.DMSO要慢慢滴加，边滴边摇。

要注意的就是无菌操作！

二PCR技术过程：

PCR技术操作程序和优化方法

典型的PCR操作

（一）  试剂

（1）引物根据待扩增DNA不同，引物亦不同。

（2）耐热DNA聚合酶：

此酶是从耐热细菌中分离出来的，能耐受高温（93—100℃）。

    （3）10xPCR缓冲液：

  500mm01／LKCl；  100mmol／LTris一HCl（pH8.4，  20℃），150mmol／LMgCl2，  lmg／m1明胶。

    （4）5mmo1／LdNTP贮备液：

将dATP，dCTP，dGTPT和dTTP钠盐各100mg合并，加3m1灭菌去离子水溶解，用NaoH调pH至中性，分装每份300v1，（-）20℃保存dNTP浓度最好用uv吸收法精确测定。

另外。

现在已有中性dNTP溶液商品供应（Sigma公司和Pharmacia公司等）.

    （5）标本处理试剂：

不同标本所需试剂不同，根据具体情况而定.

（二）  操作程序

    利用PcR扩增的操作程序基本相同，只是根据引物与靶序列的不同，选择不同的反应体系与循环参数（见本章第：

：

节）o基本的操作是将PcR必需反应成分加入一微量离心管中，然后置于一定的循环参数条件下进行循环扩增。

每个实验室或每个人都有不同的操作习惯，但需遵守一定的操作规范。

    我们推荐下述操作程序，因这样操作可最大程度地增加反应的成功率。

（1）向一微量离心管中依次加入：

    ddH20  补至终体积（终体积50~100ul）

    10xPCR缓冲液  1／10体积

    dNTP  各200umol／L

    引物  各1umol／L

    DNA模板  10*10一10*10*10*10*10拷贝

    混匀后，离心15s使反应成分集于管底。

（2）加石蜡油50—100ul于反应液表面以防蒸发。

置反应管于97c变性7min（染色体DNA）或5min（质粒DNA）.

    （3）冷至延伸温度时，加入1—5UTaqDNA聚合酶，在此温度作用1min.

    （4）于变性温度下使模板DNA变性适当时间。

    （5）在复性温度下使引物与模板杂交一定时间。

    （6）在延伸温度下使复性的引物延伸合适的时间。

    （7）重复（4）一（6）步25—30次。

每次即为一个PcR循环o

    （8）微量琼脂德凝胶电泳检查扩增产物（见本章第7节）o

    上述过程可以用PcR自动热循环仪进行，也可以设定3个恒温水浴锅手工操作.

第二节  PCR条件的优化

    PCR必需具备下述基本条件：

①模板核酸（DNA或RNA）；②人工会成的寡核苷酸引物；②合适的缓冲体系；①Mg2+；⑤三磷酸脱氧核苷酸；⑥耐热DNA聚合酶；⑦温度循环参数（变性、复性和延伸的温度与时间以及循环数）o另外，还有一些其它因素，如二甲基亚砜、甘油、石蜡油、明胶或小牛血清白蛋白等也影响某些特定PCR。

下面分别讨论这些因素在PCR反应中的作用及其对PCR的影响。

    一、模扳核酸

    PcR可以以DNA或RNA为模板进行核酸的体外扩增。

不过RNA的扩增需首先逆转录成cDNA后才能进行正常PCR循环。

核酸标本来源广6t可以从纯培养的细胞或微生物中提取，也可以从临床标本（血、尿、粪便、体腔积液、嗽口水等）、犯罪现场标本（血班、毛发、精斑等）和病理解剖标本（新鲜的或经甲醛固定石蜡包埋组织）以及考古标本中直接提取。

无论标本来源如何，待扩增核酸都需部分纯化使核酸标本中不合DNA聚合酶抑制剂。

    PcR反应中模板加入量一般为10*10一l0*10*10*10*10拷贝的靶序列。

1ug人基因组DNA相当于3xl0*10*10*10*10个单拷贝的靶分子；10ng酵母DNA相当1：

3xl0*10*10*10*10靶分子，1ng大肠杆菌DNA相当于3xl0*10*10*10*10靶分子；1％的M13噬菌斑相当于

10*l0*10*10*10*10靶分子。

因此，扩增不同拷贝数的靶序列时，加入的合靶序列的DNA量亦

不同。

如真核rRNA基因有200—500拷贝，反应中仅需加入0.5—2ng人基因组DNA即可。

    以质粒DNA或染色体DNA为模板时的扩增最适条件是不同的。

前者所需的酶量少，循环数夕，温度不如染色体DNA要求严格。

扩增染色体DNA时至少需25—30循环，如在第15循环后补加一些Taq酶会获得更好的扩增效果。

    扩增靶序列的长度根据不同目的而不同。

用于检测目的的扩增片段长度一般为500bp以内，以100一300bp为最好。

用TaqDNA聚合酶在合适条件（较长延伸时间）下，可扩增长达10一20kb的片段。

    二、引物

    PCR扩增产物的大小是山特异引物限定的。

因此，引物的设计与合成对PCR的成功与否有着决定性的意义。

（一）  引物合成的质量

    合成的引物必须经聚丙烯酰胺凝胶电泳或反向高压液相层析（HPLC）纯化。

因为合成的引物中会有相当数量的“错误序列”，其中包括不完整的序列和脱膘吟产物以及可检测到的碱基修饰的完整链和高分子量产物。

这些序列可导致非特异扩增和信号强度的降低。

因此，PCR所用引物质量要高．且需纯化。

冻干引物干—20℃至少保存32—24个月，液体状于-20℃可保存6个月。

引物不用时应存—20℃保存。

（二）  引物的设计原则

    遵循一些简单的规则有助于没计PcR引物，通过微机的帮助更有利于PCR的成功。

关于引物的详细设计原则与方法详见本章第三节。

    （三）  引物的用量及其计算

    一般PCR反应中引物的终浓度为0．2—1umol／L，在此范围内，PCR产物量基本相同。

但引物低于0.2umol／L时，则产物量降低。

引物浓度过高会促进引物的错误引导非特异产物合成，还会增加引物二聚体的形成。

非特异产物和引物二聚体也是PCR反应的底物，与靶序列竞争DNA聚合酶，dNTP底物，从而使靶序列的扩增量降低。

    引物浓度的计算可按下面的方法进行：

摩尔淬灭系数（Em）是lcm光程比色杯中测定1mol／L寡核苷酸溶液在UV260nm下的光密度〔0D）值。

Em可按下式计算：

EM＝a（16000）十b〔12000）十c（7000）十d（9600）

    其中，a、b、c和d分别代表寡核苷酸中A、G、C和T的个数。

    例如，  —纯化的20mer寡核苷酸溶于0.1ml水中，取10ul稀释至10mL，测其0D＝0.76。

原液的0D为0.76x100=76。

若此寡核苷酸碱基组成为A＝5，G＝5，C＝5*T＝5，其EM为：

    EM＝5（16000）十5（12000）十5（7000）十5（9600）＝223000

    因此，原液个寡核苷酸的摩尔浓度为：

    76／223000＝3.4x10-4moI／L=340nmol／L

    三、缓冲液

    目前最为常用的缓冲体系为10—50mmol／LTris—HCl（pH8.3—8.8、20c）oTris是一种双极性离子缓冲液，20℃时其pKa值为8.3，pKa值为-0.021／℃。

因此，20mmol/LTris一HCl（pH8.3,20℃）在实际PCR中，PH变化于6.8—7．8之间。

改变反应液的缓冲能力,如将Tris浓度加大到50mmol／L，pH8.9，有时会增加产量。

反应混合液中50mmol／L以内的KCl有利于引物的退火，50mm01／LNaCl或50mmol／L以上的KCl则抑制TaqDNA聚合酶的活性。

有些反应液中以NH4+代K+,其浓度为16.6mmol／L。

反应中加入小牛血清白蛋白（100ug／ml或明胶（0.01％）或Tween20（0.05％一0.1％）有助于酶的稳定，  反应中加入5mmol／L的二巯苏醇DTT）也有类似作用，尤其在扩增长片段（此时延仲时间长）比加入这些酶保护剂对PCR反应足有利的。

    四、Mg2+，

    Mg2+是TaqDNA聚合酶活性所必需的。

因此，反应中优化Mg2+浓度是非常有益的。

Mg2+浓度除影响酶活性与忠实性外，也影响着引物的退火，模板与PCR产物的解链温度，产物的特异性，引物二聚体的形成等。

Mg2+浓度过低时，酶活力显著降低；过高时，则酶催化非特异的扩增。

需指出的是，PcR混合物中的DNA模板、引物和dNTP的磷酸基因均可与Mg2+结合，降低Mg2+实际浓度。

TaqDNA聚合酶需要的是游离Mg2+。

因此，PCR中Mg2+的加入量要比dNTP浓度高0.2—

2.5mmol／L。

最好对每种模板，每种引物均进行Mg2+浓度的优化。

另外还需注意引物和模板DNA原液中如含EDTA等螯合剂也会影响游离Mg2+浓度。

    优化Mg2+浓度法：

首先须知模板DNA量，引物和dNTP浓度和设定的PcR循环参数。

反应中的PcR缓冲液中不加Mg2+。

Mg2+是从10mmol／LMg2+贮存液中逐一加入反应管中。

开始以0．5mmol／L递增（0.5，1.0，1.5，2.0，2.5—5.0mmol／L），在确定了Mg2+大概浓度以后，再在该浓度上下，以0.2mmol／L递增和递减几个浓度来精确确定Mg2+的最适浓度。

    五、三磷酸脱氧核苷酸（dNTP）

    贮备dNTP液应用NaoH调pH至中性，其浓度用分光光度计测定。

贮备液为5—10mmol／L，分装后—20℃保存。

在PcR的重复热循环过程中共热稳定性应为：

50循环后约有50％仍为dNTP。

反应小练种dNTP（dATP，dGTP，dTTP和dCTP）的终浓度为20-200umol／L，在此范围内，PCR产物量、特异性与合成忠实性间的平衡最佳。

所用的四种dNTP终浓度应相等，以使错误掺入率降至最低。

开始发明PcK时，以K1enow片段催化DNA的合成，其dNTP浓度要求1.5mmol／