流感病毒的反向遗传学研究进展.docx

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流感病毒的反向遗传学研究进展

流感病毒的反向遗传学研究进展

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　　反向遗传学则是在获得生物体基因组全部序列的基础上，通过对靶基因进行必要的加工和修饰，如定点突变、基因插入/缺失、基因置换等，再按组成顺序构建含生物体必需元件的修饰基因组，让其装配出具有生命活性的个体，研究生物体基因组的结构与功能，以及这些修饰可能对生物体的表型、性状有何种影响等方面的内容。

与之相关的研究技术称为反向遗传学技术。

在病毒学研究中，反向遗传学常利用经修饰的克隆化cDNA用来获得有感染性的病毒，从而可研究这些修饰对表型产生哪些影响。

最早报道的是正链RNA病毒的反向遗传学系统。

将来自正链RNA的病毒全基因组RNA转染真核细胞，可使RNA充任mRNA（s）从而可翻译出病毒蛋白；反过来，这些蛋白又有助于完整病毒的包装。

　　与正链RNA病毒不同，负链RNA病毒的基因组无信使功能并且无感染性。

从病毒RNA开始转录需要病毒的核糖核蛋白复合体（RNP）的存在。

RNP对病毒RNA转录为mRNA和病毒基因组的复制是必须的。

利用反向遗传学，从cDNA获得的第一个完整负链RNA病毒是狂犬病毒。

另有一些研究者对Semia、Ebola病毒进行了反向遗传学研究，但拯救效率较之正链RNA病毒低得很多。

　　分节段的负链RNA病毒的反向遗传学操作尤显困难。

通过努力，分节段的负链RNA病毒的反向遗传学最终在布尼亚病毒上获得突破，并随后在流感病毒等取得了一系列进展。

此文就流感病毒的反向遗传学的发展历史及其应用作一综述。

　　1.流感病毒的反向遗传学发展概述

　　流感病毒属正粘病毒科成员。

同多数负链RNA病毒不同，流感病毒在感染细胞的核内完成复制。

在受体介导的吞饮和膜融合之后，病毒的核糖核蛋白复合体（vRNP）释放入细胞浆。

vRNP包括病毒RNA、核蛋白（NP）和3个多聚酶蛋白（PB1、PB2和PA）被运送至细胞核，在此完成转录和复制。

负链的病毒RNA不能作为蛋白质合成的直接模板。

相反，NP包裹的vRNA必须经病毒多聚酶转录为mRNA在复制中，病毒RNA作为全长互补RNA（cRNA）的合成模板；合成的cRNA又可作为子代病毒RNA的合成模板。

所以流感病毒复制的最小功能单位是vRNP复合物。

故A型流感病毒的产生需要8个功能性的RNP复合物，并且这8个复合物必须进入细胞核。

　　在实验室水平体外产生病毒始于20世纪80年代。

其时已从感染的细胞和变性剂处理的病毒中获得具有复制功能的vRNP，其后有学者又证实了vRNP的体外活性。

1989年，Parvin等和其同事获得了从克隆化cDNA获得的vRNA的病毒，从而首次建立了对负链RNA病毒进行体外修饰的系统，揭开了重配病毒研究的新篇章。

Enami等14将体外转录后的vRNA、纯化的NP和多聚酶蛋白装配成RNP复合物。

但是这个系统所产生的子代病毒多是辅助病毒，所以需要从抗体介导的生长限制作用、温度敏感性、宿主限制型和抗性等方面进行严格的筛选。

1994年，Hob性cDNA克隆的诞生和一个分节段的负链RNA病毒一布尼亚病毒的反向遗传学的成功，从克隆的cDNA产生流感病毒的技术难关终于在1999年得到突破。

Neumann研究小组161构建了含A/WSN/33CH1N1）全部8个基因片段的克隆，所有基因片段均置于人RNA多聚酶I启动子和鼠RNA多聚酶终止子序列之间，另外9个真核表达质粒负责病毒蛋白的合成，此即17质粒系统，在转染细胞上清中，产毒量达1X107/mU随后，该小组对17质粒系统进行了改进，将负责蛋白合成的真核表达质粒改为4个，分别负责PA、PB1、PB2和NP的合成，以供病毒RNA的转录和复制之用。

该系统称为12质粒系统，转染上清中能产生高达1X108/mL的病毒粒子。

其转染效率很高的原因。

　　Hoffmann等17|对RNA聚合酶I系统进行了改进。

编码病毒基因片段的cDNA以负链方向克隆于RNA聚合酶I启动子和终止子序列之间；构建好的表达盒又正向插于RNA聚合酶II启动子和牛生长激素poty（A）信号之间。

这样，RNA聚合酶I负责转录产生负链病毒RNA，而RNA聚合酶II负责正链mRNA的合成，从同一模板便可同时产生vRNA和mRNA，无需另外的质粒来负责蛋白质合成。

这个系统称为8质粒系统，有助于不能高效转染的细胞系产生重配病毒。

另外，这个系统避免了在一个或多个基因片段产生致死性突变的病毒样颗粒的产生。

8质粒拯救系统相对于17/12质粒系统，减少了表达各病毒蛋白的质粒，使拯救时需要转染细胞的质粒数大大减少，因此提高了病毒拯救效率。

相当于RNA聚合酶1+辅助病毒系统，但由于没有辅助病毒的使用，从而免去了复杂的病毒筛选工作。

没有外源（辅助）基因的干扰，可以按预期计划获得目的重配病毒。

　　随后，Neumann等探索了减少转染所需质粒数量，以期提高转染效率。

他们将负责病毒RNA合成的元件克隆到1个质粒上，而把负责蛋白质合成的基因分别克隆到另外的载体上，再进行不同的组合，使转染所需质粒的数量减少为1~6个。

例如，和以前由每个质粒提供RNA多聚酶I和II转录盒不同，他们把负责合成病毒RNA的8个RNA多聚酶I转录盒组合到1个质粒上；同样地，把负责病毒多聚酶单位合成的PB2、PB1、PA和NP分别克隆到pCAW,S载体上，5个质粒共转染后，病毒能在Vero细胞上大量增殖，TCID5Q/mL能达到。

这种改进，克服了传统的鸡胚源疫苗的局限性，也改变了既往的17或12质粒系统、8质粒系统在疫苗允许细胞（例如Vero细胞）上转染效率低的缺点，有利于高效快速地制备流感疫苗。

　　2.流感病毒反向遗传学的应用进展

　　流感病毒跨种属传播机制研究高致病性禽流感病毒为何能从飞禽传播给哺乳动物？

又能否在人之间互相传播？

探讨这一可能性对有效防制流感至关重要。

目前，有关流感病毒跨种属传播机制的研究不多。

反向遗传学可以用于从分子水平探讨流感病毒跨种属传播的可能性及其机制。

例如，目前一个最突出的问题是:

哪些基因的变化，导致H5N1流感病毒获得在人类高效传播的能力？

解决这一问题，可能就需要利用反向遗传学技术产生候选病毒，结合一个合适的动物模型，来模拟流感病毒在人之间相互传播，以探讨其机制。

　　流感病毒的各个基因片段在流感病毒跨种属传播中扮演了什么角色，又是哪些因素限制了其传播？

Hatto等在12质粒系统中1101,将人流感病毒A/Memphis8/88（H3N2）的HA、NA、NP、M、NS、PB2分别更换禽流感病毒A/Mallard/NewYork/6750/78（H2N2）基因组中相应片段，而保持禽流感病毒基因组中的其他基因片段不变。

当仅替换A/Mem¬phis/8/88的HA或NA片段时不能产生禽的病毒；当同时替换人流感病毒的HA和NA片段时，才得以成功拯救出活病毒颗粒。

因此，HA和NA之间的平衡对病毒复制是重要的，毒株本身固有的温度敏感性可能也是一个重要的限制因素。

与之相似，包含人流感病毒PB1或PA基因的重配禽流感重配病毒得到拯救。

但此病毒却不能在鸭的肠道中复制，可能是因为它和禽流感病毒的宿主细胞因子不兼容。

　　已知猪的呼吸道上皮细胞存在禽流感和人流感病毒的受体，所以存在禽流感通过猪感染人的危险。

Gabriele等1111保持人流感病毒（Sw/ONT）其他6个片段不变，采用8质粒系统，将猪H3N2毒株（Sw/MN）的HA/NA取代人H3N2病毒的HA/NA得到的重配病毒（Sw/ONT+MNHA/NA）在病毒出芽率和致病性方面较供体株有所增强；反之，将人流感病毒的HA/NA片段置换猪流感病毒相应片段，则重配病毒（Sw/MN+ONTHA/NA）出芽率和致病性下降。

由此说明HA/NA对人的流感病毒感染株起着重要作用，从而推测在猪的细胞中存在种属屏障，限制了人流感病毒和禽流感病毒在猪体重配而产生流感大流行的可能性。

　　Taubenberger等112则利用12质粒系统成功地拯救了1918年的流感病毒。

其研究结果揭示，现在流行的H5N1病毒基因必须发生一定的变化，才有可能通过低滴度的气溶胶传播给人，并由此造成流感大流行。

其中，PB1基因扮演着关键的角色，因为在1957年和1968年流感病毒重配过程中，多聚酶基因随血凝素基因一起发生转移。

比较三株禽流感病毒和人西班牙流感病毒的PA、PB1和PB2中保守序列，发现PA中的4个氨基酸（5N、100A、382D、552S）、PB1中的1个氨基酸（375S）和PB2中的5个氨基酸（199S、475M、567N、627K、702R）仅存在于人流感病毒（包括1918年病毒），在禽流感病毒中未发现。

进一步研究表明，这些氨基酸只见于人流感病毒的核定位信号区。

这些氨基酸的部分或全部差异对禽流感病毒传播到人至关重要。

Taubenberger等还比较了1997年香港人禽流感病毒和2004年越南人禽流感病毒的序列，发现其含有对1918年流感病毒感染人有关键作用的PB2的5个氨基酸中的一个。

这个结果暗示，这些禽流感病毒必须发生这样和其它一些基因变化，才会在人群传播。

因此，及时监测人禽流感病毒的关键区域的序列变异，并在宿主机体高效复制以前，及时追踪病毒演化，从而制定相应的全球性防制策略。

　　疫苗研发目前使用的流感疫苗是通过鸡胚生产并用物理方法纯化和灭活的灭活疫苗。

每年，WHO都会筛选出在人群中流行的代表株，推荐用于生产疫苗。

疫苗的效果取决于疫苗株必须和流行株有很大的相似性，以保证产生有效的中和抗体。

但是并非所有的这些候选毒株都适合于疫苗生产，有些候选毒株在鸡胚上生长欠佳。

因此，现有的做法就是把高产的实验室毒株A/PR/8/34（H1N1）和当前流行毒株加以重配，用以生产疫苗。

但是通过这种方法得到高产毒株有很大的不确定性，而且这种方法只能适合于直接从鸡胚分离的毒株；而从某些细胞系中分离得到的毒株就不能通过这个途径成为疫苗株。

　　反向遗传学的问世和发展为生产合适的疫苗株提供了可能性。

其一，与以前那祌‘命中或错过”的疫苗株筛选方法相比，这种方法直接而合理;其二，反向遗传学可以消除那些非允许细胞系分离毒株可能带来的污染或者其他病原体；其三，通过对质粒进行操作，可以改造HA和其他影响病毒毒力的基因，以去除那些致病因素。

　　株，比减温培养条件下含单个碱基变化的ts和ca突变株更为稳定。

已知流感病毒的NS1蛋白可以抑制干扰素引起的抗病毒效应。

将NS1蛋白截短后，例如只保留N端的99或126个氨基酸对小鼠只产生短暂的抗干扰素效应，由此得到的重配病毒可作为疫苗的供体株。

另一个有前途的策略是产生M2基因的敲除突变株。

敲除了M2基因，就会得到一个在细胞培养物上生长良好，在小鼠体内生长能力差的复制缺陷株。

　　Brownlee研究小组1141所采取的策略是在保守的病毒RNA启动子区进行碱基替代。

利用12质粒系统改变保守碱基，就会得到致弱毒株。

这种方法的可行性已在PA、NA和NS基因上得到证明。

如果在病毒基因组的8个片段中任意片段都能引入突变，就会产生弱毒株。

这种突变对研制活疫苗的供体株很有用处。

　　反向遗传学还可使灭活疫苗的研制周期缩短，工艺简化。

传统的方法耗时繁琐，并且要求足够的鸡胚供应，这对应对流感大流行是不现实的。

如前所述，Schickli和Hoff¬mann等分别使用不同的质粒系统得到重配病毒。

这些病毒在鸡胚上或哺乳动物细胞上有很高的血凝滴度，并有亲代流行株的表面抗原。

当新的毒株流行之际，只需将流行毒株和高产供体株加以重配，就可以得到新的疫苗株。

利用反向遗传学进行疫苗研制的不利之处在于使用了293T和MDCK细胞。

前者是转化细胞系，后者适宜性也一直得到质疑，故不适于生产人用疫苗。

另一局限处在于，人RNA聚合酶I启动子只适合于人传代细胞或其原代细胞。

Ozaki等在8质粒系统探讨了利用Vero细胞进行转染的可能性。

Vero细胞是允许用于疫苗生产的细胞。

在胰蛋白酶存在下，