微生物工程实验指导完整Word文件下载.docx
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六、
结果
1.将测定的OD值填入下表：
时间（h）
对照
0
1.5
3
4
6
8
10
12
14
16
20
OD600
2.以上述表格中的时间为横坐标，OD600
值为纵坐标，绘制大肠杆菌的生长曲线。
实验二从土壤中分离产酸细菌
一.实验目的要求：
掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基制备原理和方法。
二.实验原理：
从混杂的微生物群体中获得某一种或某一株微生物的过程，称微生物的分离与纯化，本实验采用稀释涂布平板法分离产酸细菌，以碳酸钙为底物，经产酸菌酸化形成透明圈。
2H++CO32-→CO2↑+H2O
三.主要设备、器材：
1.实验器皿：
250mL三角瓶2只；
试管7支（带棉或硅胶塞）；
9cm培养皿6个；
1mL移液管7根；
吸耳球1个；
涂布棒3个；
废报纸、棉花、棉绳、玻璃珠若干。
净工作台、接种环、酒精灯各一套
2.实验试剂：
琼脂，蛋白胨，牛肉膏，CaCO3，0.5mol/L的HCl溶液，0.5mol/L的NaOH溶液，玻璃棒，pH试纸
四实验步骤：
1.分离用器皿的准备
用报纸包扎6个培养皿，7根1mL移液管，3个涂布棒，160℃干热灭菌60min。
（亦可121℃湿热灭菌20min）
2.无菌水的制备
取1只250mL三角瓶装入90mL自来水和15-20粒玻璃珠。
121℃湿热灭菌20min。
取6支试管各加自来水9mL（6只一捆）。
121℃湿热灭菌20min。
3.培养基的制备及分离平板制作
取1只250mL三角瓶制作细菌固体培养基100mL（配方：
蛋白胨1.0%，牛肉膏0.3%，CaCO31%，琼脂1.8-2.0%，pH7.0），121℃湿热灭菌20min，60℃恒温箱保温。
倒平板，将培养基充分摇匀呈浑浊液，立即在超静台上将6个培养皿倒入细菌培养基（约15-16mL）。
4.土壤中产酸细菌的分离操作
称取校园土10g，在超静台无菌操作倒入冷却至室温的无菌水中（90mL蒸馏水/250mL三角瓶带玻璃珠），摇匀5-10min，制成菌液，用十倍稀释法稀释到10-6（5支无菌水试管）。
分别取10-4，10-5，10-6稀释度的稀释液，每个稀释度涂布两个培养皿，每个培养皿0.1mL（2-3滴）。
35℃培养箱培养2d，观察单菌落周围有无透明圈出现。
如有透明圈说明该菌株可能产酸。
（以下内容选作）挑取具有透明圈的单菌落至牛肉膏蛋白胨斜面，进一步利用划线分离法纯化，做产酸能力实验。
从复筛培养基上挑取透明圈较大的单菌落接种至三角瓶液体培养基中，摇床培养2天后，检测产酸能力（用pH试纸或酸碱滴定法）。
五根据实验结果进行分析讨论
六思考题:
1.根据实验结果回答，如何区分平板中非产酸菌？
2.你觉得本实验设计的筛选培养基该如何改进？
实验二喷雾干燥酶粉中分离筛选1398中性蛋白酶生产菌株
（选做）
一、实验目的要求
掌握微生物分离纯化的方法，学习筛选培养基的制备，灭菌等无菌操作技术。
二、实验原理
中性蛋白酶是许多微生物分泌到胞外的能在pH值中性范围内水解蛋白质的酶类，利用此机制以干酪素为底物，根据水解透明圈与菌落比值的大小来进行菌株的筛选。
比值大的其产酶活力明显增大。
三、材料与方法
1、试验材料
供试材料为喷雾干燥的中性蛋白酶样品。
购自市场。
2、培养基
（1）干酪素培养基：
干酪素2.0％（用适量NaOH溶液加热溶解），琼脂1.5％，pH7.0（或干酪素4g，硫酸镁0.5g，氯化钾0.5g，硫酸铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，1000mL）。
（2）牛肉膏蛋白胨培养基：
牛肉膏0.4％，蛋白胨0.6％，酵母浸出粉0.2％，NaCl0.5％，琼脂2.0％，pH7.0
（3）发酵培养基Ⅰ：
麸皮4.0％，蛋白胨0.1％，Na2HPO4·
12H2O0.4％，KH2PO40.03%，pH7.0。
发酵培养基Ⅱ：
可溶性淀粉1.0％，蛋白胨0.5％，Na2HPO4·
12H2O0.4%，KH2PO40.03%，CaCl20.1%，pH7.0。
3、仪器与设备
超净工作台，恒温培养箱，恒温振荡培养箱，恒温水浴锅，台式低速离心机，721型分光光度计
4、步骤
（1）初筛
利用样品通过常规稀释平板法：
即取10g样品置于已加入90mL无菌水的三角瓶中，220r／min旋转摇床，20min后取出，静置30s。
此三角瓶中液体的浓度为10-1，再用7支分别装有9mL无菌水的试管进行稀释，稀释至10-8。
将干酪素培养基分别倒入已灭菌的6个平皿中，每个平皿倒入10mL左右，然后吸取0.1mL的10-6，10-7，10-8稀释液分别涂布于干酪素培养基表面，每个稀释浓度涂布2个平皿。
37℃培养24h。
肉眼选出产生透明圈的菌株。
将牛肉膏蛋白胨培养基分别倒入7个已灭菌的平皿（每个平皿倒10mL左右，置平板）和7支试管（每支试管6mL左右，置斜面）内。
然后将选出来的若干株菌在平皿上划线，每株划一个平皿。
取出，然后从平皿中选出其单菌落划线至斜面试管（每个平皿对应一支斜面试管）进行活化培养，37℃培养24h。
（2）复筛
面试管中分别接一环对应于装有发酵培养基Ⅰ的三角瓶中进行发酵培养。
30℃恒温振荡培养48h，3500r／min离心30min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力较高的1-3株。
用发酵培养基Ⅱ进行发酵培养，30℃恒温振荡培养48h，3500r／min离心30min，取上清液测蛋白酶活力。
然后从中挑选出酶活力最高的1株。
5、蛋白酶活力的测定
（1）原理
采用福林-酚试剂法。
福林酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸，色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
因此可利用此原理测定蛋白酶活力。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比，酪氨酸含量用分光光度计在660nm处测定，从而计算出蛋白酶活力。
（2）试剂
福林-酚试剂
在2000mL磨口回流瓶中，加入100g钨酸钠（Na2WO4·
2H2O），25g钼酸钠（Na2MoO4·
2H2O）及700mL蒸馏水，再加50mL85%磷酸，100mL浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入50g硫酸锂（Li2SO4），50mL蒸馏水及数滴浓溴水（99％），开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。
冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加浓溴水的步骤）。
定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。
此溶液使用时加两倍蒸馏水稀释，即成已稀释的福林试剂。
0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液
精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
pH7.2磷酸盐缓冲液
称取磷酸二氢钠（NaH2PO4·
2H2O）31.2g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液（A液）。
称取磷酸氢二钠（Na2HPO4·
12H2O）71.63g，定容至1000mL，即成0.2mol/L溶液（B液）。
取A液28mL和B液72mL，再用蒸馏水稀释1倍，即成0.1mol/L、pH7.2的磷酸盐缓冲液。
2%酪蛋白溶液
准确称取干酪素2g，称准至0.002g，加入0.1mol/L氢氧化钠10mL，在水浴中加热使溶解（必要时用小火加热煮沸），然后用pH7.2磷酸盐缓冲液定容至100mL即成。
配制后应及时使用或放入冰箱内保存，否则极易繁殖细菌，引起变质。
100μg/mL酪氨酸溶液
精确称取在105℃烘箱中烘至恒重的酪氨酸0.1000g，用1mol／L盐酸溶液60mL溶解后，用蒸馏水定容至100mL，即为1mg/mL酪氨酸标准溶液。
吸取1mg／mL酪氨酸标准溶液10mL，用0.1mol／L盐酸溶液定容至100mL，即得到100μg/mL的酪氨酸标准溶液。
此溶液配成后也应及时使用或放入冰箱内保存，以免繁殖细菌而变质。
（3）酪氨酸标准曲线的绘制
取18支试管分成6组（每组3支，平行样），编号，按下表分别加入标准酪氨酸、去离子水、0.4moL/L的碳酸钠和福林-酚试剂，混匀后，放入40℃水浴保温20min，然后在721型分光光度计上进行比色测定（波长660nm），以浓度为0μg/mL酪氨酸反位液做空白对照。
管号
标准酪氨酸
（mL）
去离子水
Na2CO3
福林一酚试剂
酪氨酸含量
（μg/mL）
1
1.0
5
2
0.2
0.8
0.4
0.6
40
60
80
100
（4）样品酶活力的测定
取4支试管编号（1号为空白对照），分别加入酶液1mL，1号管立即加入0.4mol/L
TCA溶液2mL，使酶失活，另3支样品加入1mL
pH
7.2、浓度为2%酪蛋白底物缓冲液（如测酸性蛋白酶活力加pH3.6、2%酪蛋白底物缓冲液），迅速混匀，并立即放入40℃恒温水浴准确计时，保温10min后，立即加入0.4moL/LTCA溶液2mL，终止反应，同时向1号空白管中加入1mL2%酪蛋白底物缓冲液，摇匀，继续置于水浴中保温20min，取出离心或过滤除去剩余酪蛋白及酶蛋白沉淀物，然后取各试管滤液1mL，分别移入另4支试管中，再加入0.4mol/L碳酸钠溶液5mL和己稀释的福林-酚试剂1mL，摇匀，保温显色20min后，进行比色测定（波长660nm）。
对照标准曲线，计算酪氨酸含量。
（5）蛋白酶活力计算：
蛋白酶活力=A×
4×
N/10。
式中：
A表示对照标准曲线得出的酪氨酸释放量；
4表示反应液总体积；
N表示酶液的稀释倍数；
10表示反应时间10min；
蛋白酶活性定义:
在一定pH值（pH7.0）和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
思考题：
某菌株的透明圈的大小可以完全反映该菌株的蛋白酶活力大小吗？
说明理由。
实验三黑曲霉三角瓶固态发酵实验
一、概述
固体发酵法作为一个古老的生物工艺早在几千年前已在食品和调味品上得到应用。
与液体发酵相比，固态发酵操作简易、工艺简单、能耗低，无废水废渣产生，不造成对环境的二次污染。
因此，固态发酵法目前在生产有机酸、发酵食品、酶制剂以及动植物废弃物、垃圾的处理和利用等方面有着广泛的应用。
利用曲霉属菌种，通过固体或液体发酵法生产酸性蛋白酶，我国在七十年代末和八十年代初作过一些研究，但此后有关这方面研究的报导极少见到。
近年来，随着酸性蛋白酶应用范围的扩大，尤其是作为一种新型的生物饲料添加剂，在饲料工业中表现出来的潜在功能，越来越引起人们对它的研究兴趣。
二、实验目的与要求
通过三角瓶固态培养黑曲霉，掌握固态培养微生物的原理和技术，并掌握蛋白酶的分析方法。
三、菌种和培养基
1、菌种：
黑曲霉（上海华东理工大学赠送）
2、培养基：
（1）斜面培养基
土豆培养基或察氏培养基。
（土豆培养基：
取去皮马铃薯200克，切成小块，加水1000毫升煮沸30分钟，滤去马铃薯块，将滤液补足至1000毫升，加葡萄糖20克，琼脂15克，溶化后分装，15磅灭菌30分钟。
）
（2）固态发酵培养基
麸皮8g，豆饼粉2g，（NH4）2SO20.2g，水11mL，121℃灭菌45分钟。
四、仪器与设备
三角瓶100个、普通天平4个，分析天平1台，灭菌锅、恒温培养箱、超净工作台
接种铲8个，100mL量筒8个，10mL移液管8支，塑料盆8个
五、实验过程
原始斜面菌种→斜面接种培养（28℃、7天）→麸皮试管培养（28℃、7天）→三角瓶培养（28℃、72h）→测定酸性蛋白酶酶活力，观察孢子形态。
固态发酵培养基灭菌后将培养基拍散，冷却至室温，接入麸皮试管种子，混匀，于恒温培养箱中28-30℃静置培养72小时，取样测定酶活力。
实验分四组：
①组：
装料量对酶活力的影响。
取5×
3
（2）个250mL三角瓶，按以上固态发酵培养基，分别按下列装料量（按干料计算）装料：
5g/瓶；
10g/瓶；
15g/瓶；
20g/瓶；
25g/瓶。
接种培养72小时后，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
②组：
碳氮比对酶活力的影响。
3
（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按下列配比：
6:
4；
7:
3；
8:
2；
9:
1；
10:
0。
③组：
料水比对酶活力的影响。
3
（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基，但料水比按以下比例配制：
8；
9；
10；
11；
12，接种培养72小时后，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
④组：
酶活力的时间变化曲线。
3
（2）个250mL三角瓶，麸皮和豆饼粉的比例按给出的固态发酵培养基，接种培养，分别于接种后24、36、48、60、72小时取样，测定每一瓶的发酵酶活力，计算三瓶平均数。
实验四黑曲霉固态发酵曲的酸性蛋白酶活力测定（承接试验三）
一、实验目的与要求：
1.学习固态发酵胞外产物（酶）的提取方法
2.掌握福林-酚试剂法测定蛋白酶活力的步骤与方法
二、蛋白酶活力的测定原理：
采用福林-酚试剂法。
福林-酚试剂在碱性条件下可被酚类化合物还原呈蓝色（钼蓝和钨蓝混合物），由于蛋白质分子中有含酚基的氨基酸（如酪氨酸、色氨酸等），可使蛋白质及其水解产物呈上述反应。
通常以酪蛋白为底物，在一定pH值和温度条件下，同酶液反应，经一段时间后终止酶促反应，经离心或过滤除去酪蛋白等沉淀物后取上清液，用Na2CO3碱化，再加入福林-酚试剂显色，蓝色的深浅与滤液中生成产物酪氨酸量成正比；
酪氨酸含量用分光光度计在680nm波长处测定，从而计算出蛋白酶的活力。
三、仪器、设备、物品：
分析天平，电炉，分光光度计，恒温水浴锅，恒温箱，试管架
试管（18×
180）200支，小烧杯100个，纱布1卷，玻璃棒8，记号笔8，
四、试剂配制
1、福林-酚试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）
向2000mL的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠（Na2WO4•2H2O）、25g钼酸钠及700mL的去离子水，再加入50mL85%的磷酸及浓盐酸l00mL，充分混合后，接上回流冷凝管，以文火回流10h，结束后再加入50g的硫酸锂（LiSO4）、50mL去离子水及数滴浓溴水（99%），再继续沸腾15min，以驱除过量的溴，冷却后滤液呈黄绿色（如仍呈绿色，需再重复滴加溴水的步骤），加去离子水定容至1000mL，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中，贮于冰箱中可长期保存备用。
此溶液使用时可按1:
2比例用去离子水稀释（一份福林试剂与两份水混合）。
2、0.4mol/L三氯乙酸（TCA）溶液
精确称取TCA65.4g，加去离子水定容至1000mL。
3、0.4mo1/L碳酸钠溶液
精确称取无水碳酸钠42.4g，加去离于水溶解后，定容至1000mL。
4、乳酸缓冲液（pH=3.0）的制备
甲液称取乳酸（80～90%）10.6g，加水溶解并定容至1000mL。
乙液称取乳酸钠（70%）16g，加水溶解并定容至1000mL。
使用溶液取甲液8mL，加乙液1mL，混匀，稀释一倍，即成0.05mol/L乳酸缓冲液。
5、2%酪素溶液
取酪素2.000g，精确至0.001g，用浓乳酸2-3滴润湿后，加入适量的乳酸缓冲液约80mL，在沸水浴中边加热边搅拌，直至完全溶解，冷却后，转入100mL的容量瓶中，用乳酸缓冲液稀释至刻度，冰箱中贮存。
有效期为三天。
6、100μg/mL标准酪氨酸溶液
精确称取预先于105℃干燥2～3h的L-酪氨酸0.1g，逐步加入6mL1NHCl使之溶解，用0.2NHCl定容至100mL，即得1mg/mL的酪氨酸溶液，取此溶液10mL，用0.2NHCl定容至100mL即成100μg/mL标准酪氨酸溶液
五、标准曲线绘制
为了确定酪氨酸浓度与OD值的对应关系，须事先以不同浓度的标准酪氨酸与福林试剂反应显色，测定OD值并绘制标准曲线。
1、不同浓度的标准酪氨酸按下表配制：
试管号
100μg/mL标准酪氨酸溶液
（mL）
蒸馏水
酪氨酸的浓度
9
7
30
50
2、标准曲线的绘制
将上表配制的各种浓度酪氨酸溶液各取1mL（需做平行）分别加入0.4mol/L
Na2CO3溶液5mL，稀福林试剂1mL，置40℃水浴中显色20min，以721分光光度计在波长680nm测定OD值，用0.2NHCl做对照，以OD值为纵坐标，酪氨酸的浓度为横坐标，绘制标准曲线。
此曲线应是通过零点的直线，然后计算K值[标准曲线中OD为1时的酪氨酸浓度（μg/mL）]。
K值一般应在95～100范围内。
六、黑曲霉曲中酸性蛋白酶活力的测定
1、待测酶液的制备
精确称取曲块5g，加水100mL，在40℃水浴中充分搅拌30min，充分溶出酶蛋白，然后过滤，滤液用缓冲液稀释待测（稀释倍数应使水解底物后与福林试剂显色的OD值在0.2～0.4范围内）。
酶曲稀释倍数可参考下表
酶活力u/g
总倍数
第一次稀释
第二次稀释
2000
200
5g→50mL（10倍）
0.5mL→10mL（20倍）
3000
250
2g→50mL（25倍）
1mL→10mL（10倍）
4000
400
5mL→200mL（40倍）
5000
500
10000
1000
2、样品酶活的测定
（1）先将酪素溶液放入40±
0.5℃的恒温水浴中，预热5min。
（2）按下列程序操作：
3、蛋白酶活力的计算
蛋白酶活力X=（4/l0）×
K×
OD×
N。
式中:
4——4mL反应液取出1mL；
10——反应时间10min；
K——标准曲线中OD为1时所相当的酪氨酸浓度（μg/mL）
N——酶曲的稀释倍数
在一定pH值（pH3.0）和40℃温度条件下，每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸定义为一个蛋白酶活力单位。
七、数据处理
用表格来表示发酵过程中装料量、碳氮比、料水比对酶活力的影响。
用表格或曲线来表示酶活力随时间的变化。
八、思考题
影响固体发酵的因素还有哪些？
本次实验做的为单因子试验，能否用多因子实验如正交试验法？
2008-2009第一学期开设本实验课的班级及人数：
实验班级
生物技术05级
生物技术（现科）05级
生物技术及应用（专）06级
人数
35
44
4个班
课时数
16
2009-2010第一学期开设本实验课的班级及人数：
生物技术06级
生物技术（现科）06级
生物技术及应用（专）07级
52
108
2个班
2010-2011第一学期开设本实验课的班级及人数：
生物技术07级
生物技术（现科）07级
2个班30人
5个班119人
2011-2012第一学期开设本实验课的班级及人数：
生物技术08级
生物技术（现科）08级
2个班57人
6个班158人
实验五土霉素摇瓶发酵实验（设计型实验）
一、实验目的：
1、熟悉放线菌的微生物学特性及培养方法
2、了解和掌握种子制备和摇瓶发酵技术和方法
3、了解抗生素发酵的一般规律和代谢调控理论
4、熟悉和掌握常用的比色分析方法的操作技术
5、掌握分光光度法测定发酵
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