Westernblot操作步骤Word文件下载.docx
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31kDa
线粒体
COXIV
16kDa
TBP
38kDa
细胞核
实验步骤
一、蛋白样品制备（组织中总蛋白的提取）
第一步：
法
（1）敲取0.07-0.1g组织+400-500ul裂解液，放入打样管，放入打样机打样。
法
（2）实验室研钵研磨：
取稍大于0.1g的样品放入研钵中，加少量液氮冻硬，用研杵来回研磨至粉末状，用枪头刮取收集入离心管。
注：
任何操作都要在液氮中进行，并且要将枪头和离心管提前泡在液氮中。
第二步：
取出的样品放置冰上1-2h（中间混匀5-6次）直至裂解完全。
第三步：
样品离心×
2，取上清于新的EP管中。
（离心条件：
13000rpm，4℃，30min）
离心机提前预冷至4℃。
二、蛋白含量的测定
在96孔板第一列1-8分别为浓度为0，1，2，4，6，8，9，10倍的蛋白标准液+水=10或20ml，再加上5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
在96孔板后面几列依次加入稀释的蛋白样品或原液10-20ml以及5倍稀释的考马斯亮蓝染液200ml。
原液浓度太高时进行稀释，用裂解液稀释。
三、电泳
第一步：
清洗玻璃板
将玻璃板在蒸馏水下冲洗干净，去除杂质，再用去离子水清洗一遍，自然晾干。
第二步：
配胶
（1）玻璃板对齐后放入夹中卡紧，然后垂直卡在架子上准备灌胶。
（2）配分离胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
待胶面升到玻璃板3/4位置时即可。
然后胶上加一层水，液封后的胶凝固更快。
加水液封时须缓慢，否则胶会被冲变形。
（3）当水和胶之间有一条折射线时，说明胶已凝固。
倒去胶上层水并用吸水纸将水吸干。
配浓缩胶，加入TEMED后立即摇匀即可灌胶。
将剩余空间灌满浓缩胶，然后将梳子插入浓缩胶中。
待到浓缩胶凝固后，两手分别捏住梳子的两边竖直向上轻轻将其拔出。
插梳子时要使梳子保持水平，两边对齐垂直插入。
（4）用水冲洗一下浓缩胶，将其放入电泳槽中。
（小玻璃板面向内，大玻璃板面向外。
若只跑一块胶，槽另一边要垫一块塑料板且有字的一面面向外。
）
上样
（1）测完蛋白含量后，计算含50mg蛋白的溶液体积即为上样量。
适量蛋白加入4：
1
5×
LoadingBuffer于离心管，100℃水中煮5min使蛋白变性。
放置冰上3min，离心15min，13000rpm，4℃。
（2）加足够的1×
电泳缓冲液后开始准备上样。
（电泳液至少要没过内测的小玻璃板。
）用微量进样器贴壁吸取样品，将样品吸出不要吸进气泡。
将加样器针头插至加样孔中缓慢加入样品。
（加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢出。
第四步：
电泳
浓缩胶80V电压跑20分钟，至蛋白marker分离即可加压，也可多跑几分钟；
分离胶120V电压跑至底端。
第五步：
停止电泳
纯水冲洗玻璃板，取胶，清洗切去浓缩胶，在Marker下方切角做标记，将胶泡在清水中。
四、转膜（跑胶时准备转膜用品，最主要赶气泡）
剪PVDF膜，并提前切角标记方向，甲醇中泡1-3min。
将膜、海绵、滤纸一起泡入1×
转膜液中，放4℃保存。
将夹子打开使黑的一面保持水平。
在上面垫一张海绵垫，用玻棒来回擀几遍以擀走里面的气泡。
（一手擀另一手要压住垫子使其不能随便移动。
）在垫子上垫2层滤纸，一手固定滤纸一手用玻棒擀去其中的气泡。
将胶盖于滤纸上，轻轻用玻棒擀去气泡。
将膜用镊子盖于胶上完全对齐，并除气泡。
在膜上盖2层滤纸并除去气泡。
最后盖上另一个海绵垫，合起夹子。
整个操作在4℃的1×
转膜液中进行，要不断的擀去气泡。
膜两边的滤纸不能相互接触，接触后会发生短路。
将夹子放入转膜槽中，黑对黑，白对红。
电转移时会产热，过热有可能造成蛋白质的降解，同时大量产热，会使凝胶膨胀，有可能在胶和膜之间产生空隙，引起转膜不均匀，所以在转膜槽中放入冰盒，在冰水混合物中进行转膜。
转膜条件是电流300mA或电压70V，2h；
另一个约束条件就是电压必须控制在60-70V，调节电流。
转完后将膜放入装水的小盒中冲洗，倒水后，加5%的封闭液，摇床封闭1h。
五．抗体孵育，免疫反应
回收封闭液，加入一抗，摇床30min-1h，4℃过夜，再孵育30min-1h。
一抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。
加二抗，孵育2h。
二抗回收，用PBST洗，洗5次，每次5min。
纯水冲洗5-7次，倒掉纯水，加化学发光，膜在化学发光中浸泡2-3min，成像。
实验药品试剂
1.裂解液：
母液（动物组织蛋白提取Buffer）：
蛋白酶抑制剂：
Pmsf（配）=100:
1:
1
母液常温放置；
蛋白酶抑制剂和Pmsf需-20℃保存；
裂解液需-4℃保存。
2.考马斯亮蓝染液，使用前用无菌水稀释。
3.转膜液的配制（1×
）1L
试剂
剂量
Tris
3.028g
Glaline（甘氨酸）
14.4g
SDS
1g
先定容800ml，调制PH=8.3，然后+200ml甲醇，混匀。
4.蛋白电泳Buffer（5×
15g
72g
5g
直接定容至1L，无需灭菌和调pH；
使用前稀释至1×
。
5.磷酸盐缓冲液（PBS，10×
）500ml
NaCl
40g
KCl
Na2HPO4·
2H2O
7.2g
KH2PO4
1.2g
调制pH=7.4-7.5
6.PBST配制
1L的PBS+5ml
20%Tween20
7.封闭液（5%）
脱脂奶粉5g，溶于PBST，定容至1L。
8.一抗溶于封闭液；
二抗溶于PBST。
9.按照如下表格配制SDS-PAGE的浓缩胶（也称堆积胶、积层胶、上层胶）
成分
配制不同体积SDS-PAGE浓缩胶所需各成分的体积（mL）
5%胶
2
3
4
6
8
10
蒸馏水
1.4
2.1
2.7
4.1
5.5
6.8
30%Acr-Bis（29:
1）
0.33
0.5
0.67
1.0
1.3
1.7
1MTris，pH8.8
0.25
0.38
0.75
1.25
10%SDS
0.02
0.03
0.04
0.06
0.08
0.1
10%过硫酸铵
TEMED
0.002
0.003
0.004
0.006
0.008
0.01
10.根据目的蛋白的分子量大小选择合适的分离胶（下层胶）浓度
SDS-PAGE分离胶浓度
最佳分离范围
6%胶
50-150kD
8%胶
30-90kD
10%胶
20-80kD
12%胶
12-60kD
15%胶
10-40kD
配制不同体积SDS-PAGE分离胶所需各成分的体积（毫升）
6%分离胶
5
15
20
30
50
2.0
4.0
6.0
8.0
12.0
20.0
3.0
10.0
1.9
3.8
5.7
7.6
11.4
19.0
0.05
0.15
0.2
0.3
0.012
0.016
0.024
8%分离胶
3.3
5.0
6.7
16.7
5.3
13.3
0.009
0.018
10%分离胶
12%分离胶
15%分离胶
1.5
2.5
7.5
15.0
25.0
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