显示益生元特性时的低聚木糖对健康受试者消化道内环境及免疫状态的联合调解Word文件下载.docx
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在小鼠喂食高脂饮食,补充果聚糖诱导循环LPS和促炎细胞因子(7,10)的减少。
因此,肠道菌群可能会牵连肥胖和通过几种机制,包括LPS诱导微炎症胰岛素抵抗。
通过益生元免疫功能的调节还没有得到充分的调查和动物模型的数据大部分来源于。
据我们所知,目前还没有研究在健康人体内消耗了稳定的脂肪和碳水化合物饮食上公布的益生元的作用无论是在循环LPS或同时对细胞因子的表达。
本研究的目的是建立菊粉和低聚木糖(INU-XOS)的混合物中的一种新的化合物,低聚木糖和益生元效果;
并确定其毒素血症与正常人消耗正常,稳定脂肪的饮食免疫指标的作用。
对象与方法
18-24岁(20.1(SEM1.6)岁)共60名健康志愿者(34女性谁不宣称是怀孕和26名男性)参与了这项研究。
他们是学生在学院理工学院拉萨尔博韦。
他们参加了2008年10月与干预相至十一月至2008年12月。
志愿者有资格报名,如果他们符合所有纳入标准:
稳定的质量;
BMI18.5-27kg/m2;
纤维摄入量13-18G/天。
排除标准为正在进行的严重的疾病;
胃肠道,膀胱和胰腺疾病;
腹部或过去12个月内肠道手术;
腹泻,
便秘或反复发作的腹痛;
近期(3个月)肠胃食源性疾病;
antibiotherapy或使用在过去的6个月内润肠通便的药物;
糖尿病;
使用前或益生菌补充剂;
具体功能益生菌益生元或丰富的食物;
饮酒量(3饮品/天);
橙汁不耐。
这项研究是进行现场综合理工学院研究所拉萨尔博韦博韦医院的饭菜和样品收集。
这项研究是根据赫尔辛基宣言的守则和所有过程涉及人类受试者西北区域伦理委员会批准基于法国里尔大学医院。
书面知情同意当时从所有参与者获得招聘和研究协议(2007-A00273-50)是西北区域伦理委员会批准基于法国里尔大学医院。
研究设计
该研究遵循随机,平行,安慰剂对照,双盲设计。
在入学时进行半定量饮食调查以评估通常的膳食纤维的摄入以选择目标人群消费13-18g/d。
志愿者们被要求遵循膳食指南来维持他们的纤维摄入量在2周一稳定阶段,然后整个干预。
所有志愿者生活现场,把所有食物研究所食堂,每餐的内容可以紧密控制。
3d进行膳食调查结束时的稳定时间和重复的干预,以评估饮食的稳定性。
六十志愿者被随机分配到三个组之一。
第一组(安慰剂)接受每日剂量为6.64克澄麦芽糊精(GLUCIDEX12DE;
罗盖特FRE`水库)的;
第二组(XOS)收到6.64克小麦阿拉伯木聚糖(Optiflow;
DF3SAS)派生的低聚木糖富集的化合物;
和所述第三组(INU-XOS)接收6.64克含有菊粉型果聚糖的混合物(Fibruline瞬间;
Cosucra-狮Warcoing),低聚木糖(Optiflow;
DF3SAS)和麦芽糖糊精。
Fibruline即时是菊苣菊糖的聚合度(DP)为2至60和大约10平均DP。
Fibruline即时与96%的DM的粉末,并包含(按DM)90%的菊粉。
Opti'
flor的特点是DM的95%,80%的DM一个低聚木糖含量,平均DP大于10,并通过一个阿拉伯糖:
木糖比在0.5以上。
在早餐和晚餐前这些产品采取了每天两剂量(130毫升)。
日总剂量的活性成分为5g低聚木糖(XOS组)或3G菊粉þ
1克低聚木糖(INU-低聚木糖组)。
产物通过除了市售的橙汁(100%纯果汁,无果肉)每日制备并保存于88℃分配之前。
产品在独立研究显示器的前面测试。
周末,产品制备的数量足以2d和贮存于阴凉箱。
受试者采集的低温箱才离开校园和消费各剂量后签订了合规性的形式。
这三款产品(光纤或麦芽糊精+汁)的味道是通过感官评定方法,并没有发现是不同的。
数据收集
该测量均在包容(V0),然后在治疗(V1)的第一天,2周后(V2)和治疗4周(V3)之后。
临床资料体重,血压和心脏速率(后3分钟休息两次测量)进行了评估在包容,然后在V1,V2和V3。
胃肠幸福感进行了评估在V1,V2和V3用视觉模拟评分量表的九个项目,包括胀气,腹胀,轰隆隆,腹部绞痛,恶心,来自这五个项目以前计算的全球性消化耐受性得分,大便性状,大便频率,和一般福祉,通过在日常及专业活动的干扰,以及个人和社会活动的干扰。
问卷的基础上通过帕皮诺等测量标准..项目进行评分的线性刻度测量10厘米。
生物数据
粪便样本粪便标本采集在每次访问(V1到V3)在无菌容器中。
他们被保持在低于88℃,并
在6h内分装为被存放在220或2808C,直到进一步的分析之前,各种测试。
DM,pH值和细菌含量,测定在每次访问,SCFA,测定在V1和V3,同时对甲酚和苯酚,葡糖苷酶和β-葡糖苷酸酶的活动,以及分泌型IgA(S-IgA的)只测量V3。
血液样本。
血样收集在访问期间,V1和V3的肝素内衬真空收集管精华(7ml)。
全血使用后LPS刺激来测量细胞因子的表达。
LPS是众所周知的刺激的干扰素-克的表达和TNF-α,IL-1β,IL-8和IL-12,而抑制IL-4,IL-10和IL-13。
TNF-α和IL-10分别在V1和V3的测量两者,而其它细胞因子测定在V3只。
剩下的血,然后离心(3500RPM,5分钟)和血浆采集测量在V3循环毒素。
测量
粪便测量
DM和pH值。
DM和pH测定新鲜样品。
一个2G的样品放入预先加权铝杯。
将样品加热干燥在1108C1小时,然后在808C48小时,然后置于干燥器中冷却后,该DM称重。
0·
5克样品在5毫升单一化双重蒸馏水(去离子水)测量pH值。
总微生物和组成。
细菌总数和特定的细菌分布进行定量PCR检测,所描述的Pouillart等。
DNA从根据制造商的说明使用的QIAampDNA的粪便小型试剂盒(Qiagen公司)的粪便样品的200毫克萃取。
接着,100ng的来自每个样品的DNA使用所选的引物和探针组在表1中详述扩增或以前出版。
周期的量化数据进行量化反对使用所选菌株的标准曲线。
数据表示为log10的(拷贝数)/g的DM。
SCFA(C2(乙酸),C3(丙酸),C4(丁酸))。
挥发性脂肪酸是按照Scheppach等提取和测定。
(19)与一些变体。
一个2G的样品均化5毫升双蒸水,然后在4500克离心5分钟。
使用25毫升的H2SO4(2M)将上清液酸化至pH为2,并注入到BP21气相色谱柱(长:
30m,内径:
530毫米,膜:
1毫米)以及一个内部标准(4-羟基-4-甲基基-2-戊酮)。
氢气供给作为载气以1.5毫升/分钟的流速。
初始炉温为1358C,并保持在那里为6分钟,然后升温至1808C由258C/min和1分钟保持在那里,然后由258C/min进一步增加至2308C,最后在2308C保持1分钟。
玻璃棉(Supelco),将被插在分割喷射口的玻璃衬管。
火焰离子化检测器和注射口的温度分别为240和2808C。
H2的流速和空气作为补充气体分别为40和400ml/min。
注入的样品体积为GC(于AutoSystemXL;
珀金埃尔默)分析为1mL,且运行时间为每个分析了约10分钟。
不同的SCFA是按照各洗脱峰的保留时间确定的。
通过比较与标准曲线获得定量。
对甲酚和苯酚。
甲酚和苯酚测定技术建立之前
α-葡萄糖苷酶和β-葡糖苷酸酶的活动。
所描述的Djouzi等酶的活性进行了测定。
有一些修改。
一个1G的样品均质化在0.1M-磷酸钾缓冲液,pH7.210mL与10000×
g离心20分钟,在48℃之前,超声处理30秒。
收集上清液,并温育15分钟,在308℃用4mM的基板的等体积。
将反应物在双蒸水中停止在冰上用碳酸钾(1μM)。
吸光度在400nm处进行作图对硝基苯的标准曲线来测量产率的反应,因而酶的酶活性。
特异性底物为对硝基苯基-AD-吡喃葡糖苷为α-葡萄糖苷酶和对硝基苯基-BD-葡糖苷酸为β-葡糖醛酸酶。
表1:
定量PCR用于扩增16SrRNA基因引物和探针详情
类引物和探针*引物和探针序列(5'—3')†
厚壁菌Firm-FGAATCTTCCACAATGGACGAAAG
Firm-RAATACCGTCAATACCTGAACAGTTACTC
Firm-MGB探针6FAM-CTGATGGAGCAACGCCGCGT
柔嫩梭菌Fprau-FGGCCTACTGGGCACCAACT
Fprau-RAATCCTGTTTGCTACCCACACTTT
Fprau-MGB探针6FAM-ACGCTGAGGCTCG
罗氏菌Ros-FTGTAGCGGTGAAATGCGTAGA
Ros-RGCTCCCCACGCTTTCGA
Ros-MGBprobe6FAM-ACTGAGACACGGCCCA
拟杆菌Bacte-FAAGGTCCCCCACATTGGAA
Bacte-RCTGCTGCCTCCCGTAGGA
Bacte-MGB探针6FAM-CTGAGACACGGTCCAAA
*引物和探针的选择是使用以下网站建立:
www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/
†引物和探针,在硅片被验证对所有已知的细菌菌株的序列(NCBI/BLAST,2004-5),并在体外对的参考毒株的全面板的交叉反应。
分泌型IgA。
一个100毫克样品均质化,并按照说明书使用s-IgA的ELISA试剂盒(免疫诊断)处理。
其他生物测量
细胞因子。
全血样品进行孵育以滚动的培养箱中1ng/ml的LPS在378C6小时(TNF-a)和24小时(所有其它细胞因子)。
一个参比样品孵育未经LPS(22)。
孵化停止加入QIAzol(Qiagen公司)500毫升。
根据用户手册使用RNeasy迷你脂质试剂盒(Qiagen)分离总RNA。
重组互补DNA从使用Quantitect逆转录酶试剂盒(Qiagen)100毫微克的RNA按照用户手册得到。
最后,100毫微克互补的cDNA扩增对设计的引物(AppliedBiosystems公司)。
相对表达的细胞因子,计算对未经处理的参考样本。
两个B-肌动蛋白和肽基异构酶一个被用来作为参考基因。
对于所有的基因,荧光定量PCR的效率为96和106%。
脂多糖。
根据制造商的说明使用鲎变形细胞溶解物生色端点法(Hycult)循环的LPS,测定血浆样品中。
膳食摄入量。
在3D食物日记完成两次(随机(V1)之前和研究(V3)结束前)由志愿者和研究dietitian.The食品和营养表为基础通过Nutrilog软件(NutrilogSAS)制作评估可在CIQUAL法国的食物成分数据库
样本大小和统计分析的测定
样本大小的决心。
每组受试者数目计算为主要终点的是双歧杆菌的人口以对数(拷贝/克DM)的一个显著变化。
使用FOS或菊粉以前的研究表明,主要目标的可变性是一个记录单元(菌落形成单位/g);
因此,标准偏差为1。
Bouhnik等(24)曾表示,对双歧杆菌临床显著效果需要1个对数(菌落形成单位/克)的受试者服用安慰剂受试者服用菊粉10克之间的差异。
我们预期,根据我们先前的未公布结果(Y.Dugenet,个人通信),该测试产品在选定的剂量是一样有效菊粉10克。
因此,对于I型错误率的5%,而II型错误率的B20%,所需要的双面测试科目的最低数量是16。
由于受试者可能
辍学,为了增加统计力量,选择的最终数目为每组20科目。
数据处理。
只要有可能,基线和4周的干预的端部之间的相对变化计算为基线值的百分比。
这是用于临床,营养学家和表2中列出了一些生物学参数(基线特征)的情况。
对于消化耐受性症状,文本(在10厘米自评量表)的性质导致了“零”的一些基线值,防止任何计算从baseline.Instead,绝对的变化进行了计算和使用的相对变化。
为测定只在端点,其中所有其它的参数,这些绝对数据被使用。
数据分析。
使用统计软件包SPSS17.0版的Windows(SPSS公司)进行数据分析。
描述性分析是对所有参数进行,给出为平均值和标准误差。
所有统计检验都是双侧的与0.05的显着性水平。
每个参数的数据分布的正态性是由夏皮罗-威尔克测试进行评估,无论是参数(t检验)或非参数(Mann-Whitney检验或Wilcoxon符号秩检验)前测试,以比较各组或参观。
结果
共有60例被纳入研究,但一个主题辍学在V1和没有被替换。
在研究过程中没有发生进一步的主体辍学。
基是均质的所有测量参数在基线,除了性别比率(表2)。
有人认为,没有测试的标记会按性别的影响;
这一因素,因此不包括在一个随机化的标准。
膳食纤维摄入量(不含试品)的低聚木糖组从13.91下降(SEM0.87)克/旦V1至12.08(SEM0.59)克/旦V3(P=0.029)。
不过,我们可以从表3看到,有一个在研究成果组之间的任何临床或饮食参数无显著差异。
按五种症状的总和在全球消化耐受症状评分在V2的增加在INU-低聚木糖相比,安慰剂组和低聚木糖组(P=0.005和0.046,分别),但只是短暂的比分在V3下降为INU-低聚木糖组(P=0.007V2和V3之间)。
INU-低聚木糖增加胃肠胀气和腹胀的感觉在V2(P=0.001和0.013,分别)和V3(P=0.004和0.029,分别)与安慰剂比较。
然而,对比组为公差的症状(表4)的相对变化时,只胀气是显著安慰剂组和INU-低聚木糖组之间比(¼
P0.032),干预期间增加。
同样,大便性状被视为该INU-低聚木糖组较安慰剂组(P=0.001)在V2与V1和V2(P=0.002)之间大便稠度下降,并回归到基线水平V3(P=0更多的液体·
011)。
,观察自我报告每天大便次数,除了增加V1和V2之间的INU-低聚木糖组从1.09(SEM0.12)1.55(SEM0.25)凳/天(P=0·
无差异026)。
观察到在任何这些参数的相对或绝对没有任何的变化组间差异。
我们一般观察到一个小障碍相较于安慰剂组V3.Prebiotic活动福祉(P=0.026)和专业活动(P=0.038)为INU-低聚木糖组的特点是既改变微生物的分布及细菌的代谢活动。
表2.目标人群的基线特征
(平均值和标准错误)
安慰剂低聚木糖INU-低聚木糖
平均值SEM平均值SEM平均值SEM
人口统计数据
年龄(年)20.00.420.10.420.10.4
性别比例(男/女)7/13–5/14–14/6–
体重(公斤)63.02.060.32.465.92.8
身体质量指数(kg/m2)21.60.520.90.621.40.5
心率(bpm)69.91.866.22.168.12.1
营养学
能(kJ)7941.0376.67903.5477.07736.0493.7
蛋白质(克)77.43.976.23.980.45.6
脂质(G)75.04.974.75.869.16.7
碳水化合物(克)216.09.4210.213.3218.412.2
光纤(G)13.70.913.90.912.90.8
公差
胀气(上规模厘米)2.230.412.340.462.640.41
腹胀(上规模厘米)1.170.231.000.441.440.40
隆隆(上规模厘米)1.970.452.320.452.640.40
抽筋(上规模厘米)0.680.270.550.310.780.32
恶心(上规模厘米)0.370.150.470.230.840.37
大便性状(上规模厘米)0.40.370.840.640.550.34
大便次数多(大便/D)1.120.101.140.101.090.12
益生作用
DM(%)29.51.627.71.728.71.5
pH值(任意单位)6.900.116.840.086.900.14
短链脂肪酸
C2(毫摩尔/克DM)189.414.2203.59.6203.214.2
C3(毫摩尔/克DM)55.24.755.42.659.14.4
C4(毫摩尔/克DM)50.54.952.32.554.23.8
C3:
C2比0.290.010.280.010.290.01
短链脂肪酸
C2(总SCFA的%)64.71.165.30.964.40.6
C3(总SCFA的%)18.60.417.90.418.60.3
C4(总SCFA的%)16.70.816.80.517.00.4
微生物
双歧杆菌(LOG10(复印件)/GDM)6.360.176.540.36.460.22
乳杆菌(LOG10(复印件)/GDM)5.580.215.730.135.410.14
消化链球菌(LOG10(复印件)/GDM)2.950.142.760.213.010.20
梭状芽孢杆菌(LOG10(复印件)/GDM)7.460.107.540.127.610.12
免疫调节
肿瘤坏死因子-α(相对表达)3.040.443.380.593.450.45
IL-10(相对表达)-2·
390.52-2.30.59-1.180.65
低聚木糖,低聚木糖;
INU-低聚木糖,菊粉和-低聚木糖混合物;
M,男性;
男,女;
BPM,次/分。
*所有组具有同质性在基线(P.0·
05)
低聚木糖组中的双歧杆菌种群较高,为V2和V3(P=0.003和0.001,分别),并在V2和V3(P=0.015和0.001)的INU-低聚木糖组相比,安慰剂组。
差异有临床相关的大约1日志。
有乳杆菌人口的V1和V2(约0.5日志)之间的INU-低聚木糖组(P=0.048),在一个温和的增长。
在消化链球菌人口增长(1日志)ATV2在低聚木糖(P=0.027)和INU-低聚木糖组(P=0.047)相比,安慰剂,但两组回到基线在V3。
变化从基线到研究结束时只分析表明这两个群体对安慰剂的双歧杆菌(表5)一个显著的效果。
有在所有时间点的三组人群梭菌没有什么区别。
然而,有三组(P,0.001),V1和V3之间的显著整体下降,可能是由于增加的橙汁消耗。
对于厚壁菌门,拟杆菌,柔嫩梭菌和罗氏菌属。
人群中,有三组在V3之间没有差别。
细菌代谢可通过其产品(碳水化合物或蛋白质的代谢物),其活性(酶),或在肠道环境(pH)的影响进行测定。
粪便pH值较低的低聚木糖比在V3安慰剂组(6.47(SEM0.17)诉6.97(SEM0.15),P=0.033),但是从基线的变化表现出差异无显著差异两组(表6)。
正如预期的那样,碳水化合物代谢受到影响。
总SCFA产量显著在V3的INU-低聚木糖组(P=0.028),在与安慰剂相比有所增加。
在生产总
量没有变化,观察低聚木糖组中。
SCFA更新,然而,改性两组。
在V3,二者的丙酸和丁酸的贡献是更高的低聚木糖和INU-低聚木糖组(P,0.001)和乙酸是低在两个治疗组(P,0.001),与安慰剂比较。
这是通过从基线两组对C2,C3和C4的访问(表6)高度显著变化支承。
的贡献为原料生产的SCFA是不同的,如表6所示,与低聚木糖效果由于C2的生产和INU-低聚木糖降低由于增加C4生产。
在两个组中,C3:
C2比为进一步提高与安慰剂比较(表6)。
蛋白质代谢的影响只为对甲酚的低聚木糖组V3在(39.64(SEM3.43)毫克/克DM;
P=0.020)
与安慰剂相比(56.21(SEM5.90)毫克/克DM)。
最后,细菌酶的活性,在两个组相比,安慰剂组在V3(表6)增加。
免疫调节活性测试的产品被直接和间接测量这两个标记。
还有的S-IgA在INU-低聚木糖高70%,粪便表达在V3组较安慰剂组,这是未显著。
循环的LPS,然而,显著减少在V3与安慰剂比较(表7)。
免疫调节的间接措施是通过刺激全血与促炎细胞因子(LPS)和比较RNA的表达对细胞因子的产生进行。
对选定的细胞因子,代表两个亲和抗炎途径的基因的表达,通过用非刺激充足比较测定。
整体效果是促炎性响应于LPS孵育,这是显著的INU-低聚木糖组在抑制对IL-1β与安慰剂比较(表7)。
LPS反应的其它促炎细胞因子没有被调制。
抗炎细胞因子的表达被部分地在INU-低聚木糖组中恢复了对IL-13与安慰剂比较。
LPS的反应是不调制对IL-4。
低聚木糖丝毫不影响LPS-诱导的体外炎症轮廓。
全球范围内,观察到只有INU-X减少了“促炎'
Th1细胞通路(IL-b)的和”消炎“Th2/Treg途径(IL13)的刺激。
进行线性回归分析,调查是否循环的LPS的浓度可以是在细胞因子应答的混杂因素。
结果表明,这是不是