急性期脑梗死与血清NGF的关系研究1Word文件下载.docx

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结果：

1.急性期脑梗死患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分别是16.04±

1.33、12.26±

1.90、9.70±

2.73，对照组为5.43±

1.27，经统计学处理结果显示，急性期脑梗死发病第1d、7d和14d血清NGF含量均明显高于对照组（P＜0.01）。

同时，脑梗死组内各发病时间点血清NGF含量均有明显差异（P＜0.01）。

2.急性期脑梗死不同病灶大小及不同发病时间患者血清NGF含量的变化，大梗死灶组患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分别为18.31±

0.46、14.94±

0.62、13.71±

0.63；

中梗死灶组患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分别为16.20±

0.42、13.08±

0.73、10.76±

1.11；

小梗死灶组患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分别为14.96±

0.39、10.54±

0.81、7.32±

1.06。

通过统计学处理结果显示，不同发病时间点内的大中小梗死灶三组患者血清NGF含量均有显著差异（P＜0.01）。

结论：

1.急性期脑梗死患者血清NGF含量有先上升后下降的动态变化趋势。

2.急性期脑梗死患者血清NGF含量与脑梗死灶大小呈正相关。

3.检测脑梗死患者急性期血清NGF水平对于评估病情严重程度可能有重要的参考价值。

关键词：

神经生长因子，急性期脑梗死，酶联免疫吸附法。

第1章引言

脑梗死是指由于多种原因所致脑血液循环障碍，进而引起相应部位脑组织缺血、缺氧，最终发生组织坏死、软化形成梗死的疾病，是临床最常见的脑血管疾病，具有高病死率、高致残率和高复发率的特点。

近年来，由于医学影像学的飞速发展，CT和MRI的普及让罹患脑梗死的患者能够及早及时地被检出，这些在早期就被发现的脑梗死患者使得脑梗死的发病率大幅升高，患者不但要承受沉重的医疗经济负担，还要经受疾病带来的心理打击，所以做好脑梗死预防和治疗的工作就变得尤为重要，对脑梗死的进一步探究和寻求更优化的防治措施刻不容缓。

神经营养因子（neurotrophin,NT）是神经细胞生长与存活所必需的一类蛋白质分子，NGF隶属于神经营养因子家族，是人类发现的第一个神经营养因子。

NGF可以调节神经细胞的生长发育，维持成熟神经细胞生存以及对损伤神经的修复，它的这些特性使得众多国内外专家十分重视NGF在脑梗死领域的研究。

随着NGF的临床价值不断被挖掘，NGF有望成为诊治脑梗死的新切入点，提高内源性NGF的表达以及利用外源性NGF可能成为诊治脑梗死、降低致残率和死亡率的一种全新路径。

目前，众多研究机构对NGF进行了研究与开发，其重点多为外源性NGF，对于内源性NGF的研究虽然也引起了许多专家学者的关注，但是与脑梗死相关方面的临床研究甚少。

本研究通过检测脑梗死急性期患者血清NGF含量的变化，探讨其与急性期脑梗死的关系。

第1章关于急性期脑梗死与血清NGF关系的综述

2.1NGF的生物学基础

2.1.1NGF的基本结构及分布

NGF是由意大利科学家RitaLevi-Montalcini于1953年在小鼠肉瘤细胞内发现的首个神经营养因子[1]，它属于可溶性碱性蛋白质，沉降系数为7S，基因编码位于1号染色体（1P21-P22.1），遗传信息经转录、翻译后形成α、β、γ三个亚单位，在彼此非共价键的作用力下，按照α2β2γ2的形式连接成为多聚复合体，拥有140×

10³

kDa高相对分子质量。

其中，β亚单位承担了NGF绝大多数的活性功能，此亚单位拥有236个氨基酸，是由非共价键所维系的双链多肽，生物学功能相关区域在进化中高度保守。

NGF内有6个特殊的半胱氨酸残基，它们共组成3对二硫键，对NGF的生物活性起着至关重要的作用，二硫键一旦被水解，NGF也将失去生物活性[2-3]。

NGF还具有高度同源性，特别是在分子生物学活性方面无明显种属特异性，从雄性小鼠颌下腺中分离纯化出来的mNGF与人类NGF的同源性已达九成以上且作用于靶细胞的生物学效应无明显差异，这一特点使得mNGF被广泛地应用于科学研究和临床治疗中[4]。

在神经系统内，NGF主要在中枢胆碱能迈内特基底核的投射区产生，所以胆碱能神经细胞支配区是其主要分布区，大脑皮质和海马内胆碱能神经元含量非常丰富，所以脑内的NGF在这两个部位分布最高。

NGF在脑内其他部位的分布由高到低依次为：

嗅球、基底前脑、小脑和纹状体，在脑内的不均衡分布也体现了不同脑组织内胆碱能神经细胞的含量差异[5]。

此外，NGF在体内其他部位也有广泛分布：

如唾液腺、前列腺和胎盘组织等[6]。

2.1.2NGF的受体

NGF的受体主要有两种，分别为酪氨酸激酶A（tyrosinekinasereceptorA，TrkA）和神经营养素p75（neurotrophinreceptorp75）[7]。

前者亲和力强，能够与NGF特异性结合，引发相关蛋白酶活化，启动信号传导的一系列通路，最终使NGF的生物学效应得以表达，因此TrkA是NGF的功能性受体，遍布于NGF效应细胞的细胞膜上[8]。

p75是富含半胱氨酸的一类跨膜糖蛋白，其分布范围非常广，弥漫于中枢神经系统内，在神经系统内也有分布。

它的亲和力远远低于TrkA，与NGF结合后也无法直接产生生物学效应，但它拥有许多无可替代的功能[9]：

（1）能够准确辨识NGF家族，并与家族成员结合；

（2）可对酪氨酸激酶的活性加以调控，增强TrkA与NGF的结合能力，使NGF的生物学效应充分表达；

（3）逆向输送NGF，特别在修复病损的周围神经中表现明显；

（4）加剧神经鞘磷脂的水解速率，引导细胞凋亡；

（5）激发鸟苷酸结合蛋白耦联机制，保证生物信号稳定传递。

2.1.3NGF的信号传导通路

NGF拥有TrkA和p75两种受体，因为两者在各方面有着显著差异，所以它们各自介导着不同的信号通路[7]。

（1）TrkA一般介导正性信号，如促进神经细胞的存活、生长和分化等。

TrkA与NGF结合后在膜上生成二聚体，引发TrkA的多个酪氨酸残基自动磷酸化，进而激活下游信号传导蛋白，依照酪氨酸残基被激活的顺序，TrkA介导的信号传导通路依赖于以下3种途径的协同运作：

①丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）途径：

TrkA的残基Y490首先被磷酸化，进一步激活MAPK激酶，使MAPK通路开放，MAPK开启B淋巴细胞瘤-2基因（B-celllymphoma-2，Bcl-2）的表达，发挥抑制细胞凋亡的生物学效应。

②磷酯酶C-γ（phospholipaseC-γ，PLC-γ）途径：

TrkA残基Y785磷酸化后激活PLC-γ，经过一系列生化反应最终激活细胞外调节蛋白激酶（extracellularregulatedproteinkinases，ERK），产生增强神经细胞存活力和再生力的生物学效应。

③磷脂酰肌醇-3-羟激酶（phosphatidylinositol 

3-hydroxy 

kinase，PI3K）/蛋白激酶B（proteinkinaseB，PKB）途径：

TrkA残基Y751磷酸化后与PI3K相连，PI3K能激活PKB并且可以增强Bcl-2转录，PKB和Bcl-2共同增强神经细胞的存活能力。

（2）p75主要传导诱发细胞凋亡的负性信号，但也能介导少量的促进神经细胞生存的正性信号。

p75与NGF结合后传导信号的通路包括：

①核转录因子-κB（nuclearfactorkappa-light-chain-enhancerofactivatedBcells，NF-κB）途径：

邢雪松等人[10]在大鼠脑缺血再灌注模型的研究中发现NF-κB调控的基因编码产物具有抗氧化和增强细胞防御力的作用。

激活NF-κB能发挥其抵抗细胞凋亡的效应，同时可提高TrkA的活性。

②c-Jun氨基末端激酶（c-JunN-terminalkinase，JNK）-p53-BAX途径：

此通路主要能提高细胞凋亡的速度，JNK、p53、BAX依次被启动，其中p53的含量与细胞凋亡有直接联系[11]。

③神经酰胺途径：

此通路介导的生物学效应具有双重效果[12]，这一特性与蛋白激酶C（proteinkinaseC，PKC）跟神经酰胺相作用的浓度有关。

低浓度的神经酰胺可以激活PKC，能够促进神经细胞的生长发育；

而高浓度的神经酰胺则降低PKC的活性，导致神经细胞快速死亡。

如前所述，TrkA介导正性信号，p75主要传递负性信号，但在绝大多数的细胞背景和环境下TrkA能有效地抑制p75诱导负性信号[13]，最终使NGF的生物学总效应为促进神经细胞生长发育和增强病损神经的修复。

2.2NGF的生物学效应

（1）NGF在神经系统发育的初期，能通过促进神经干细胞的生长和分化、刺激神经纤维的定向生长、调控神经递质的合成、抑制神经细胞凋亡等途径，拥有调控神经细胞的存活数量，促进神经细胞分化和发育的生物学效应[14、15]。

（2）NGF还能增强多种成熟神经细胞的生存力，促进成熟细胞的轴索与其他细胞间的联系，因此具备了维持神经系统成熟阶段的生物学效应[16]。

（3）当神经系统遭遇损伤时，NGF的表达迅速升高，通过调节细胞周围的环境来保护受损神经细胞。

NGF促进轴突定向再生[17]，使之能与靶细胞形成功能连接，同时增强髓鞘修复力[18]，最终使损伤的神经细胞完成修复，达到改善神经功能缺损症状的目的。

NGF保护和修复病损神经系统的生物学效应，对于中枢神经和周围神经均奏效。

（4）另外，通过近年来对NGF的深入研究，发现其对非神经系统也有一定作用，如调控免疫系统功能、促进骨折愈合、影响炎性反应等[19]。

2.3NGF的药物学进展

NGF因其独特的生物学效应具有广阔的临床应用前景，可能成为许多疾病的潜在治疗药物，如视神经损伤、脑梗死、阿尔茨海默病、颅脑创伤、脊髓损伤和周围神经病等。

雄性小鼠颌下腺提取的mNGF具有安全、有效和毒副作用低的特点，是最常用的能够满足科学研究和临床应用条件的NGF，注射用鼠神经生长因子（恩经复）已在国内上市，药代动力学显示大鼠肌注后达峰时间越为4小时，24小时内吸收率高于80%，主要从肾脏排泄，极少部分随粪便排出。

注射用鼠神经生长因子具有治疗正己烷中毒性周围神经病和促进神经损伤恢复等疗效，给许多患者带来了福音。

现在临床应用的NGF多数经肌肉注射给药，绝大多数用来治疗周围神经的病变，NGF相对分子质量较大，自然状态下难以透过血脑屏障（blood-brainbarrier，BBB），对于大脑内部疾患的治疗效果甚微。

BBB是血液与脑组织间的一种特殊屏障，由血管内皮、基膜和星形胶质细胞终足构成，能够选择性地限制部分物质出入脑组织，对大脑具有一定的保护性。

近年来，许多研究发现BBB在某些条件下能够增加通透性：

李兵等人发现颅脑损伤后BBB能够一定程度上开放，开放的通透度与损伤程度呈正相关，NGF能随着BBB的开放而进入脑组织发挥作用[20]。

周文莉、严超英研究组通过对大鼠的实验发现脑组织缺氧能使BBB的通透性增加，利于外源NGF通过静脉抵达脑组织发挥作用[21]。

刘曾旭等人深入研究了血管内皮细胞之间的紧密连接，发现若紧密连接的结构和功能因外伤、缺血、缺氧、感染、免疫及理化因素发生改变，会不同程度地造成BBB通透性升高[22]。

基于以上多项研究，可以推测NGF在脑缺血时能够透过BBB的机制可能为：

（1）BBB的结构被破坏：

血管内皮和星形胶质细胞终足是BBB的两大组成结构。

血管内皮细胞间的紧密连接是BBB具有选择性的基础，当脑缺血发生时，血管内皮细胞间的紧密连接变得宽大疏松，导致BBB通透性增加[22]。

星形胶质细胞对维持BBB的功能具有关键作用，脑缺血会使星形胶质细胞的足突变得肿大，引起血脑屏障通透性增高[23]。

（2）特殊转运途径的开启：

脑缺血能够启动不饱和的跨膜扩散和需特异转运蛋白的饱和运输[24]，使得NGF等大分子物质能轻松通过BBB。

脑缺血发生后，NGF从脑组织经通透性增高的BBB进入血液，使得NGF能够在外周血中被检测，因此缺血性脑血管疾病与血清NGF含量有密切联系。

尽管在一些条件下BBB会因通透性提高而开放，NGF能自由进出BBB，但是难以在脑组织中维持理想的浓度，使其发挥稳定的生物学效应。

针对NGF在临床应用中面临的困境，目前许多国内外专家对NGF进行了深入研究，提出了重组细胞注入法、置管脑外注药法、特制眼液滴入法、神经通路给药法、聚合物植入法、化学连接法、生物素-抗生物素蛋白技术等新的给药途径[25-27]；

DingY等[28]通过大脑中动脉短暂缺血模型研究发现，运动能提高颅内NGF表达；

黄国栋团队将NGF封存于纳米柔性脂质体内，通过实验证明载NGF纳米柔性脂质体能够有效地促进其突破BBB[29]，以上研究有望拓宽NGF的临床应用领域。

2.4缺血脑组织NGF的含量变化

在正常生理状态下，脑组织中NGF的含量较低，但对神经细胞的生长发育、成熟和损伤后修复的意义重大。

刘鹏研究组[30]发现使斯泼累格·

多雷（Sprague-Dawley，SD）大鼠局灶性脑缺血后，皮层缺血半暗带NGF阳性神经细胞数目高于假手术组，提示脑组织缺血能上调缺血半暗带NGF表达水平，并推测脑组织在缺血情况下其内源性保护机制的开启与脑内NGF表达上调有关。

LindvallO等国外专家[31]发现脑缺血2小时后即出现NGFmRNA的表达增强，表达程度取决于脑组织缺血时间及病损程度。

我国张辉等[32]采用线栓法制作SD大鼠大脑中动脉闭塞（middlecerebralarteryocclusion，MCAO）模型，在局灶性脑缺血后24h发现NGF在缺血边缘区的神经细胞及胶质细胞胞浆内的表达均有明显上调，其中单纯脑缺血比合并其他疾病的脑缺血患者NGF表达更为明显。

魏孟琳、邹玉安等[33]通过相关实验也得出相似的NGF表达结果，他们发现实验大鼠的脑组织梗死区NGF的表达在发病初期有所增加，并在22小时左右达到高峰，后逐渐下降。

段淑荣、王海涛等人[34]则解剖了多例脑梗死患者大脑，研究了侧脑室室管膜下区和海马齿状回在不同时间点NGF的表达情况，发现脑组织在缺血后4.5~10小时NGF表达开始增多，缺血后24~70小时达高峰，3~4天开始下降，缺血5~6天仍有较多阳性细胞表达，提示NGF可能参与了缺血性脑损伤的内源性神经保护作用，同时发现转化生长因子-β（transforminggrowthfactor-β,TGF-β）、血管内皮生长因子（vascularendothelialgrowthfactor，VEGF）在表达时间上与NGF相重叠，三者对脑梗死后受损神经的保护作用可能具有协同性。

通过以上国内外专家学者的研究可以发现，脑组织缺血后可以提高NGF的释放，使缺血脑组织NGF的含量升高。

且NGF的表达具有一定的规律性。

2.5展望

NGF是一种具有促进神经细胞生长、发育和修复作用的大分子蛋白，其独特的生物学效应使其在治疗神经病变尤其对周围神经病变的治疗中效果显著。

近年来，在探索治疗中枢神经病变的道路上，已有多项动物实验和临床治疗病例[35-37]表明NGF在治疗脑梗死等疾病中拥有巨大的应用潜力。

随着NGF的研究重点由周围神经逐渐转向中枢神经，NGF与脑梗死的关系也愈加受到密切关注：

应用外源性NGF能使脑梗死病人在认知、语言和运动等方面有明显改善，降低致残率；

通过检测脑梗死病人血清NGF的含量可能对评估病情严重程度有重要的参考价值。

第3章实验研究

3.1资料与方法

3.1.1临床资料

脑梗死组患者的纳入条件：

2015年10月1日至2016年12月30日于我院神经内科住院的脑梗死急性期患者，且符合1995年中华医学会第四届全国脑血管学术会议制订的《各类脑血管病诊断要点》诊断标准[38]。

纳入标准：

（1）入院时尚在发病24小时内；

（2）行头部核磁检查，明确显示脑部急性梗死灶；

（3）具有明显神经功能缺损的定位体征。

排除标准：

（1）伴有其他系统的危重疾病者，如严重的心肺疾病、严重肝肾功能异常；

（2）伴发凶险的感染性疾病者；

（3）体内代谢障碍或旺盛，患有代谢性疾病者；

（4）免疫调节失衡，免疫功能异常者；

（5）具有肿瘤病史、器官移植史的患者；

（6）近4周内有手术、外伤史者；

（7）严重营养不良的患者。

按照以上标准共纳入患者90人，其中男性47人，女性43人。

年龄在43~78岁，平均年龄为62.19±

6.34岁。

根据郭玉璞[39]病灶大小分型法，将以上患者分为三组：

小梗死灶组（病灶最大直径＜15mm）、中梗死灶组（15mm≤病灶最大直径＜50mm）和大梗死灶组（病灶最大直径≥50mm）。

经既往病史询问、详细体格检查和多项辅助检查排除器质性疾病，共招纳对照组20名同期健康体检者，其中男性11人，女性9人，年龄在44~75岁，平均年龄为63.57±

脑梗死组与对照组在年龄、性别上的差异均无统计学意义。

3.1.2标本收集

脑梗死组患者分别于发病第1d、7d和14d采集清晨空腹静脉血5ml，血样经检查无溶血后离心处理15分钟，取上层血清置于Eppendorf管中放入-70℃冰箱保存。

采集对照组健康体检者的清晨空腹静脉血1次，采集处理的过程与脑梗死组无差异。

3.1.3实验方法

检查各样本无气泡、浑浊沉淀和反复冻融后，按照ELISA试剂盒说明书的操作步骤进行血清NGF含量的测定。

根据标准品的浓度、对比度的吸光度（A）值计算出标准曲线的直线回归方程，再根据样品的A值在回归方程上计算出对应的样品浓度。

3.1.4统计学方法

实验所得的原始数据录入SPSS22.0软件中进行统计分析，两样本之间的对比采用t检验，用方差处理分析多组间的比较，用均值±

s）来表示得到的计量数据，P＜0.05表示有统计学意义。

3.2结果

3.2.1脑梗死组患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量的动态变化

急性期脑梗死患者发病第1d、7d和14d血清NGF的含量（ng/L）分别为16.04±

1.27。

经统计学处理后发现：

脑梗死发病第1d、7d和14d血清NGF的含量均明显高于对照组（P＜0.01），并且脑梗死发病第1d、7d和14d血清NGF含量之间也有显著性差异（P＜0.01），详见表3.1、图3.1。

表3.1急性期脑梗死患者不同发病时间血清NGF含量的动态变化（

s，ng/L）

组别nNGF

对照组205.43±

1.27

梗死组1d9016.04±

1.33*

梗死组7d9012.26±

1.90*＆

梗死组14d909.70±

2.73*#

注：

*表示实验组各组与对照组比较P＜0.01，＆表示发病7d与发病1d比较P＜0.01，＃表示发病14d与发病7d比较P＜0.01。

图3.1急性期脑梗死患者不同发病时间血清NGF含量的动态变化比较图

3.2.2急性期脑梗死不同病灶大小及不同发病时间患者血清NGF含

量的动态变化

大梗死灶组患者发病第1d、7d和14d血清NGF含量（ng/L）分别为18.31±

经统计学处理，不同发病时间点内的大中小梗死灶三组患者血清NGF含量均有显著差异（P＜0.01）。

详见表3.2、图3.2。

表3.2急性期脑梗死不同病灶大小及不同发病时间患者血清NGF含量的动态变化（

组别n发病1d发病7d发病14d

大梗死灶组1818.31±

0.46△14.94±

0.62△13.71±

0.63△

中梗死灶组3016.20±

0.42▲13.08±

0.73▲10.76±

1.11▲

小梗死灶组4214.96±

0.3910.54±

0.817.32±

1.06

▲表示小梗死灶组与中梗死灶组比较P＜0.01；

△表示中梗死灶与大梗死灶组相比较P＜0.01。

*表示各组间后一组与前一组比较P＜0.01。

图3.2急性期脑梗死患者发病不同时间不同梗死灶大小血清NGF含量动态变化比较图

第3章讨论

NGF是神经生长因子家族中最重要的神经细胞生长调节因子之一，主要分布于神经系统，尤其在大脑内广泛存在。

NGF与相应受体结合后，经不同的信号转导通路发挥作用。

在正常生理状态下，NGF能够促进神经细胞的生长和分化，维持神经细胞的成熟[40]；

当机体处于病态时，NGF可以促进病损细胞修复，抑制细胞凋亡[41]。

因此NGF拥有广阔的临床应用前景。

NGF的生物学特性主要表现在以下几个方面：

在神经系统发育的初期，NGF就已经开始发挥作用，能够促进神经细胞的生长发育和分化；

NGF能提高成熟神经细胞的生存力，可以维持神经系统的成熟状态；

当神经系统损伤时，高表达的NGF可以稳定细胞内外的环境，促进病损神经细胞的修复；

此外，NGF对于非神经系统也有一定积极作用。

脑组织缺血后，受堵塞的血管周围有少量血液渗出，局部缺血脑组织出现水肿，大脑耐受缺血缺氧的程度较弱，短时间内就能引发脑梗死[42]。

脑梗死急性期病灶是由大量神经细胞死亡的中央坏死区和周边仍残存部分侧支代偿性循环的缺血半暗带组成，