银杏黄酮在镍柱上的吸附特性的初步研究学士学位论文Word格式.docx

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1）设计（论文）

2）附件：

按照任务书、开题报告、外文译文、译文原文（复印件）次序装订

3）其它

目录

摘要I

AbstractII

1引言1

1.1本课题研究的意义1

1.2银杏及银杏黄酮的概述2

1.3银杏黄酮化合物的基本结构及性质2

1.3.1黄酮化合物的基本结构2

1.3.2黄酮化合物的性质3

1.4银杏黄酮化合物的功能及临床应用5

2材料与方法6

2.1实验仪器6

2.2实验材料与试剂6

2.3实验方法7

2.3.1芹菜素标准曲线的测定7

2.3.1.1芹菜素标准溶液的制备7

2.3.1.2高效液相色谱法测定标准溶液8

2.3.2银杏的分离8

2.3.2.1样品的预处理8

2.3.2.2镍柱体积对银杏黄酮螯合的影响8

2.3.3吸附等温线的研究9

2.3.3.1样品制备9

2.3.3.2色谱条件的确定10

2.3.3.3流动相配制10

2.3.3.4高效液相色谱仪的平衡10

2.3.3.5检测10

2.3.4镍柱的再生10

3结果与分析11

3.1芹菜素标准溶液的检测结果及标准曲线的绘制11

3.2线性关系的考察12

3.3镍柱对银杏黄酮的吸附效果的影响13

3.3.1吸附后洗脱液的检测结果13

3.3.2平衡时吸附量的计算以及吸附等温线的绘制18

4结果讨论与结论20

4.1实验现象20

4.2讨论20

4.2.1等温吸附分离的讨论20

4.2.2HPLC测定的讨论20

4.3结论21

参考文献22

实验感想及致谢23

摘要

黄酮类化合物是从大量植物中提取分离得到的一种酚类物质。

许多研究表明黄酮类化合物具有很多生理活性，包括抗过敏、抗病毒、消炎和舒张血管等。

这些多酚类物质被人体吸收后潜在许多对健康有益的影响。

前期实验表明：

镍柱可用于银杏黄酮的分离纯化。

为了更好地将镍柱应用到银杏黄酮分离纯化中，本实验采取不同浓度的黄酮类化合物与镍柱作用，用高效液相色谱法进行检测，然后通过静态吸附等温线讨论镍柱吸附黄酮的效果，为研究黄酮化合物的分离奠定了理论基础。

结果表明：

黄酮化合物在pH=8的缓冲液条件下能很好地与镍柱发生螯合，并且pH=4的缓冲液能够将镍柱上吸附的黄酮类化合物洗脱下来；

通过高效液相色谱法检测，得出镍柱的吸附量随着样品的浓度增大而明显，吸附等温线的方程为y=9.5612e0.213x，R2=0.98；

吸附等温线与Langmuir型曲线拟合度较好。

高效液相色谱法能够获得良好的分离结果，且具有操作简单、分离选择性强等优点。

关键词：

银杏黄酮；

分离；

螯合；

高效液相色谱；

吸附等温线

Abstract

Flavonoidsarephenolicsubstancesisolatedfromawiderangeofplants.Manystudieshavesuggestedthatflavonoidsexhibitbiologicalactivities,includingantiallergenic,antiviral,anti-inflammatory,andvasodilatingactions,thepolyphenolwithpotentialhealtheffects,areabsorbedbyhumans.Becausethebodycannotdirectsynthesisofflavonoidsandcanonlybeobtainedfromfood,sotheresearchonflavonoidsseparationmethodhasimportantsignificance.AftertakingthetestwithNi+chelatingeffectsofflavonoidsshakenonashaker10hours,weuseHighPerformanceLiquidChromatographytodetectandstudytheabsorptionofflavonoidsNi+adsorptioneffect,thendrawNi+columnadsorptionisotherms.Experimenttostudytheobjectasflavonoids,withNi+columnatpH=7.2bufferandflavonoidscanchelate,andpH=3buffercanbeelutedbyHPLC.ThefocusofthisafterremovaloftechnicalprocessingandvariousimpuritiesseparationeffectofflavonoidsDiscussiontheresultsshowthat:

inthetestsamplecanreachequilibrium30min;

adsorptioneffectincreasesastheconcentrationofthesampleisreduced;

adsorptionisothermsfitgoodwithLangmuireffect;

andHighPerformanceLiquidChromatographycanobtaingoodseparationeffect,andoperateinaeasywayandotheradvantages.

Keywords：

Ginkgoflavonoid;

separation；

chelation；

HighPerformanceLiquidChromatography;

staticstateadsorptionisotherm

1引言

1.1本课题研究的意义

黄酮类化合物是一类在植物中分布非常广泛，并且非常重要的多酚类天然物质，可以用来作为药物和具有非常可观的生理活性。

广泛存在于高等植物中，如银杏黄酮即银杏叶提取物。

存在于叶表皮细胞和表皮蜡质部分黄酮类化合物可用于保护由UV-B对植物的影响；

并且豆科植物根中在根瘤菌在被感染过程中黄酮类化合物有可以起到非常重要的指示作用以及对于植物的固氮系统的建立有着有效的指导的功能[1]。

黄酮可以提高大脑中血管的血液的流量，有利于大脑血管中血液的循环功用，保障大脑中的细胞不受到伤害，扩大冠状动脉，能够有效地预防心绞痛和心肌梗塞及脑血栓形成，增强机体免疫能力。

有益于冠心病、心绞痛、脑动脉硬化、老年痴呆症、高血压的治疗。

因此，黄酮类化合物的生理活性自然引起了人们的高度关注，研究黄酮类化合物的特性也已成为国内外食品医药等行业的一个重要的研究项目。

近年来大多数科学研究学者都要从植物的体内提取分离纯度和生物活性都比较高的黄酮类化合物，所以黄酮类化合物的提取分离具有重要的意义，也可以用黄酮类化合物开发功能性食品和保健性食品，市场前景十分广阔。

具有高纯度银杏叶黄酮类化合物的分离一直备受关注，目前国内外，每年有大量这方面的人力和物质资源的深入研究。

国内外有很多国家已经研究了银杏叶中的化学成分和黄酮化合物的分离方法、它的药理分析实验和一些临床的具体应用。

相比于德国、法国、日本等一些发达国家而言，我们国家对银杏资源的开发利用起步稍微较晚一些，并且银杏的利用率也比较低的。

在崇尚绿色、安全、健康意识的今天，黄酮类产品为优质保健产品，有效的医疗产品的高新技术的研究和发展，具有广阔的开发应用前景。

银杏叶中总黄酮类化合物已被证明是有效的活性成分的药用价值和保健功能，越来越受到重视，有研究价值和开发潜力巨大。

1.2银杏及银杏黄酮的概述

银杏是一种古代二叠纪子遗树种具有活化石之称[2]。

银杏叶中的有用的物质主要是黄酮苷（flavonesandglycosides）类化合物和萜类脂类化合物。

在叶用银杏树种的选育、叶子采摘期的确定，栽培环境（地点）的优选、以及培育方法研究等方面，都需要测定银杏叶中的黄酮含量作为品质评价的依据。

银杏叶中的黄酮类化合物主要由槲皮素（quercetin）、山奈酚（kaempferol）、异鼠李素（isorhamnetin）、杨梅皮素（myricetin）、木犀草素（luteolin）和洋芹素（apigenin）的单、双、叁葡萄糖甙组成[2],其中杨梅皮素、木犀草素和洋芹素所占的比例很小，所以只要测定出前三种的主要成分含量就可以基本反应出黄酮类化合物的含量高低[3]。

银杏黄酮是通过一些方法从银杏的叶子中经过提取分离等过程得到的，所以又被叫做银杏叶提取物。

银杏是我国特有的植物，保留着远古的生产形态，生产于我国大部分地区，例如湖北、江苏、广西等地方。

大部分黄酮类化合物从银杏叶中提取，其颜色和形态为：

浅黄色可流动粉末态。

总萜内酯含量8-10%（HPLC法）、白果内酯≥2.5%、银杏内酯A≥1.4%银杏内酯B≥1.2%、银杏内酯C≥0.9%、银杏酸≤1-5ppm、重金属含量≤20ppm、、AS≤1PPM干燥失重≤3%、炽灼残渣≤1.5%、溶济残留≤1%。

主要的用途有制取药品、功能性产品、日用化妆品等很多领域，提高脑血管流量，减小大脑中的血液阻力，改进脑血管血液的流动和循环能力，防止大脑细胞受缺血损伤，扩大冠状动脉，能够有效地预防心绞痛及心肌梗塞，抑制血液中血小板汇集在一起，防止血栓形成，除去对人体不利的氧化自由基，增强人体内免疫功，具备防止癌症的发生和抵抗衰老的特性。

1.3银杏黄酮化合物的基本结构及性质

1.3.1黄酮化合物的基本结构

黄酮类化合物的结构中有15个C（C6-C3-C6），结构主要由两个苯环连成，其中有一个C3部分连接两个苯环，见图1。

黄酮化合物分类主要基于以下结构特征：

（1）C3桥是开环还是与C6部分形成氧杂环；

（2）如果黄酮类化合物的结构是成环的，判断是五元环还是六元环；

（3）B环的连接位置；

（4）C环的氧化程度；

（5）化合物是单体、二聚体还是多聚体。

图1黄酮类化合物的基本骨架

黄酮母核的多样性主要由黄酮本身的骨架、环系的变化、氧化程度和数量而定。

目前发现的黄酮化合物中，只有查尔酮和二氢查尔酮C环卫开环。

其他黄酮都有三个环，即A环、B环和涉及两个或三个桥碳的氧杂环C环。

黄酮、黄酮醇、二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷和花青素等是以C环的氧化程度的不同为分类依据的。

异黄酮类化合物的基本骨架是B环连接在C-3的位置，主要有8种黄酮类化合物，它们都是由基本型异黄酮经过生物转化而得到的。

1.3.2黄酮化合物的性质

1.结晶性

黄酮类化合物大多数结构形态为固体结晶状态，少数（如黄酮苷、花色苷苷及元）是无固定形态的粉末状，并且熔点非常高，具备一定的旋光性。

2.颜色

黄酮类化合物的颜色的主要影响因素是苯甲醛和肉桂交叉共轭体系的现象和助色团分子（-OH，-OCH3）与相关的类型，数量和助色基团取代的位置。

（1）花色苷及苷元的颜色与pH有关：

当pH小于7时则显示红色，当pH﹦8.5时显紫色，当pH大于8.5时显示黄色。

（2）在紫外光的条件下:

若3-位置被羟基取代时，则显示亮黄色或黄绿色的银光；

如果3-位置的羟基被甲基化时，就显示暗绿色的银光。

查尔酮和橙酮呈深黄色或绿色，明亮的黄色，二氢黄桐（酒精）和儿茶素是不显色的。

3.旋光性

对于黄酮苷元母核，具有旋光性的黄酮分子有内含有手性碳原子的二氢黄酮、二氢黄酮醇、黄烷及黄烷醇，其他类黄酮化合物则没有光学活性。

因为黄酮苷类结构中引入了糖分子，所以都具有旋光性，并且大多数旋光特性为左旋[4]。

4.酸性

黄酮化合物的酸性强弱次序如下：

7，4ˊ-二-OH﹥7-OH，4ˊ-OH﹥一般酚-OH﹥5-OH

在天然黄酮类化合物的产物的分离过程当中，根据黄酮化合物酸碱性的差异，可将它从混合物中吸附或层析出来。

5.碱性氧原子的性质

由于黄酮分子中的吡喃环上的氧原子具有没有共用的电子对，所以显示微弱的碱性，可以和一些强酸发生酸碱中和反应生成相应的盐。

但生成的盐的化学性质极其不稳定，在加水后就可以发生分解反应。

正是由于这一特殊性质可以用来鉴别黄酮类化合物是否存在，例如黄酮化合物容易溶解在浓H2SO4中生成相应的盐类物质，通常会显示出特殊的颜色[5]。

7.溶解度

黄酮苷元的溶解特性是很难溶于水或不溶于水，溶于乙醚等有机溶剂和稀碱溶液。

当黄酮苷分子的结构中有羟基或有糖存在时，它的极性会增强，黄酮苷在极性溶剂中溶解度也会发生增大。

花青素在水中的溶解度之所以很大是因为花青素在水中以离子的形式存在。

8.显色反应

黄酮化合物的显色反应的类型有以下几种：

碱性的显色反应；

金属盐类试剂的配位反应，比方说和铝盐、铅盐、锆盐和锶盐试剂等发生的配位反应；

硼酸的显色反应；

还原反应（HCl-Mg、HCl-Zn、NaBH4）[6]。

1.4银杏黄酮化合物的功能及临床应用

1.抗活性氧自由基功能

黄酮类化合物可以阻碍体内外脂质的过氧化反应，其过程中扮演的角色是作为超氧阴离子自由基和羟自由基的消除。

2.降血脂和降血清胆固醇的作用

类黄酮物质可以防止动脉粥样硬化，其主要的途径是通过①除掉自由基②螯合金属离子③保护维E等抗氧化物质来防止被低密度脂蛋白氧化。

3.其他作用

类黄酮化合物可以影响人体内小肠的流动性。

如槲皮素以及其他类黄酮化合物可以用来抑制豚鼠回肠的收缩功能[7]。

槲皮素也可以协助机体维持晶体在受到氧化损伤后的透明性，从而起到预防人类白内障的作用[8]。

4.治疗冠心病、心绞痛

银杏提取物对治疗人类的冠心病和心绞痛都有明显的效果，可以很好地改善冠心病病人的头发晕、胸闷、心悸、呼吸气短、没有力气等症状，能够改良心脏的血液流量，使人体内胆固醇含量变低、降低甘油三酯含量，机体内的血液流变的某些指标得到了改善，因此具有很重要的意义。

5.治疗高血脂症

银杏叶提取物对一些肥胖人群相对较高具有一定的治疗作用，能明显地降低中老年人人体血脂冠心病水平的变化率。

2材料与方法

2.1实验仪器

仪器名称及型号

仪器厂家

BCD-L36型冰箱

美菱股份有限公司产品

JPT-1型架盘天平

江苏常熟衡器厂产品

旋转蒸发器水浴槽

上海青浦沪西仪器厂

SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵

郑州长城科工贸有限公司

C18柱（250mm×

4.6mm，5μm）

美国安捷伦有限公司

高效液相色谱仪

美国waters公司

摇床

上海世平实验设备有限公司

移液抢

ThermoElectron有限公司

超纯水器（优普）

超声波清洗机

昆山正耀电子科技有限公司

杭州法兰特超声波科技有限公司

2.2实验材料与试剂

（1）芹菜素标准品（购于合肥大药房）

（2）银杏提取物经水解浓缩后的溶液（16mg/ml）

（3）无水乙醇95﹪（分析纯）

（4）甲醇（分析纯）

（5）超纯水，实验室制备；

（6）哇哈哈纯净水，超市购买；

（7）4%质量浓度（下同）的氢氧化钠；

5%亚硝酸钠；

10%硝酸铝；

0.2mol/l磷酸氢二钠；

0.2mol/l磷酸二氢钠；

0.1mol/l邻苯二甲酸氢钾；

0.1mol/lHCl；

1mol/lNaCl；

（8）pH=8的结合缓冲液：

0.2mol/l磷酸氢二钠9.47ml和0.2mol/l磷酸二氢钠0.53ml混合稀释到20ml；

（9）pH=4的洗脱缓冲液：

0.1mol/l邻苯二甲酸氢钾10ml和0.1mol/l盐酸0.02ml混合稀释到20ml；

（10）100mmol/l乙二胺四乙酸二钠（以下简称EDTA-2Na）；

（11）六水合硫酸镍（以下简称NiSO4•6H2O）。

2.3实验方法

标准品真空冷冻干燥（至恒重）标准溶液的配制检测

绘制标准曲线

样品预处理（原液）镍柱螯合流穿（流穿液）洗脱（洗脱液）检测（原液、流穿液、洗脱液）

2.3.1芹菜素标准曲线的测定

2.3.1.1芹菜素标准溶液的制备

（1）芹菜素标准溶液：

将从大药房购买回来的芹菜素标准品粉末用真空冷冻干燥机干燥至恒重，然后用分析天平称取4.6mg的芹菜素标准品用溶液（乙醇:

超纯水=1:

1）定容至4.6ml，再摇匀备用，通过计算可得溶液的浓度约为1mg/ml。

（2）用移液枪移取1ml

（1）中的溶液至试管中然后用溶液（乙醇:

1）定容至3ml，再摇匀备用，并标为A液。

浓度为0.3mg/ml。

（3）用移液枪移取A液1ml于试管中再用溶液（乙醇:

1）定容至1.5ml，再摇匀备用，并标为B液。

计算得浓度为0.2mg/ml。

（4）用移液枪移取A液1ml于试管中再用溶液（乙醇:

1）定容至3ml，摇匀后备用，并标为C液。

计算得浓度为0.1mg/ml。

（5）用移液枪移取C液0.5ml于试管中再用溶液（乙醇:

1）定容到1ml，摇匀后备用，并标为D液。

计算得浓度为0.05mg/ml。

（6）用移液枪移取C液0.25ml于试管中再用溶液（乙醇:

1）定容到1ml，摇匀后备用，并标为E液。

计算得浓度为0.025mg/ml。

2.3.1.2高效液相色谱法测定标准溶液

用无水甲醇（0.5ml/min）和纯净水（0.5ml/min）对色谱柱进行平衡，大约平衡30min。

待平衡后用注射器分别抽取ABCDE标准溶液1ml过滤后于进样瓶中，然后分别进样10μl。

2.3.2银杏的分离

2.3.2.1样品的预处理

称取1g银杏提取物，加甲醇-25%HCl（4:

1）混合液25ml，60℃加热回流30min，放冷，移至50ml容量瓶中，甲醇定容。

然后在经过预处理的大孔树脂中经过装柱、上样、洗脱、浓缩后得到样品液，经计算可得原样液中银杏化合物的浓度大约为12.9mg/ml。

取原液1ml于试管中（yy12.9mg/ml）。

2.3.2.2镍柱体积对银杏黄酮螯合的影响

取1.0ml镍柱，用7ml蒸馏水冲洗镍柱，再用10.5ml（pH=8的缓冲液和1mol/L的NaCl）平衡，平行做三组镍柱备用。

第一组取5.5ml的银杏样液（12.9mg/ml）和3.5ml（pH=8的缓冲液：

1）的混合液加入镍柱中，经计算可得银杏样液的浓度大约为7.8mg/ml。

在摇床（110rpm28.9℃）上震荡10小时；

流穿后，收集于试管中（lcy7.8mg/ml），再用95%乙醇和pH=8的缓冲液（1:

4）2ml洗脱后收集于试管（xty①7.8mg/ml），再加入95%乙醇和pH=4.0缓冲液（1:

1）4ml洗脱后收集于试管（xty②7.8mg/ml）。

第二组取4ml的银杏样液（12.9mg/ml）和5ml（pH=8的缓冲液:

1）的混合液加入镍柱中，经计算可得银杏样夜的浓度大约为5.7mg/ml。

流穿后，收集于试管中（lcy5.7mg/ml），再用95%乙醇和pH=8的缓冲液（1:

4）2ml洗脱后收集于试管（xty①5.7mg/ml），再加入95%乙醇和pH=4.0缓冲液（1:

1）4ml洗脱后收集于试管（xty②5.7mg/ml）。

第三组取2.5ml的银杏样液（12.9mg/ml）和6.5ml（pH=8的缓冲液:

1）的混合液加入镍柱中，经计算可得银杏样夜的浓度大约为3.6mg/ml。

流穿后，收集于试管中（lcy3.6mg/ml），再用95%乙醇和pH=8的缓冲液（1:

4）2ml洗脱后收集于试管（xty①3.6mg/ml），再加入95%乙醇和pH=4.0缓冲液（1:

1）4ml洗脱后收集于试管（xty②3.6mg/ml）。

2.3.3吸附等温线的研究

2.3.3.1样品制备

取“yy12.9mg/ml”溶液0.5ml于试管中，再取0.5ml（超纯水:

95%乙醇=1:

1）的混合液于试管中，混匀后用注射器过