维生素的测定Word下载.docx

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⑶VB1为白色结晶，微溶于C2H5OH，不溶于乙醚或CHCl3，易溶于水。

3、VB1的测定

世界各国都用荧光法测定

⑴原理：

硫胺素在碱性铁氰化钾溶液中，被氧化成一种兰色荧光物质，即为硫色素，在紫外光

下，硫色素发出荧光。

⑵方法

①萃取

100g样品于干燥烧杯中，加入100ml0.1NH2SO4，打成匀浆，煮沸30分钟，称取一定的样品经高压锅121℃、20分钟高压酸解

②水解

在酸解的样品中冷却后加入含有10%糖化酶的10ml2.5MNaAC溶液，摇匀，用15%NaOH调PH=4.5，用淀粉酶使淀粉水解，也可用磷酸酶使淀粉水解，于50℃恒温箱中12小时

③纯化

采用柱层析提纯

吸附剂采用的是人造浮石。

人造浮石用25%KCl溶液分数次洗涤，主要是把VB1吸附上去，吸附上去后，再用热水淋洗，最后用25%KCl-HAC把VB1洗脱下来，这样就得到纯VB1，再根据上面的原理在碱性下分析。

④分析　

装填柱子（离子交换柱）→提纯→氧化→测定　

脂溶性维生素的测定

一、维生素A

目前维生素A都是合成的，来源：

（1）从动物肝脏中得到；

（2）从维生素前体而得到（维生素前体：

主要指类胡萝卜素，主要是β-胡萝卜素）

维生素A的测定常用的方法有三氯化锑比色法、紫外分光光度法、荧光分析法、液相色谱法。

对于三氯化锑比色法适用于样品中含VA高的样品，方法简便、快速、结果准确，但是对维生素A含量低的样品，如每克样品中含5～10μg维生素A时，这时样品由于受其脂溶性物质的干扰，不应用比色法测定。

对于紫外分光光度法不必加显色剂显色，可直接测定维生素A的含量，对样品中含VA低的也可以测出可信结果，操作简便、快速。

1、维生素A的性质

⑴因有许多不饱和链，故见光易分解；

⑵在缺氧情况下，对热较稳定，对光特别敏感。

如测强化奶粉时，速度要快，一般要求测定时间长短，因为时间长，见光时间长，见光分解，故测出的比出厂的含量要少；

⑶对碱稳定；

2、测定步骤

⑴样品用有机溶剂萃取脂类

样品可以根据脂肪的测定处理脂肪，即索氏抽提法，采用乙醚作提取剂，也可用热苯回流方法提取脂类。

如果样品中含蛋白质和淀粉多的情况下可采用乙醚提取法。

⑵脂类的皂化

脂类有维生素和脂肪这两部分通过皂化（50%KOH、无水C2H3OH、热回流）把它们分开，得到一部分皂化物和一部分不皂化物。

皂化条件：

（1）C2H3OH︰脂类=8︰1；

（2）KOH量=脂量×

皂化价（mg）×

2.5；

（3）皂化温度与时间：

70℃、30分钟

在皂化时可以加入抗氧剂连苯二酚和对苯二酚，防止氧化。

⑶提取：

不皂化物和皂化物经水、苯、乙醚萃取可得到不皂化物。

⑷柱层析分离干扰物质

采用柱层析分离干扰物质，如果柱层析把β-胡萝卜素也洗脱下来，那么这时维生素A与β-胡萝卜素就是一个混合物，还要将它们分离开。

如果样品中只有维生素A而不含β-胡萝卜素时，这时可直接定容。

维生素A与β-胡萝卜素分离：

吸附剂：

8分中性Al2O3和2分碱性Al2O3混合，装柱

分离方法：

a.用2%丙酮石油醚洗β-胡萝卜素；

b.用乙醚洗VA。

3、测定方法

⑴SbCl3比色法

维生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3→形成兰色物质→在620nm有最大吸光峰

这种兰色物质不稳定，很快褪色或变成其它物质，所以在分析时最好在暗室中进行，并且做标准曲线。

计算：

每百克样品含VA的量=C×

（V1/V2）×

（100/W）

C：

从标准曲线上查得VA的量

V1：

CHCl3定容的量

V2：

测定所取样液体积

⑵紫外分光光度法

a.原理：

VA为脂溶性的，测定VA时必须先将样品中的脂肪抽提出来进行皂化，萃取不皂化部分，在经柱

层析除去杂质等干扰物质，在紫外328nm下测定，求出含量。

b.方法

1）提取及皂化

称样10.00g→于烧杯中→加40ml水搅匀→移250ml分液漏斗中→加氨水5ml→加乙醇35ml→

摇匀→用乙醚抽提（每次40ml抽提三次）→收集乙醚层→用10ml水洗乙醚层三次→水层再

用30ml乙醚抽提一次→合并所用乙醚→用索氏法除乙醚→待瓶中乙醚除尽后→加30ml80%

的KOH→40mlC2H5OH→加0.8g焦性没食子酸→83℃水浴30分钟（皂化脂肪）→冷却后移入

250ml分液漏斗中→加60ml水→用40ml乙醚抽提三次→合并乙醚抽提液→用水洗至中性→

用索氏法除乙醚→除去后用5ml石油醚溶解瓶中内容物→然后移入刻度试管中

2）层析

在层析柱内装8cm高度中性氧化铝→2cm高度碱性氧化铝及1cm无水硫酸钠→以石油醚浸透→装皂化后的样液慢慢于柱内→用1～2ml石油醚洗试管→洗液倒入柱内，活塞打开以每分钟为35滴左右的速度打开，当液面降到接近硫酸钠时→加5ml石油醚→随后用5ml洗脱液逐次洗涤。

层析柱上第一个黄色层析层，一般是β-胡萝卜素，此带在12%洗脱液前后洗去，收集于10ml容量瓶中直到流出物不呈黄色为止，此层可测β-胡萝卜素用，而VA一般在50%洗脱液洗出，用2ml刻度吸管收集1ml。

吸约0.2ml于小试管中→加0.3ml25%三氯化锑→溶液如呈兰色→表明有VA存在，故0.5ml用石油醚定容10ml。

3）样液测定

以石油醚为空白

4）计算

VA（I.μ100G）=（E×

106×

2）/（1830×

100×

W）×

（1000/0.3）

0.3：

每0.3μgVA相当于1I.μ

E：

消光值W：

样品重量（g）

1830：

石油醚中其消光值1%cm为1830

（I.μ）：

一个国际单位，维生素A相当于0.6μgβ-胡萝卜素。

4、试剂

⑴50%KOH；

⑵无水硫酸钠；

⑶乙醚（不含过氧化氢）；

⑷石油醚；

⑸苯；

⑹45%C2H5OH（应不含醛类物质）

酒精中含醛类的检查方法：

首先配银氨溶液，在50%硝酸银溶液中加入浓氨水，直到氧化银沉淀又重新溶解为止，在小试管中加2ml银氨溶液，加3～5滴酒精，摇匀，加10%NaOH1滴加热，若有银镜反应，表示乙醇中含有醛。

脱醛处理：

取乙醇2000ml→加AgNO32g→振摇溶解→加NaOH4g→振摇溶解→过滤→上清液→蒸馏→即可

⑺20～25%SbCl3的CHCl3

先量取100mlCHCl3于广口瓶中，用减差法称取一定量的干燥SbCl3，SbCl3易吸水，所以必需蒸馏重结晶后使用，一般用沙浴上加热。

二、维生素D

维生素D在鱼肝油和鸡蛋黄等食品中含量较多，一般成人不会缺VD，而婴儿容易缺乏。

1、操作步骤

⑴提取

样品（奶粉）＋水→混匀在NH4OH的作用下酪蛋白Ca盐溶解加入乙醇使脂肪球分离→乙醚、石油醚萃取得到脂质（其它样品可用索氏提取得到脂质）　

⑵皂化

在奶粉中脂溶性物质有VD、β-胡萝卜素、VA、VE、甾醇、脂肪。

目前皂化有三种情况：

低温（室温）

中温（70℃±

2℃）

高温（100℃15min）

低碱

回收率不完全

回收率46%

回收率70%

低碱=脂肪︰KOH为1︰2.5的关系

另外在皂化时加抗氧化剂与不加抗氧化剂回收率不一样，加抗氧化剂的回收率高于不加抗氧化剂的回收率。

有人将上面的皂化条件互补，采用中温-高碱并加抗氧化剂，这样的回收率为96.8%，效果较好。

故皂化条件：

70℃±

2℃高碱+抗氧化剂

⑶萃取

⑷除甾醇

甾醇在食品中含量较多，主要是通过柱子，这个柱子就是毛地黄皂甙。

甾醇+毛地黄皂甙→沉淀

洗脱液用乙醚︰己烷=1︰5配制而成

甾醇︰毛地黄皂甙=1︰14用量

⑸皂土柱层析

当VD与VA共存时，须用皂土柱层析除VA及VA的分解产物。

测定方法有两种：

比色法：

维生素A／CHCl3＋SbCl3／CHCl3／乙酰氮→形成橙黄色物质→500nm下测定

紫外分光光度法　

VD／乙醇→265nm下测定　

维生素C的测定

维生素C是一种已糖醛基酸，有抗坏血病的作用，所以被人们称做抗坏血酸，主要为还原型及脱氢型两种，广泛存在于植物组织中，新鲜的水果、蔬菜，特别是枣、辣椒、苦瓜、柿子叶、猕猴桃、柑橘等食品中含量较多。

它是氧化还原酶之一，本身易被氧化，但在有些条件下又是一种抗氧化剂。

维生素C（还原型）纯品为白色无臭结晶，熔点190～192℃，溶于水或乙醇中，不溶于油剂。

在水溶液中易被氧化，在碱性条件下易分解，在弱酸条件中较稳定，维生素C开始氧化为脱氢型抗坏血酸（有生理作用）。

如果进一步水解则生成2，3-二酮古乐糖酸，失去生理作用。

根据它具有的还原性质可以测定维生素C的含量。

常用的测定方法有

（1）2，6-二氯靛酚法（还原型VC）

（2）2，4-二硝基苯肼法（总VC）

（3）碘酸法

（4）碘量法

（5）荧光分光光度法

一、2，6-二氯靛酚滴定法

1、原理：

还原型抗坏血酸还原染料2，6-二氯靛酚，该染料在酸性中呈红色，被还原后红色消失。

还原型

抗坏血酸还原2，6-二氯靛酚后，本身被氧化成脱氢抗坏血酸。

在没有杂质干扰时，一定量的样

品提取液还原标准2，6-二氯靛酚的量与样品中所含维生素C的量成正比。

2、试剂

⑴1%草酸溶液：

称取10g草酸，加水至1000ml；

⑵2%草酸溶液：

称20g草酸，加水至1000ml；

⑶维生素C标准液：

准确称20mgVC溶于1%草酸中，并稀释至100ml，吸5ml于50ml容量瓶中，加入1%草酸至刻度，此溶液每毫升含有0.02mgVC；

⑷0.02%2，6-二氯靛酚溶液：

称取2，6-二氯靛酚50mg，溶于200ml含有52mg碳酸氢钠的热水中，冷却后，稀释至250ml，过滤于棕色瓶中，贮存于冰箱内，应用过程中每星期标定一次。

标定一：

吸标液（VC）5ml于三角瓶→加6%KI溶液0.5ml→加1%淀粉3滴→用0.001NKIO3标液滴定到淡兰色。

抗坏血酸浓度（mg/ml）=（V1×

0.088）/V2

V1-滴定时消耗0.001NKIO3标液的体积（ml）

V2-维生素C重量（g）

0.088-1ml0.001NKIO3标液≈维生素C的量（mg/ml）

标定二：

吸5ml已知浓度VC标液→加5ml1%草酸→用染料2，6-二氯靛酚滴定至溶液呈粉红色，在15秒不褪色为终点

每毫升2，6-二氯靛酚相当于维生素C的毫克数等于滴定度（T）

T=（C×

V1）/V2

C-维生素C的浓度（mg/ml）

V1-维生素C的体积（ml）

V2-消耗2，6-二氯靛酚的体积（ml）

⑸0.001NKIO3标液：

吸0.1NKIO3溶液5ml→于500ml容量瓶内→加水至刻度，每毫升相当于VC0.008mg；

⑹0.5%淀粉溶液；

⑺6%KI溶液；

3、操作方法

⑴提取：

称样50g→加2%草酸100ml→到入捣碎机中→处理→过滤→颜色若深可加白陶土

⑵滴定：

吸5ml样液→于三角瓶→用染料滴定至粉红色→15秒内不褪色

VC（mg/100g）=（V×

T）/W×

100

V-消耗染料体积（ml）

T-1ml染料所能氧化维生素C的毫克数

W-滴定时所有滤液中含有样品的克数

4、注意事项

⑴所有试剂的配制最好都用重蒸馏水；

⑵滴定时，可同时吸二个样品。

一个滴定，另一个作为观察颜色变化的参考；

⑶样品进入实验室后，应浸泡在已知量的2%草酸液中，以防氧化，损失维生素C；

⑷贮存过久的罐头食品，可能含有大量的低铁离子（Fe2+），要用8%的醋酸代替2%草酸。

这时如用草酸，低铁离子可以还原2，6-二氯靛酚，使测定数字增高，使用醋酸可以避免这种情况的发生；

⑸整个操作过程中要迅速，避免还原型抗坏血酸被氧化；

⑹在处理各种样品时，如遇有泡沫产生，可加入数滴辛醇消除；

⑺测定样液时，需做空白对照，样液滴定体积扣除空白体积。

二、2，4-二硝基苯肼法

可测总抗坏血酸，总抗坏血酸包括还原型、脱氢型和二酮古乐糖酸型。

此法是将样品的还原型抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，然后与2，4-二硝基苯肼作用，生成红色的脎。

脎的量与总抗坏血酸含量成正比，将红色脎溶于硫酸后进行比色，由标准曲线计算样品中总VC。

用酸处理过的活性碳把还原型的抗坏血酸氧化为脱氢型抗坏血酸，在继续氧化为二酮古乐糖酸。

二酮古乐糖酸与2，4-二硝基苯肼偶联生成红色的脎，其成色的强度与二酮古乐糖酸浓度呈正

比，可以比色定量。

2、步骤

⑴样品处理与分析

称一定样→加等量2%草酸→于高速捣碎机捣碎→取匀浆20g→用1%草酸定容100ml→过滤→取滤液10ml→加1%草酸10ml→加少量活性炭→摇1分钟→静置过滤→各取滤液2ml于样品管和样品空白管→各管加入1滴硫脲溶液→于样品管中加入2，4-二硝基苯肼0.5ml→分别于两个管加盖→于37℃保温箱3小时→取出后样品管放入冰水中→样品空白管取出后冷至室温→在样品空白管加入2，4-二硝基苯肼→0.5ml→样品管和空白管都于冰浴中→滴加85%H2SO42ml于各管中→边滴边摇→防止温度升高炭化后呈黑色→冰浴中30分钟后取出→室温下放置30分钟后，在540nm测消光值，从标准曲线上查出相应的含量

⑵标准曲线的绘制

取5个50ml容量瓶编号12345

加VC标液0.2mg/ml1020304050ml

取5个比色管取相应22222

加硫脲溶液（滴）11111

2，4-二硝基苯肼（ml）0.50.50.50.50.5

于37℃保温箱3～4小时，取出于冰浴中，然后滴加85%硫酸2.5ml→取出放30分钟→在540nm下测各消光值绘标准曲线，同时做空白。

每百克食品中抗坏血酸的毫克数=C/W*100

1原子吸收分光光度法

利用原子吸收分光光度法问接测定维生素C的含量，是利用维生素C可以与一些金属离子发生氧化还原反应，通过测定反应掉的金属离子的量，进而间接计算出维生素c的含量。

1.1以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法

以银离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法，是利用维生素C分子中的有二烯醇基具强还原性，可被硝酸银氧化为去氢维生素C，同时产生黑色银沉淀（反应式如图2）。

图2维生素C与银离子反应的反应式

沉淀经离心分离后，将分离得到的沉淀用硝酸溶解后，再利用原子吸收分光光度计测定银离子的含量，从而接测得维生素C含量，具体测定方法如下：

配制一系列浓度的维生素C标准溶液，依次吸取一定量的维生素C标准溶液置于10mL离心管中，分别加入2mL（1mg/mL）Ag+标准溶液，然后加水使总体积为4mL，摇匀，在室温下避光放置35min离心分离弃去上清液，用2mL超纯水洗涤沉淀3次，然后用l:

1的浓硝酸3mL溶解沉淀，移入50mL的容量瓶中，加水稀释至刻度。

喷入空气-乙炔火焰分别测定其吸光度，以维生素C标准溶液的浓度为横坐标，以测得的吸光度值为纵坐标绘制标准曲线。

最后将处理过的待测样按上述方法测定其维生素C含量。

上述方法巾维生素C标准溶液及样品的配制都是利用2％的柠檬酸作为溶剂，并在棕色瓶中保存，原因是维生素C在溶液中不稳定，遇氧气、光、热、碱性物质易受破坏，而在适当的酸性条件下比较稳定，用2％的柠檬酸溶液来配制维生素C标准溶液，减缓了维生素C被氧化的速度，同时消除了一定外界因素的十扰，使得测定结果比较稳定。

1.2以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法

文献中报道了以铜离子作为氧化剂的间接原子吸收分光光度法。

该方法也是利用维生素C在酸性介质中维生素C可将Cu2+定量的还原为Cu+，然后Cu+与SCN-反应生成CuSCN沉淀，在高速离心机下有效地分离出CuSCN沉淀，洗涤后再经浓硝酸溶解，用原子吸收法测定沉淀中的含铜量，即可推知样品中维生素C的含量。

具体测定方法如下：

分别吸取1mL配制的含一定量维生素C的标准溶液（随配随用）（分别含维生素C50、100、200、300、400、500µ

g）和样品提取液，依次放置于已编号的15mL离心管中，各加入1mLCuSO4饱和溶液、1mL浓度为2％硫氰酸铵溶液、0.5mL盐酸-醋酸钠缓冲液和0.5mL饱和NaCl溶液充分混和，稍后离心分离，弃去上层清液，小心地用少量水洗涤沉淀2～3次（注意每次用水不能超过1mL），加入0.5mL硝酸溶解后，转移至lO0mL的容量瓶中加水定容至刻度线，摇匀。

分别用原子吸收分光光度计测定其含铜量，由所得的维生素C含量的标准曲线，可以得到相应样品的试验结果。

该方法所得的试验结果相对标准偏差RSD在5％以内加标回收率在96.56％～100.67％，其精密度和准确度均达到痕量分析要求。

此方法的线性相关系数R=O9989，表明相关性很好。

2紫外可见分光光度法

利用紫外分光光度法测定维生素C的含量是基于维生素c在紫外光区有特征吸收，但是因为维生素C结构中具有不饱和键，具有还原性，不易稳定存在，直接测定误差较大。

所以在利用紫外分光光度法测定时，维生素标准溶液和待测样的配制条件非常重要。

曾国富，黄玉英研究发现，维生索C在CTAB-C5H11OH-H2O微乳液体系中非常稳定，它存在于微乳液滴膜的内侧，与渗透进入液滴膜外侧的溶液氧接触的机会极少，该体系能极大地提高维生素C的稳定性。

郑京平等利用维生素C具有对紫外产生吸收和对碱稳定的特性，建立了紫外分光光度快速测定水果、蔬菜维生素c的新方法。

根据维生素C具有对紫外产生吸收和对碱不稳定的特性，于波长243nm处测定样品溶液与碱处理样品两者吸光度之差，通过查校准曲线，即可计算样品巾维生素C的含量。

此法操作简单、快速准确、重现性好，结果令人满意。

特别适合含深色样品的测定。

实验结果表明该方法简单易行，结果准确、灵敏度高，检出限低，可快速测定水果、蔬菜中维生素C，值得推广应用。

张立科等介绍了在0～450µ

g／mL线性范围内，以cu2+作催化剂，以溶解氧将还原型维生素C氧化为在246.0nm处无吸收的氧化型Vc，实现了样品各紫外干扰成分的本底校正，建立了种测定果蔬Vc的新方法。

该方法中维生素C破坏条件的选择尤为重要，确定条件为：

Cu用量为30g，反应温度为70℃，反应时间为20min，加热条件下，反应速度快，无需加掩蔽剂。

方法简便、快速、准确，测定了香蕉、西红柿等果蔬中的VC含量，结果令人满意。

经多次实验得出该方法RsD在0.32％～0.89％之间，实际测定了香蕉、西红柿等样品中的VC的含量，检出限为0.2791g／mL，加标回收率在97.16％～100.18%之间。

3高效液相色谱法

前面介绍的方法由于在使用中有一定的限制，操作复杂、前处理较麻烦。

因此在使用中有较大的局限性，目的已逐渐被高效液相色谱法所取代。

HPLC法具有检测速度快、操作简单、实验结果可靠等特点。

王艳颖，姜国斌等采用HYPERSIL-C8fz谱柱、浓度0.1％的草酸作流动相的高效液相色谱法，分析了草莓中的维生素c含量，取得了理想的效果。

HPLC检测条件如下：

流动相0.1％草酸溶液，流速1.0mL/min；

检测波长254nm，进样量5µ

L，柱箱温度3O℃。

该方法分析中受样品中其他杂质的影响较小。

测定草莓中维生素C的含量，回收率为97.4％～102.1％，说明该方法具有所需试剂少、稳定、操作简便等特点。

精密度实验的相对标准偏差小于3％，说明该方法重复性和再现性都是比较高的。

陈昌云等采用0.05mol／L磷酸二氢钾缓冲液：

甲醇=80:

20（v／v）作流动相。

流速为1.0mL／min，二极管阵列检测器，检测波长为254nm。

测定蜜柚中维生素C含量在质量浓度为20～100mg／L范围内有良好的线性关系，方法回收率为92.4％～107.5％,相对标准偏差小于2％。

4结语

测定维生素C含量方法很多，各种方法各有优缺点，因为维生素C自身的不稳定，导致了很多方法测定结果误差较大，所以对维生素C稳定存在条件的探索非常重要。

高效液相色谱法因为测定较准确、灵敏度高、选择性好，有较好的发展前景，是目前发展较快的一种方法。