现代生化技术练习题汇总复习提纲.docx

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现代生化技术练习题汇总复习提纲

《第一章生命大分子物质的制备》习题

1、作为现代生化制备的主要对象的蛋白质、核酸等生物大分子有何特点？

（1）成分复杂：

生物材料的组成极其复杂，常常包含有数百种乃至几千种化合物。

有的生物大分子在分离过程中还在不断的代谢，所以生物大分子的分离纯化方法差别极大，想找到一种适合各种生物大分子分离制备的标准方法是不可能的。

（2）含量甚微：

许多生物大分子在生物材料中的含量极微，只有万分之一、几十万分之一，甚至几百万分之一。

分离纯化的步骤繁多，流程又长，有的目的产物要经过十几步、几十步的操作才能达到所需纯度的要求。

（3）易变性易被破坏：

许多生物大分子一旦离开了生物体内的环境时就极易失活，因此分离过程中如何防止其失活，就是生物大分子提取制备最困难之处。

过酸、过碱、高温、剧烈的搅拌、强辐射及本身的自溶等都会使生物大分子变性而失活，所以分离纯化时一定要选用最适宜的环境和条件。

（4）具经验性：

生物大分子的制备几乎都是在溶液中进行的，温度、pH值、离子强度等各种参数对溶液中各种组成的综合影响，很难准确估计和判断，因而实验结果常有很大的经验成份，实验的重复性较差，个人的实验技术水平和经验对实验结果会有较大的影响。

（5）均一性的相对性：

生物大分子制备物的均一性（即纯度）的鉴定，通常只采用一种方法是不够的，必须同时采用2～3种不同的纯度鉴定法才能确定。

2、生物物质制备方案的设计基本原则是什么？

生物物质的制备一般包括初始阶段、中间阶段和精制阶段。

在制备方法的选择上，初始阶段宜选择粗放、分辨率低、快速、有利于缩小样品体积和减少后工序的方法，主要考虑样品量和处理速度两个指标；中间阶段选择的方法应在考虑样品处理量的基础上适当提高分辨率。

精制阶段宜选择精确、分辨率高、需样品少的方法。

在安排各种分离纯化方法的使用程序时应注意：

（1）不适宜连续使用同一种分离纯化方法，应该交叉使用，因为每一步分离后，性质相似的物质聚在一块；

（2）使用顺序还要考虑到有利于减少工序、提高效率。

3、综合评价生物物质制备步骤方法的好坏应从哪些方面进行？

每一个制备步骤方法的好坏，除了从分辨本领和重现性二方面考虑外，还注意方法本身的回收率和纯化倍数，特别是制备某些含量很少的物质时，回收率的高低十分重要。

因此综合评价试验方案的优劣应从分辨本领、重现性、回收率和纯化倍数等方面进行。

一个好的制备方法应该使纯化倍数和收得率都同时有较大提高。

但在实际过程中，随纯化倍数的提高，收得率是逐渐降低的。

因此应该根据材料的来源难易（难——收得率优先考虑，易——纯化倍数优先考虑）和制备物的目的等方面来综合评定方法的优劣。

4、利用下表中的方案制备长春花Strictosidine合成酶，现已测得各步骤总蛋白和总活力结果，试完成下表。

步骤

总蛋白

（mg）

总活力

（nKat）

比活力

（nKat/mg）

产率

（%）

提纯

倍数

（1）粗抽提液

（2）硫酸铵沉淀

（3）DEAD纤维素柱层析

（4）羟基磷灰石柱层析

（5）SephadexG-75凝胶柱层析

（6）等点聚焦

654

466

38.7

5.9

0.72

0.08

5.2

5.1

3.9

3.8

2.0

0.5

5、提取生物活性物质时，活性保护性措施有哪些？

提取一些具有生理活性的物质时，除了考虑被提取物溶解度外，还应考虑被提取物活性的保护。

对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说，主要措施有如下几点：

（1）采用缓冲系统；

（2）加入保护剂；（3）抑制水解酶的破坏；（4）其它一些特殊要求的保护措施。

6、蛋白质、DNA和RNA的常用提取方法有哪些？

（1）蛋白质和酶的提取方法：

水溶液提取、、有机溶剂提取

（2）DNA的提取方法：

浓盐法、、阴离子去污剂法、苯酚抽提法、水抽提法

（3）RNA的提取方法：

苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

7、提取组织中的胰岛素时，为什么采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）为溶剂进行提取。

胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液，但在组织中与其共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性，采用68％乙醇溶液（用草酸调溶液的pH为2.5～3.0）进行提取，可以从下面三个方面抑制了糜蛋白酶的水解活性：

①68％的乙醇可以使糜蛋白酶暂时失活；

②草酸可以除去激活糜蛋白酶的Ca++；

③选用pH2.5～3.0，是糜蛋白酶不宜作用的pH值。

《第二章常用生物化学检验技术》习题

1、蛋白质的化学物理检测方法主要有哪些？

各方法的基本原理是什么？

紫外吸收法：

苯丙氨酸、酪氨酸、色氨酸等氨基酸在280nm波长左右具有紫外吸收，且吸光度与其浓度成线性，根据此性质可用于蛋白质的定量测定。

凯氏定氮法：

该法根据一般蛋白质含氮量为16%的特点，将样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

双缩脲法：

双缩脲在碱性溶液中与Cu2+结合生成紫色络合物，这一呈色反应称为双缩脲反应。

蛋白质分子中的肽键类似双缩脲结构，故亦能呈双缩脲反应。

在一定的浓度范围内，颜色深浅与蛋白质含量呈线性关系。

蛋白质浓度越高，体系的颜色越深。

反应产物在540nm处有最大光吸收。

福林酚试剂法：

Folin-酚试剂由试剂A和试剂B两部分组成。

在Folin-酚试剂法中，蛋白质中的肽键首先在碱性条件下与酒石酸钾钠-铜盐溶液（试剂A）起作用生成紫色络合物（类似双缩脲反应）。

由于蛋白质中酪氨酸、色氨酸的存在，该络合物在碱性条件下进而与试剂B（磷钼酸和磷钨酸、硫酸、溴等组成）形成蓝色复合物，其呈色反应颜色深浅与蛋白质含量成正比。

考马斯亮蓝法：

考马斯亮蓝G-250存在着两种不同的颜色形式，红色和蓝色。

考马斯亮蓝G-250在酸性游离状态下呈棕红色，最大光吸收在465nm，当它与蛋白质结合后变为蓝色，最大光吸收在595nm。

2、糖类的化学检测方法主要有哪些？

兰－爱农（Lane-Eynon）法、斐林试剂快速法（GB法）、碘量法、铜试剂法、高锰酸钾法

3、核酸的化学检测方法主要有哪些？

定磷法、二苯胺法和地衣酚法

4、凯氏定氮法的基本原理是什么？

其主要操作步骤包括哪些？

该法中加入硫酸钾和硫酸铜的作用是什么？

原理：

样品与浓硫酸和催化剂一同加热消化，使蛋白质分解，其中碳和氢被氧化为二氧化碳和水逸出，而样品中的有机氮转化为氨与硫酸结合成硫酸铵。

然后加碱蒸馏，使氨蒸出，用硼酸吸收后再以标准盐酸或硫酸溶液滴定。

根据标准酸消耗量可计算出蛋白质的含量。

主要操作步骤：

消化、蒸馏、滴定

加入硫酸钾可以提高溶液的沸点而加快有机物的分解，硫酸铜主要作为催化剂，同时可以指示消化终点的到达。

5、放射自显影技术的基本原理是什么？

其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。

然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量。

6.生物检测内容主要有哪些？

安全性检测包括哪些内容？

生物检测内容主要包括生物效价测定和安全性试验。

安全性检测主要包括毒性试验、局部刺激性试验、溶血实验、热原试验、过敏试验和变异原试验。

7.兰-爱农法测定糖类的基本原理是什么？

兰-爱农法是指以次甲基蓝作为指示剂，直接将还原糖滴定到斐林试剂中进行测定的方法。

斐林试剂中的酒石酸钾钠铜氧化还原糖分子中的游离羰基，本身被还原氧化亚铜红色沉淀。

由于次甲基蓝氧化能力比二价铜弱，待二价铜全部还原后，过量1滴还原糖使次甲基蓝还原，蓝色消失而达滴定终点。

《第三章电泳技术》习题

1、什么是电渗现象？

其对电泳过程有何影响

液体在电场中，由于支持介质表面可能会存在一些带电基团，吸附一些带相反电荷的离子，在电场的作用下向电极方向移动，形成介质表面溶液的流动，这种现象就是电渗。

如果电渗方向与电泳方向相同，则加快电泳速度；如果电渗方向与电泳方向相反，则降低电泳速度。

2、现有电泳技术按照原理及支持介质的不同，分为哪几类？

按原理不同可分为：

移动界面电泳、区带电泳、等电聚焦电泳和等速电泳

按支持介质形状不同可它为：

薄层电泳、板电泳和柱电泳。

3、蛋白质在不连续PAGE中实现分离的基本原理是什么？

不连续PAGE电泳体系中由于缓冲液离子成分、pH、凝胶浓度及电位梯度的不连续性，带电颗粒在电场中泳动不仅有电荷效应、分子筛效应，还具有浓缩效应，故分离效果比连续系统更好。

（1）样品浓缩效应：

①凝胶孔径的不连续性：

浓缩胶为大孔胶，分离胶为小孔胶。

在电场作用下，样品颗粒在大孔胶中泳动的阻力小，移动速度快；当进入小孔胶时，受到的阻力大，移动速度减慢。

因而在两层凝胶交界处，样品迁移受阻而压缩成很窄的区带。

②缓冲体系离子成分及pH值的不连续性：

HCl在任何pH溶液中均易解离出（Cl-），在电场中迁移率快，走在最前面称为快离子。

在电极缓冲液中，除有Tris外，还有甘氨酸（glycine），其pI=6.0，在pH8.3的电极缓冲液中，易解离出甘氨酸根（NH2CH2COO-），而在pH6.7的凝胶缓冲体系中，甘氨酸解离度仅有0.1%-1%，因而在电场中迁移很慢，称为慢离子。

当进入pH8.9的分离胶时，甘氨酸解离度增加。

③电位梯度的不连续性：

电泳开始后，快离子的快速移动会在其后形成一个离子强度很低的低电导区，使局部电位梯度增高，将蛋白质浓缩成狭窄的区带。

（2）分子筛效应：

大小和形状不同的蛋白质通过一定孔径分离胶时，受阻滞的程度不同而表现出不同的迁移率，这就是分子筛效应。

（3）电荷效应：

在pH8.9的分离胶中，各种带净电荷不同的蛋白质有不同的迁移率。

净电荷多，则迁移快；反之，则慢。

因此，各种蛋白质按电荷多少、相对分子质量及形状，以一定顺序排成一个个区带，因而称为区带电泳。

4、SDS-PAGE测定蛋白分子量的原理是什么？

由于SDS带有大量负电荷，当其与蛋白质结合时，所带的负电荷大大超过了天然蛋白质原有的负电荷，因而消除或掩盖了不同种类蛋白质间原有电荷的差异，使蛋白质均带有相同密度的负电荷，因而主要利用蛋白分子量的差异而将各种蛋白质分开，因此根据未知蛋白和标准系列蛋白的移动距离可测定出未知蛋白的分子量。

5、蛋白质聚丙烯酰胺凝胶电泳和DNA琼脂糖凝胶电泳中，凝胶浓度与被分离分子的大小有何关系？

聚丙烯酰胺凝胶浓度越大，允许通过的蛋白分子越小；琼脂糖凝胶浓度越大，允许通过的DNA片段短。

6、某同学在进行SDS-PAGE时，发现电压很高而电流却很低，试分析其原因，并提出处理措施。

这种现象主要是由于电泳槽没有正确装配，电流未形成通路。

包括：

a.内外槽装反；b.外槽液过少；c.电泳槽底部的绝缘体未去掉（比如倒胶用的橡胶皮）。

处理办法：

电泳槽正确装配即可。

7、琼脂糖凝胶电泳缓冲液中一般需要加入适量的EDTA，其目的是什么？

目的是螯合Mg2+等离子，防止电泳时激活DNA酶，此外还可防止Mg2+离子与核酸生成沉淀。

8、琼脂糖凝胶电泳的电泳缓冲液常用的有哪些？

各有何特点？

     TAE是使用最广泛的缓冲系统。

其特点是超螺旋在其中电泳时更符合实际相对分子质量（TBE中电泳时测出的相对分子质量会大于实际分子质量），且双链线状DNA在其中的迁移率较其他两种缓冲液快约10%，电泳大于13kb的片段时用TAE缓冲液将取得更好的分离效果，此外，回收DNA片段时也宜用TAE缓冲系统进行电泳。

TAE的缺点是缓冲容量小，长时间电泳（如过夜）不可选用，除非有循环装置使两极的缓冲液得到交换。

     TBE的特点是缓冲能力强，长时间电泳时可选用T