重症医学细胞外组蛋白介导RAW2647分泌TNFα的机制及α硫辛酸拮抗作用Word下载.docx
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RAW264.7;
肿瘤坏死因子
TheeffectofextracellularhistonesonTNF-αproductionfromRAW264.7andtheantagonismofalphalipoicacid
LIUJuan,,LIUZhan-Guo,ZHOUJian,CHANGPing*
((DepartmentofIntensiveCareofPediatric,ZhujiangHospital,SouthernMedicalUniversityGuangzhou510282)
*Correspondingauthor:
changp963@
[Abstract]
Objective:
UncontrolledinflammationplayaimportantroleinsepsisandresponsibleforMODS.extracellularhistonesarealsoinvovlvedininflammation.Howeverthepathwaybywhichextracellularhistonesmediateinflammationarenotclear.ToinvestigatetheeffectofextracellularhistonesonTNF-αproductionfromRAW264.7andtheantagonismofalphalipoicacid.
Methods:
ELISAtestwasusedtodetecttheproductionofTNF-ɑthatreleasefrom
RAW264.7stimulatedwithvariousconcentrationofextracellularHistones(0,10,25,50μg/ml)orpre-treatedfor1hwithALAortheinhibitorsofp38,ERKandNF-κB;
Phosphorylationofp38,ERKandNF-κBp65fromRAW264.7stimulatedwithvariousconcentrationofextracellularHistones(50μg/ml)orpre-treatedfor1hwithALAwereinvestigatedbywesternblotting.
Results:
extracellularhistonescaninduceTNF-αreleasefromRaw264.7cellsin
adosedependentway.Meanwhileextracellularhistonesenhancedthephosphorylationofp38,ERKandNF-κBp65.ALAwasobservedtoinhibittheTNF-ɑproductionandthephosphorylationofp38,ERKandNF-κBp65.
Conclusion:
extracellularhistonescaninduceTNF-ɑproductioninRAW264.7viaMAPKandNF-κBpathwayandALAcanreduceTNF-ɑproductionbyinhibitingthepathway.ThesefindingsindicatethenewtargetsofALAforsepsistreatment.
[Keywords]:
extracellularhistones;
α-lipoicacid;
TNF-α
脓毒症是机体对于感染的失控反应所导致可以威胁生命的器官衰竭。
过度的炎症反应是脓毒症以及后续的多器官功能障碍综合征(MODS)最重要发生机制之一[1]。
细胞外组蛋白可通过诱导炎症介质释放和损伤线粒体来导致内皮损伤,细胞凋亡和器官衰竭[2,3]。
所以它被认为是导致脓毒症患者死亡的主要介质[4]。
近年来,研究证实α-硫辛酸(ALA)具有抗炎作用[5,6]。
本研究通过使用RAW264.7细胞系来探究组蛋白介导炎症反应的机制以及ALA对其的抗炎作用。
1材料与方法
1.1材料
DMEM培养基(Hyclone公司);
α-硫辛酸、细胞外组蛋白、ERK抑制剂(PD98059)、NF-κB抑制剂(PDTC),p38抑制剂(SB203580)(美国sigma公司);
胎牛血清(FBS)(Gibco)和TNF-α试剂盒(上海依科塞公司);
辣根过氧化物酶标记的羊抗兔IgG、兔抗人p38、p-p38、ERK、PERK、NF-KBp-p65抗体、NF-KBp65抗体(CST公司)。
1.2细胞株
小鼠巨噬细胞系Raw264.7(ATCC细胞库)。
1.2.1Raw264.7细胞的培养与传代
用含10%的胎牛血清、1%青霉素-链霉素的DMEM。
置于5%CO2,37℃培养箱中培养小鼠巨噬细胞RAW264.7,细胞增殖至70%~80%汇合后进行传代,1~2d换液一次,4~6d传代一次。
1.2.2ELISA法检测细胞因子TNF-α的分泌
将RAW264.7细胞用0.25%胰酶消化,以1x106个/ml接种于六孔板内。
于第二天,用不同浓度组蛋白(0μg/ml、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml)刺激细胞,置5%CO2,37℃培养箱中继续培养12h,收集细胞上清液,以及用组蛋白(50μg/ml)刺激细胞并在不同时间(4h、6h、12h、16h)收集上清液。
为了阻断ERK、p38、NF-κB通路以及明确ALA的作用,分别用ERK抑制剂、p38抑制剂、NF-κB抑制剂和ALA预处理1h后,再用组蛋白(50ug/ml)刺激细胞,置5%CO2,37℃培养箱中继续培养12h,收集细胞上清液。
ELISA检测试剂盒测定TNF-α(采用双抗体夹心ELISA法)。
1.2.3Westernblot检测相关蛋白表达
将不同条件下处理好的细胞,用冷的PBS洗2遍,加入150μlRIPA细胞裂解液并立即放在冰上裂解30min,用细胞刮快速刮下,转移到离心管中,在4℃,14000r/min,离心10min,取上清。
加入5×
SDS上样稀释液,煮沸10min,将待检测蛋白在10%的聚丙烯酰胺凝胶中电泳,PVDF膜转膜,5%胎牛血清蛋白或者脱脂奶粉中封闭,然后加入1:
2000的第一抗体,4℃冰箱封闭过夜。
第二天用TBST洗3遍,每遍15min后再分别加人l:
8000的第二抗体。
室温孵育1h,ECL显影。
将曝光后的胶片,通过凝胶成像系统扫描分析结果。
用QuantityOne图像分析软件进行灰度值(即吸光度)分析。
将各部分的灰度值与各总蛋白条带灰度值的比值作为该蛋白的相对表达量。
1.2.4MTT法检测细胞增殖情况
用MTT法检测ALA对Raw264.7的细胞增殖作用。
将细胞悬液浓度调整为1×
109个/L,将1×
104个细胞铺于96孔板内,置于5%CO2,37℃培养箱中培养。
于第二天用不同浓度ALA(0,10和25mg/L)刺激RAW264.7,共培养14h后,PBS洗两遍,每孔加入MTT(5g/L)10μl,避光培养4h,弃上清,每孔加入二甲基亚砜(DMSO)150μL。
震荡10min,490nm波长处测定每孔吸光度值。
1.3统计学分析
数据分析采用SPSS20.0统计学软件,数据结果使用均数±
标准差(X±
S)表示,采用单因素方差分析(one-wayANOVA),组间两两比较采用Bonferroni’s检验,P值小于0.05被认为有意义。
2结果
2.1组蛋白诱导RAW264.7细胞的TNF-α分泌
用组蛋白0μg/ml(正常对照组)、10μg/ml、25μg/ml、50μg/ml刺激RAW264.7细胞,用ELISA方法检测其TNF-α分泌水平,发现组蛋白介导的TNF-α分泌有浓度依赖性(269.19±
124.07,1757.38±
421.63,2132.69±
578.54,2780.87±
1032.61,*P<
0.05,**p<
0.001)(表1)。
表1不同浓度组蛋白对RAW264.7分泌TNF-α的影响
Table1TheeffectofdifferentconcentrationofhistoneonthereleaseofTNF-αfromRAW264.7(X±
SD,n=3)
细胞分组
N
TNF-α(pg/ml)
正常对照组
3
269.19±
124.08
组蛋白10μg/ml
1757.39±
421.63*
组蛋白25μg/ml
2132.70±
578.54*
组蛋白50μg/ml
2780.87±
1023.61**
Valuesarepresentedasmeans±
SD.n=3,*p<
0.05,and**p<
0.001comparedtocontrol
2.2组蛋白可导致p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化
组蛋白能诱导Raw264.7细胞激活p38、ERK和NF-κBp65通路,且呈时间依赖性,能在20min内迅速激活(p<
0.01),并且p38和ERK通路在30min(p<
0.001)达到高峰,NF-κB通路在60min(p<
0.001)达到高峰,最后随时间延长,组蛋白诱导RAW264.7细胞中的p38、ERK和NF-κBp65磷酸化水平逐渐降低。
(图1)。
图1组蛋白诱导p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化
Fig1.Extracellularextracellularhistonesinducedphosphorylationofp38,ERKandNF-κBp65.(X±
SD,n=3).
2.3组蛋白通过ERK、p38和NF-κB信号通路诱导RAW264.7细胞的TNF-α分泌
我们分别使用PD98059(ERK酶的抑制剂)、SB203580(p38的抑制剂)和PDTC(NF-κB的抑制剂)预处理RAW264.7细胞1小时后,再加入组蛋白共培养12h,收集细胞培养上清液检测细胞因子TNF-α的分泌水平。
与组蛋白组相比,加入抑制剂组可明显降低RAW264.7细胞的TNF-α分泌。
图2组蛋白通过ERK、p38和NF-κB通路诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α
Fig2ExtracellularhistonesinducedTNF-αreleasefromRaw264.7cellsviaERK、p38andNF-κBpathways.***p<
0.001comparedtothecontrolgroup,###P<
0.001,##p<
0.01comparedtoHis(X±
2.4ALA对RAW264.7细胞活力和TNF-α分泌的影响
MTT法检测不同浓度ALA(0ug/ml、50ug/ml、100ug/ml)对RAW264.7活力的影响,结果显示在此浓度范围内,ALA对RAW264.7活力没有明显改变,差异没有统计学意义。
对于TNF-α分泌的影响,ALA可明显降低组蛋白诱导的TNF-α的分泌。
图3ALA抑制组蛋白诱导RAW264.7细胞分泌TNF-α
Fig3ALAreducesextracellularhistones-inducedTNF-αreleasefromRaw264.7cells.***p<
0.001,comparedtocontrol;
##P<
0.01,comparedtoextracellularhistones(X±
2.5ALA抑制组蛋白引起的p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化
Westernblot结果显示用ALA预处理后,p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化较组蛋白组降低(p<
0.05)。
图4ALA抑制组蛋白诱导RAW264.7细胞p38、ERK和NF-κBp65的磷酸化
Fig.4ALAdecreasethephosphorylationofp38、ERKandNF-κBp65ofRaw264.7cellsstimulatedbyextracellularhistones.(X±
3讨论
炎症反应在脓毒症的发生、发展及致死中发挥了重要作用。
而TNF-α是重要的炎症介质,主要来自于单核巨噬细胞,其浓度的高低反映了机体炎症反应的强度,并与器官损伤具有显著的相关性。
故本研究以巨噬细胞系Raw264.7作为实验载体,探明了细胞外组蛋白介导巨噬细胞分泌TNF-α的机制,以及硫辛酸的对组蛋白介导炎症的拮抗效应。
既往已有研究证实在对脓毒症患者观察中发现同对照组相比,脓毒症患者血清中组蛋白浓度明显增加[7]。
相同结论在动物实验研究中也得到证实,并且动物实验进一步证实细胞外组蛋白可导致血管内皮细胞损伤[2],诱导炎症反应以及血栓形成,最终导致器官衰竭甚至死亡。
而在对于急性肾损伤的研究中,Allam等[8]人研究也证实组蛋白会导致小鼠的肾小管坏死甚至死亡,但予抗组蛋白抗体时可减少小鼠的死亡率。
以上研究表明了细胞外组蛋白可能是一种新的炎症介质,其介导的炎症反应在组织损伤和器官衰竭中起着非常重要的作用。
我们的研究结果也证实了细胞外组蛋白可体外诱导RAW264.7分泌TNF-a,这与之前zhang等[3]人研究细胞外组蛋白刺激人肺上皮细胞分泌TNF-a的结果是一致的。
但关于细胞外组蛋白可体外诱导RAW264.7分泌TNF-a的机制却并不清楚。
丝裂原活化蛋白激酶(mitogen-activatedproteinkinases,MAPK)是真核细胞中一系列非常保守的丝氨酸/苏氨酸激酶,通过磷酸化其他细胞蛋白,并从胞浆移位至细胞核而调节转录因子的活性。
其中P38和ERK被认为是MAPK家族中参与炎症反应和细胞生长、分化主要的成员[9,10]。
在本实验中我们已经表明,细胞外组蛋白激活RAW264.7中的p38和ERK通路。
为了进一步阐明在细胞外组蛋白诱导TNF-α表达中这些信号通路的作用,我们用p38MAPK(SB203580)和ERK抑制剂(PD98059)预处理RAW264.7,发现细胞外组蛋白诱导TNF-α表达下调约50%(图2)。
这表明,细胞外组蛋白调节TNF-α表达部分通过p38和ERK的活化。
这些结果表明,两个MAPK通路部分参与细胞外组蛋白介导的炎症反应。
我们结果支持Hiroki等人[11]报道的细胞外组蛋白通过MAPK信号通路介导的ARPE-19细胞分泌IL-8、IL-6。
NF-κB是在淋巴细胞核中发现的一种转录因子[12,13]。
它存在于哺乳动物细胞中,主要参与组织损伤和应激,机体防御反应等过程。
既往有研究证实细胞外组蛋白NF-κB的上游分子IkB-α来加重肾损伤[8],而我们结果也证实细胞外组蛋白通过NF-κB通路诱导TNF-α的表达。
为了进一步证实NF-κB信号通过参与细胞外组蛋白介导的TNF-α的表达,我们用NF-κB抑制剂(PDTC)预处理RAW264.7,发现TNF-α表达下调约50%(图2)。
这表明,细胞外组蛋白调节TNF-α表达部分通过的NF-κB活化。
α-硫辛酸(α-lipoicacid,ALA)是一种硫氰化合物,属于维生素B类。
它天然存在于人类日常饮食的食物如马铃薯、菠菜、动物组织中。
它主要功能是作为辅酶[14],参与氧化还原反应[15,16]。
近年来在体外实验中发现ALA可降低炎症因子的释放,表现出抗炎作用[17,18]。
而在脓毒症小鼠模型中也可发现ALA不仅可减轻脓毒症小鼠的炎症反应并且可提高其生存率[19]。
而对于ALA对于组蛋白介导的炎症反应是否具有保护作用也尚不清楚。
我们研究证实ALA可降低细胞外组蛋白诱导的TNF-α生成(图3)。
同时,我们已证实,组蛋白通过MAPK和NF-κB途径来诱导TNF-α生成(图1)。
我们推测ALA可通过抑制MAPK和NF-κB途径发挥抗炎作用。
结果表明ALA可以减少磷酸化的ERK,p38和NF-κBp65的生成(图4),这与在人主动脉内皮细胞[20]或大鼠模型[21]关于ALA的抗炎作用和途径的早期研究是一致的。
总之,在此研究中,我们证实组蛋白可通过p38的,ERK和NF-κB途径诱导RAW264.7的TNF-α生成并且ALA可通过抑制上述通路降低TNF-α生成.这些发现表明治疗脓毒症的潜在目标。
然而,这项研究的缺陷是我们使用细胞系来代替原代巨噬细胞。
其结果未必能充分反映机体的实际情况。
接下来我们将进行原代巨噬细胞或动物实验来进一步验证此现象。
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