IEF使用过程中常见问题及解决方法Word格式.docx
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•检查水化缓冲液体积及时间.确保在水化期间水化缓冲液平均地分配.
•限流过高。
•建议限流50μA/胶条。
确保输入正确的IPG胶条数目。
可能原因
解决方法
烧胶条（这将会导致电阻较大的波动，并引起电阻错误信息显示。
）
•限流过高.
•建议限流50μA/胶条.确保输入正确的IPG胶条数目.
•IPG胶条已经烧干.
•确保IPG胶条被矿物油或类似物所覆盖以防止胶条烧干
•电极处的滤纸过湿或含有不合适的电极溶液.
•确保滤纸电极只含有去离子水并且处于润湿状态而非潮湿状态。
•水化缓冲液成份不合适，盐浓度过高.
•检查水化缓冲液浓度.必要时重新配制缓冲液.
双向电泳实验中常见问题
一、水平条纹
出现的问题：
胶上出现连续性横纹。
可能的原因：
蛋白质没有完全和稳定溶解。
推荐解决的方法:
∙用适当强烈的离液剂抽提蛋白，确保所有的蛋白质都溶解。
因此选择合适浓度的尿素，硫尿，去污剂（e。
g。
CHAPS,ASB—14），两性电解质和还原剂（DTTorTBP）非常重要。
每一种新的样品，都需要其相适应的样品处理方法。
为处理好样品，现提供以下几个样品标准处理溶液：
o8–9Murea,4％（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT，40mMTris，0.2％（w/v）Bio—Lyte3/10Ampholyte
o7Murea，2Mthiourea,4%（w/v）CHAPS,2mMTBPor50mMDTT，40mMTris，0。
2％（w/v）Bio-Lyte3/10Ampholyte
∙样品须有充分的溶解时间和变性时间。
通常，在进行一相等电聚焦前，须将样品水化液在室温平衡1小时左右。
∙进行一相等电聚焦前，须对蛋白样品进行充分离心（〉10,000rpm），去除样品中的不溶的蛋白复合物。
推荐产品:
ReadyPrepproteinextractionkit（totalprotein/全蛋白）
出现不连续的横纹。
可能的原因:
样品中含有干扰物质，比如盐类，离子去污剂（SDS）,肽类，核酸类（e.g。
DNA，RNA），脂类,多糖和酚类化合物。
以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法。
更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）。
盐：
为确保IEF顺利完成，样品中的总盐类不得超过40mM。
样品中的盐类物质可以通过透析，凝胶过滤，蛋白浓缩，或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去。
蛋白质沉淀可以选用10％TCA丙酮处理（Damervaletal.1986）,也可选用ReadyPrep2—Dcleanupkit。
沉淀后,可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品.注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。
阴离子去污剂:
SDS是一种十分有效的去污剂，用于溶解难溶的蛋白。
SDS可以迅速使样品中的蛋白酶失活，并减少脂类物质对IEF的影响。
但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响。
如果在样品制备中使用SDS，那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰。
最终，样品中SDS的含量须低于0.25%（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：
1。
如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS，并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。
核酸：
处理培养细胞和从组织中分离的细胞时，往往造成很高的蛋白/核酸比率.核酸物质会增加样品的粘性,并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。
同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹。
通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。
在样品中加入0。
1xsolutioncontaining1mg/mlDNaseI,0。
25mg/mlRNaseA，and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal。
1995）.注意：
Mg2+离子是DNase活性所必须的。
多聚糖类:
同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF.此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷,因其所带的负电荷能和蛋白质作用,从而在2—D胶上形成横条纹.建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal.1986）；
或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）;
或者使用ReadyPrep2—Dcleanupkit处理样品。
脂类：
蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2-D胶上造成假象。
在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶,也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。
一个破坏脂—蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前，须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）.
酚类化合物：
植物组织含有大量的酚类化合物，它们往往以氢键和蛋白质相互强烈作用。
这些化合物有可能通过酶的催化使蛋白氧化，形成共价键修饰蛋白。
酚类化合物的影响,可以通过以下方法去除。
酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。
2.样品制备中加入DTT,抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。
3。
氧化酚类的酶可以被制备样品时所用裂解液中的硫尿所抑制。
4。
裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）。
，可以抑制酚氧化。
ReadyPrep2—Dcleanupkit
Bio—Spin/MicroBio-Spin6columns
出现的问题:
样品中含有干扰物质，比如盐类,离子去污剂（SDS）,肽类,核酸类（e。
g.DNA，RNA），脂类,多糖和酚类化合物。
推荐解决的方法：
以下是我们针对不同杂质推荐的不同去除方法.更详细的信息请参阅Rabilloud（1996）。
为确保IEF顺利完成,样品中的总盐类不得超过40mM.样品中的盐类物质可以通过透析，凝胶过滤,蛋白浓缩,或者蛋白沉淀后再复溶等方法减少或除去.蛋白质沉淀可以选用10％TCA丙酮处理（Damervaletal.1986），也可选用ReadyPrep2—Dcleanupkit.沉淀后,可以选用IEF/2-D上样缓冲液重新溶解蛋白样品。
注意在蛋白复溶前将沉淀试剂完全去除。
但是由于其强阴离子的特性会干扰一相等电聚焦，因此在样品处理时就要注意其对样品的影响.如果在样品制备中使用SDS,那么在一相等电聚焦前，须用含有过量兼性离子或中性离子的溶液稀释样品以降低SDS的干扰.最终,样品中SDS的含量须低于0。
25％（w/v），样品中其他去污剂和SDS之比至少应大于8：
如果前述方法不足以去除样品中的SDS，那么可以将蛋白质多步清洗后沉淀来清除SDS,并用前面所介绍去除盐类物质的样品缓冲液重新溶解蛋白质。
处理培养细胞和从组织中分离的细胞时,往往造成很高的蛋白/核酸比率。
核酸物质会增加样品的粘性，并有可能堵住聚丙烯酰氨的孔，从而阻止蛋白渗入胶条，并会缓慢迁移形成条带。
同时，核酸还会和蛋白通过离子间作用力结合，造成假迁移使2-D胶上出现横纹.通常使用核酸内切酶酶解核酸是最为直接的方法。
25mg/mlRNaseA,and50mMMgCl2而后冰浴（Blombergetal.1995）。
注意:
多聚糖类：
同核酸一样，高分子糖聚合物可能堵住胶孔从而影响IEF.此外，高分子多糖如粘液素和右旋糖苷，因其所带的负电荷能和蛋白质作用，从而在2-D胶上形成横条纹。
建议通过TCA/丙酮沉淀（Damervaletal。
1986）;
或者醋酸铵沉淀后酚抽提（HurkmanandTanaka1986）；
或者使用ReadyPrep2-Dcleanupkit处理样品。
蛋白质能和脂类通过疏水力互相作用，在2—D胶上造成假象。
在水化液中，脂蛋白复合物可能完全不溶，也就不能渗进胶条中的聚丙烯酰氨凝胶中去。
一个破坏脂-蛋白间作用力的方法就是提高去污剂的浓度有些样品在复溶前,须用有机溶剂破坏脂键，常用的是甲醇和氯仿的混合物（WesselandFlugge1984）。
酚类化合物的影响，可以通过以下方法去除。
1.酚类化合物可以被polyvinylpyrrolidone（PVP）orpolyvinylpolypyrrolidone（PVPP）吸附。
2.样品制备中加入DTT，抗坏血酸，亚硫酸盐可以防止酚类氧化作用。
4.裂解的液氮冻存的样品可以直接加入强变性剂混合物如TCA/丙酮（Damervaletal.1986）.，可以抑制酚氧化。
胶部分出现横纹。
蛋白上样量过高。
a）稀释样品，降低样品浓度.在进行IEF前,须对样品进行定量，以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度.蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定.
b）使用长IPG胶条,和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量,详细请见下表：
IPGStripLength
7cm
11cm
17cm
18cm
24cm
Rehydration
volumeperstrip
125µ
l
185µ
300µ
315µ
410µ
Proteinload
Silverstain
5–20µ
g
20–50µ
50–80µ
80–150µ
SYPRORuby
Coomassie
BlueG—250
50–100µ
100–200µ
200–400µ
400–800µ
c）如果可能，可以减少样品中的高丰度蛋白含量。
例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70—90％。
如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖对其他蛋白的观察.减少或除去样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹,有利于对低丰度蛋白的观察。
推荐产品：
a）RCDCproteinassay
b）PROTEANPlus（24cm）orPROTEANII（17cm）precastgels
c）AurumserumproteinandAurumAffi-GelBlueminikits
胶部分出现横纹.
a）稀释样品，降低样品浓度。
在进行IEF前,须对样品进行定量,以确保一相等电聚焦有合适的样品浓度。
蛋白上样量须根据所选IPG胶条和染色方法而定。
b）使用长IPG胶条，和更宽的PAGE胶可以增加蛋白样品上样量，详细请见下表：
例如在血清中，白蛋白占血清蛋白总量的70—90%。
如果上样蛋白中含有上述蛋白的话，将会掩盖其他蛋白的观察。
去处样品中的高丰度蛋白可以相对增加其他蛋白的含量，减少条纹,有利于低丰度蛋白的观察。
c）AurumserumproteinandAurumAffi—GelBlueminikits
胶上出现横条纹。
IEF条件没有优化。
∙通过一系列聚焦时间实验，优化聚焦时间程序。
例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条（20kV-hr，30kV—hr，40kV—hr，etc。
）。
∙确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF，通常IEF聚焦时设置一个总电流。
如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流.因此不同导电性质的样品，应该分别进行IEF。
胶上出现横条纹
IEF条件没有优化.
∙通过一系列聚焦时间实验,优化聚焦时间程序。
例如，可以在一个聚焦槽上，用同样一个样品走6根胶条，而后每隔一段时间取走一根胶条（20kV—hr,30kV—hr,40kV-hr,etc.）。
∙确保所有的样品在同一个实验条件下进行IEF,通常IEF聚焦时设置一个总电流.如果其中有一个样品的导电性高于其他的样品，那么电流大部分将经过该胶条，而降低其他胶条的通过电流。
因此不同导电性质的样品,应该分别进行IEF。
PROTEANIEFcell
ReadyStripIPGstrips
在碱性端附近出现横条纹。
DTT含量不足，造成双硫键被氧化。
∙推荐解决的方法:
在样品进行等电聚焦前，用TBP/IAA烷基化还原样品（Herbertetal。
2001）。
在IEF中,必须解决碱性蛋白易在碱性环境中较易形成双硫键的问题，而TBP/IAA可以防止双硫键重新形成.通常而言，样品水化液和平衡缓冲液中的DTT是用于打开双硫键并保持其还原状态的。
但是DTT在碱性中去质子而带负电，并可从碱性端迁移出IPG胶条而使蛋白质中的硫醇键再氧化形成分子内的双硫键.为使实验方便起见，BIO-RAD公司提供了ReadyPrepreduction-alkylationkit以去除双硫键。
∙为增加碱性蛋白的分离，可以在IPG水化液水化胶条后，采用在阳极端杯上样的方法上样。
ReadyPrepreduction-alkylationkit
Cuploadingtray
二、垂直条纹
在加样电极一端出现垂直条纹。
蛋白出现聚集或者沉淀。
∙稀释样品，在样品进行IEF前须对样品分析和定量,以确保正确的上样量.样品上样量通常和IEF时所选用的IPG胶条的长度和染色方法有关。
详细请见下表：
∙延长起始阶段低电压的时程，并逐步升压。
详细见下表:
Step
Voltage
Time
1
150V
>
3hr
2
300V
1hr
3
600V
4
1,200V
5
1,200V–10，000V
lineargradient
6
10,000V
steady-state
RCDCproteinassay
PROTEANIEFcell
出现垂直的点状条纹
a）平衡时间过短
b）SDS—PAGE胶的pH值错误
c）在平衡液中，SDS的浓度过低。
a）延长胶条平衡时间，如有必要，可以平衡多达30分钟。
b）检查制SDS—PAGE胶时所用Tris—HCl的pH是否8。
8.如果Tris—HCl的pH错误，那么SDS—蛋白复合物的迁移速度就会降低,从而产生垂直的点状条纹。
c）保证平衡液中的SDS浓度至少为2％（w/v）
Bio—Radprecastgels
ReadyPrep2—DstarterkitequilibrationbuffersIandII
Resolvinggelbuffer（1.5MTris-HCl，pH8.8）
条纹沿胶的纵轴垂直分布.
IPG胶条水化不充分，IPG水化液太少。
∙确保所选择IPG胶条的相应水化液的用量正确。
下表列出了不同长度胶条所需水化液的用量,但在实验中要按操作手册说明操作。
∙注意：
如果IPG胶条的上样水化液中已经含蛋白样品,那么上样量不能超过所推荐的加样量.另一方面，上样量不足会使IPG胶条总蛋白上样量不足。
∙如果样品仅仅部分润湿胶条，蛋白样品在胶条上就会分布不均匀.必须将聚胶槽中的胶条轻轻沿聚焦槽来回拖动几次,以使样品能完全润湿整根IPG胶条。
ReadyPrep2—Dstarterkitrehydration/samplebuffer
胶上出现了单独垂直的空白条带.
在IPG胶条和SDS—PAGE胶界面含有气泡
∙确保第二相SDS—PAGE胶的顶部为一直线，从而使IPG胶条和SDS-PAGE胶面完全紧贴。
∙在IPG胶条加到SDS-PAGE胶面上后，应用琼脂糖凝胶覆盖，以免胶条滑动.尽量避免在覆盖琼脂糖时产生气泡。
通常使用的琼脂糖浓度为0.5％或1%。
使用前须完全溶解。
PROTEANPlusoverlayagarose（Catalog#163-2092）
ReadyPrepoverlayagarose（Catalog＃163-2111）
三、其它
点弯曲。
灌制SDS-PAGE胶时，没有用覆盖液（如水饱和正丁醇）.
在灌制SDS-PAGE胶后，须立即在胶面顶部加覆盖液，如水饱和的（n-butanol，l—butanol,ort—butanol）.水饱和正丁醇须纯净，并呈一直线平铺于胶顶部。
Bio-Radprecastgels
胶的部分区域的点发生扭曲。
SDS—PAGE没有完全均匀地凝聚，电泳玻璃板没有被卡紧.
∙确保各配胶所需的试剂浓度正确，如TEMED，APS和其他试剂。
TEMED和APS的终浓度均为0。
05％，长度超过20cm的SDS-PAGE胶所须的TEMED的终浓度为0。
025%。
配胶所需的APS须新制,因为APS极易吸湿，在溶于水后就会分解,并会失活。
因此，应当确保APS在使用前新鲜配制。
∙聚丙烯酰氨凝胶过程和温度相关。
如果气温过低,那么凝胶就会失败。
因此须在室温时进行聚丙烯酰氨凝胶过程，如果温度过低,须对电泳玻璃板加热。
∙确保spacers，电泳玻璃板，和密封装置都紧密接触，并没有漏缝
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