药物分析总结Word文件下载.docx
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杂质限量=(标准溶液浓度*标准溶液体积)/供试品量*100%
第二节一般杂质的检查方法
一.氯化物的检查方法
微量的氯化物存在时,对人体无害,但它的量可以反映出药物的纯净程度,以及生产过程是否正常,常作为信号杂质看待。
原理:
药物中微量的氯化物在硝酸酸性溶液中与硝酸银试液作用,生产不溶氯化银白色浑浊液,与一定量标准氯化钠溶液在相同条件下生成的氯化银浑浊液比较,以判定供试品中氯化物是否符合限量规定。
方法:
除另有规定外,取各药品项下规定量的供试品,加水溶解使成25ml(溶液如显碱性,可滴加硝酸使成中性),再加稀硝酸10ml;
溶液如不澄清,应滤过;
置50ml纳氏比色管中,加水使成约40ml,摇匀,即得供试溶液。
另取各药品项下规定量的标准氯化钠溶液,置50ml纳氏比色管中,加稀硝酸10ml,加水使成40ml,摇匀,即得对照溶液。
于供试溶液与对照溶液中,分别加入硝酸银试液1.0ml,用水稀释使成50ml,摇匀,在暗处放置5分钟,同置黑色背景上,从比色管上方向下观察、比较,即得。
注意事项:
本法适合以50ml中含50μg-80μg的氯离子为宜。
过低的话,效果不明显;
过高的话,重现性不好。
所以样品的分析通过计算取适量的样品量进行分析。
检查需要在硝酸的酸性条件下进行,避免弱酸形成的银盐的干扰,同时加速氯化银的生成。
银盐不稳定,易发生分解,所以要在暗处放置。
在比较时,需要在黑色背景下,从上往下观察可较好的观察白色氯化银悬浊液。
对于不溶于水的药物,可反复震荡或者加热后,使得氯化物溶解后测定。
二.硫酸盐的检查方法
也是一种信号杂质。
利用硫酸盐与氯化钡溶液在盐酸酸性溶液中生成硫酸钡白色浑浊,与一定量标准硫酸钾溶液在相同条件下生成的硫酸钡浑浊比较,判断供试品中硫酸盐是否符合限量规定。
除另有规定外,取各药品项下规定量的供试品,加水溶解使成约40ml(溶液如显碱性,可滴加盐酸使成中性);
溶液如不澄清,应滤过;
置50ml纳氏比色管中,加稀盐酸2ml摇匀,既得供试溶液。
另取各药品项下规定量的标准硫酸钾溶液,置50ml纳氏比色管中,加水使成为约40ml,加稀盐酸2ml,摇匀,既得对照溶液。
于供试溶液与对照溶液中,分别加入25%氯化钡溶液5ml,用水稀释至50ml,充分摇匀,放置10分钟,同置黑色背景上,从比色管上方向下观察、比较,即得。
本法适用范围为0.2-0.5mg的硫酸根离子,相当于硫酸钾溶液的2.0-5.0ml。
太小则产生的硫酸钡浑浊不明显;
太大则无法区别其浓度差异,且重现性也不好。
加盐酸的目的是为了防止弱酸盐的干扰,但是酸度应适当,可控制在PH为1左右。
酸度增加,灵敏度降低。
加入氯化钡后,应充分振摇,防止局部浓度过大,从而影响结果。
三.铁盐检查法
药物中微量铁盐存在可加速药物的氧化和降解,因此需控制铁盐的存在量。
Chp和USP采用硫氰酸盐检查法,BP采用巯基醋酸法,后者的灵敏度更高,但试剂太贵。
硫氰酸盐法:
铁盐在盐酸酸性溶液中与硫氰酸铵铁配位离子,再与一定量标准铁溶液用同法处理后进行比色。
本法用硫酸铁铵配制标准铁溶液,加入硫酸防止铁盐水解,易于保存。
四.重金属检查法
重金属是指在实验条件下能与S2-作用显色的金属杂质。
由于在药品生产过程中遇到铅的机会较多,且铅在体内易蓄积中毒,因此以铅为代表。
如需对特定的金属或下述方法不能检测到得金属原子做限度检查,可以用专属性较强的AAS或具有一定专属性的经典比色法。
第一法硫代乙酰胺法
适用于在实验条件下溶于水、稀酸和乙醇供试液澄清、无色、对检查无干扰或经处理后对检查无干扰的药物。
硫代乙酰胺在弱酸条件下发生水解,产生硫化氢,与溶液中的重金属离子生生成黄色到棕黑色的硫化物混悬液,与标准铅溶液同法处理后所得颜色比较,判断供试品中的金属是否符合限量规定。
CH3CSNH2+H2OCH3CONH2+H2S
H2S+Pb2+PbS↓+2H+
本法标准铅溶液相当于10μg的Pb2+,适用于比色的范围为1-2ml标准铅溶液。
溶液pH值对结果影响较大,应用缓冲盐保存在3.0-3.5酸度增大,重金属离子与硫化氢呈色变浅,甚至不显色。
第二法炽灼后的硫代乙酰胺法
本法适用于检查含芳环、杂环以及在水、乙醇中难容,或能与重金属离子形成配位化合物的有机药物。
重金属可能与芳环形成牢固价键,需将供试品炽灼破坏,残渣加硝酸进一步破坏,蒸干,加盐酸转成可溶于水的氯化物,再按第一法进行检查。
炽灼时温度不宜过高,可控制在500-600度。
第三法硫化钠法
适用于难容于稀酸但能溶于碱性水溶液的药物,如巴比妥类药物等。
该法以Na2S为显色剂,使得Pb2生成PbS微粒的混悬液,与标准铅溶液同法制得结果比较。
在碱性介质中,以硫化钠为显色剂,使得铅离子生成硫化铅的混悬液,与一定量标准铅溶液同法处理后比较,判断是否超出限量。
该法中所用的硫化钠对玻璃有一定的腐蚀性,久置后产生絮状物,所以应临用前新制。
第四法微孔滤膜法
适用于含重金属2-5μg重金属及有色供试液的检查。
原理:
相当于将沉淀物富集后观测,可以提高灵敏度。
五.砷盐检查法
检查方法有两种:
古蔡氏法和二乙基二硫代氨基甲酸银法。
(一)古蔡氏法
利用金属锌遇算作用生产新生态的氢。
与药物中微量砷反应生成具有挥发性的砷化氢,遇溴化汞试纸,产生黄色至棕色的砷斑,与标准砷溶液同法制得砷斑比较,判断砷盐的含量。
Zn+2H+Zn2++H2↑
3H2+2As3+AsH3↑
AsH3+3HgBr3HBr+As(HgBr)3黄色
2As(HgBr)3+AsH33AsH(HgBr)2棕色
AsH(HgBr)2+AsH33HBr+As2Hg3棕黑色
测试时,于导管C中装入醋酸铅棉花60mg,再与旋塞D的顶端平面上放一片溴化汞试纸,盖上旋塞盖E旋紧。
标准砷斑的制备:
精密量取标准砷溶液2ml,置A瓶中,加浓盐酸5ml与水21ml,再加碘化钾试液5ml酸性氯化亚锡试液5滴,在室温放置10分钟后,加锌粒2g,立即将照上法装妥的导气管C密塞于A瓶上,并将A瓶置25-40.C水浴中,反应45分钟,取出溴化汞试纸。
检查:
取规定量试品,加盐酸5ml和水23ml,按以上方法制备砷斑。
1、为什么要加盐酸?
制做酸性环境,产生新生态的氢。
2、为什么要加碘化钾?
还原As5+为As3+;
生成的游离碘被氧化后和Zn2+形成稳定配合物,降低Zn2+的浓度,促进生成氢的反应不断进行;
抑制锑化氢的生成,避免生成锑斑,减少干扰
六.溶液颜色检查方法
中国药典采用三种方法检查溶液颜色:
第一法将药物溶液的颜色与规定的标准比色液比较。
第二法通过控制药物溶液在某波长处的吸收度来检查。
第三法用色差计进行判断。
七.碳化物检查法
药物中存在的遇硫酸易炭化或易氧化而呈色的微量有机杂质称为易碳化物。
八.溶液澄清度检查法
澄清度可以反映药物溶液中的微量不溶性杂质的存在情况。
在一定程度上可以反映药品的质量和生产的工艺水平,对于供制备注射液用原料药物的纯度检查。
多数药物的检查以水为溶剂,有机酸的碱金属盐类药物强调用新沸过的水,否则其中的二氧化碳将影响溶液的澄清度。
九.炽灼残渣检查法
有机药物经炭化或挥发性无机药物经热分解后,高温炽灼,所产生的非挥发性无机物杂质的硫酸盐,也称酸不溶性成分。
用于控制非挥发性无机杂质。
炽灼残渣%=(残渣及坩埚重-空坩埚重)/供试品重*100%
通常在700到800度炽灼,如需将残渣留作为重金属检查则炽灼温度必须控制在500到600度,防止挥发。
一十.干燥失重测定法
指药品在规定的条件下,经干燥后所减失的量。
由干燥至恒重的第二次及以后各次称重均应在规定的条件下继续干燥1h后进行。
干燥恒重主要指水分,也包括其他挥发性物质,如残六的挥发性溶剂等。
中国药典规定供试品连续两次干燥或炽灼后称重的差异在0.3mg以下即符合要求。
干燥失重测定法:
常压恒温干燥法(常用),干燥剂干燥法,减压干燥法,热分析法。
十一.水分测定法
ChP中收录了费休氏法和甲苯法测定。
十二、残留溶剂测定法
GC检查有机溶剂残留。
色谱适用性试验要求:
理论塔板数:
毛细管色谱柱>
5000;
填充柱>
1000;
内标物与待测物的分离度>
1.5;
内标法中待测物与内标物的峰面积比值RSD<
5%;
外标法RSD<
10%。
进样方法:
顶空进样法和溶液直接进样。
顶空进样相对污染较少,后者有可能造成色谱柱的污染。
毛细管柱顶空进样等温法:
适用于当需要检查的有机溶剂数量不多,且极性差异较小时的分析。
毛细管柱顶空进样系统程序升温法:
适用于有机溶剂数量较多,且极性差异较大时的分析。
第三节特殊杂质的检查方法
检查药物中的微量特殊杂质,首要问题是要选择一个专属性强的方法。
药物的存在不能干扰杂质的检测,所以药物中杂质的检查主要依据药物与杂质在物理性质或化学性质上差异的进行的。
第四章药物定量分析与分析方法验证
第一节定量分析样品的前处理方法
一、概述
药物的处理方法需根据它们在分子中结合的牢固程度不同而有所选择。
含卤素药物结合牢固与否有三种情况:
(1)与苯环直接相连,卤原子和苯环形成强共轭结构,电子云密度重新分布,此时卤原子结合牢固,不易脱离;
需要破坏后才可分析。
(2)与脂肪链相连,结合不牢固;
根据情况选择。
(3)与苄基相连,相当于活泼取代氢的位置,卤原子易脱掉,结合最不牢固,易处理。
含金属药物
含金属药物前处理有两种情况:
(1)金属原子不直接与碳原子相连,通常为有机酸或者酚的金属配合物,即含金属的有机药物,结合不牢固,很容易在水溶液中离解成金属离子;
如果有机结构部分不干扰分析,可在溶液中直接进行金属的鉴别和含量测定。
(2)金属原子直接与碳原子以共价键连接,结合状态比较牢固,即有机金属药物。
该类药物在溶液中一般不能解离成离子状态。
此时,可以根据金属共价键的牢固程度,经处理后转变为可分析的离子状态,然后进行相应分析。
因此,对于含金属或卤素等的药物,需要根据药物与他们结合牢固程度,预先进行适当处理。
处理方法:
(1)不经有机破坏的方法,适用于与苄基相连的卤素及金属有机药物等;
(2)需要有机破坏的方法,适用于苯环直接相连和有机金属药物等。
二、不经有机破坏的分析方法
本类方法不对药物分子中的有机结构部分进行完全破坏,仅选用适当的溶剂溶解样品,使得待测元素离子电离,或经简单的回流处理使得有机结合的待测元素离解而转化成无机盐类后测定。
(一)直接测定法
凡金属原子不直接与碳原子相连的有机药物或者某些虽然相连但结合非常不牢固的有机金属药物,在水溶液中都可以直接电离为离子状态,可以直接测定分析。
可以应用的有配位滴定法和氧化还原滴定法。
(二)经水解后测定法
分为两种:
碱水解后测定和酸水解后测定
1.碱水解后测定:
适用于含卤素有机药物中卤原子结合不牢固的药物,如卤素和脂肪碳链相连者。
将药物在适当溶剂中溶剂后,加氢氧化钠溶液后加热回流使其转变成无机形式的离子后分析。
2.酸水解后测定法:
将含金属的有机药物与适当的矿酸共沸,将不溶性金属盐类水解置换成可溶性盐,然后选用配位滴定法或剩余酸碱滴定法测定。
(二)经还原分解后测定法
卤素中的碘若结合在芳环上面,由于形成共价键,须在碱性溶液中加还原剂回流,使得碳-碘键断裂,形成无机碘后测定。
三、经有机破坏的分析方法
(一)湿法破坏
本法适用于含氮有机合成药物的前处理,在生物制品分析中用于氮(包括蛋白质)、磷、硫及氯化钠测定法的前处理。
另外,此法还可用于生物样品中金属元素测定时生物基质的去除
本法主要使用硫酸作为分解剂(消解或消化),常加入氧化剂(如硝酸、高氯酸、过氧化氢等)作为辅助分解剂。
根据分解剂组合形式的不同,本法可分为若干种方法
(二)干法破坏
本法主要适用于含卤素、硫、磷等有机药物分析的前处理,也可用于某些药物中硒及砷盐的检查。
可分为高温炽灼法和氧瓶燃烧法。
1.高温炽灼法是将含待测的有机药物经高温炽灼灰化,使有机药物分解而待测元素转化成为无机元素或可溶性无机盐,然后进行分析。
本法主要适用于含卤素药物的鉴别,也用于含磷药物的含量测定和药物中砷盐的检查。
适用于湿法不易完全破坏的有机物,以及某些不能用硫酸进行破坏的有机药物。
2.氧瓶燃烧法是将含有待测元素的有机物置于充满氧气的密闭的燃烧瓶中充分燃烧,使待测元素转化为不同价态的氧化物,被吸收于适当的吸收液中,然后根据待测物质的性质,选用合适的方法进行分析。
本法适用分析含卤素有机药物、氮、硫和硒等药物。
操作法:
在燃烧瓶中加入规定的吸收液,并将瓶口用水湿润;
小心急速通氧气约1分钟,立即用表面皿覆盖瓶口,备用;
点燃包邮供试品的滤纸包,迅速放入燃烧瓶中,按紧瓶盖,用少量水封闭瓶口,使燃烧完毕,充分振摇,使生成的烟雾完全吸收入吸收液中,放置15min后,用少量水冲洗瓶塞及铂丝,合并洗液和洗手液。
然后用同法做空白试验。
需要注意的问题:
(1)氧气要充足!
燃烧要充分。
(2)瓶中不得有有机溶剂残留!
(3)不得有润滑油等涂抹瓶口!
(4)水封瓶口,且用手按住瓶口!
(5)选择合适的吸收液(多数是水和氢氧化钠的混合液)
(6)若瓶中出现黑色颗粒,则为燃烧不充分
第二节定量分析方法的特点
一、容量分析法
(一)容量分析法的特点
为经典方法,滴定分析法。
是将已知浓度的药物由滴定管滴加到待测药物的溶液中,直到所加滴定液与被测药物反应完全为止(通过适当方法指示),然后根据滴定液的浓度和消耗的体积,按化学计量关系计算出被测药物的含量。
化学计量点与滴定终点并不一定恰好符合,二者之差称为滴定误差。
指示剂的选择和灵敏度是影响结果的原因之一,常产生滴定误差;
合适的指示剂可以使得滴定终点尽可能的接近滴定反应的化学计量点。
特点:
1、快速,准确(RSD<
0.2%),灵敏度高;
2、适合于高含量或中含量组分分析(1%)。
所以,广泛用于原料药的含量测定。
3、仪器简单,操作方便,适用范围广4、专属性较差。
二、光谱分析法
利用物质的光谱进行定性、定量和结构分析的方法称为光谱分析法。
主要是通过测定被测物质在光谱的特定波长处或一定波长范围的吸光度或发光强度,对该物质进行分析的方法,称为分光光度法。
主要有紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、原子吸收分光光度法、荧光分析法和火焰光度法。
1.紫外-可见分光光度法
该法是对物质在紫外光区和可见光区的单色辐射的吸收特性建立的光谱分析法。
遵循朗伯比尔定律:
A=ECL
定性分析较弱,多用于定量分析。
(1)灵敏度高,可达到10-4~10-7g/ml;
(2)准确度高,相对误差为2%~5%;
(滴定分析呢?
)(3)仪器价格较便宜,操作简单,易于普及
(4)应用广泛。
是HPLC中使用最为广泛的检测器类型。
吸光度的准确度校正用硫酸溶液在不同波长处的吸光度进行规定。
对溶剂的要求:
含有杂原子的有机溶剂通常具有较强的末端吸收,因此它们的适用范围不能小于截至波长。
还需要对溶剂的纯度进行检查,否则也会造成干扰。
测定法:
对照品比较法;
吸收系数法(误差大);
计算分光光度法;
比色法
2.荧光分析法
某些物质紫外光火可见光照射激发后发射出比激发光波长较长的荧光,利用物质在一定浓度时,其荧光强度与溶液中该物质的浓度成正比关系,可以用来定量分析。
1、灵敏度高,比UV-Vis更高,可达到10-10~10-12g/ml;
2、浓度太高,有荧光淬灭作用,应在低浓度中进行测定;
3、可以通过衍生化的方法,使得无荧光的物质带有荧光基团。
三、色谱分析法
是一种分离分析的方法,根据混合物中各组分的色谱行为差异,先行分离后在线对各组分逐一进行分析的方法,是分离混合物的有力手段。
1、HPLC:
适用范围广,越来越广泛2、GC:
理论成熟,但使用受限
3、TLC:
少用于定量,TLCS应用不多
色谱法特点:
1、条件选择范围宽,包括色谱柱、流动相、检测器等。
2、应用范围宽:
大部分药物都可以用色谱法分析,以HPLC为最广泛。
3、灵敏度高,准确度好,重现性好。
4、操作繁琐,实验消耗大。
5、适用于多组分的分离分析,与光谱等联用,可进行定性和定量分析。
(一)HPLC法
主要区别:
固定性差别,输液设备和检测手段
经典HPLC:
仅作为一种分离手段。
柱内径1~3cm,固定相粒径>
100μm且不均匀;
常压输送流动相;
柱效低(H↑,n↓);
分析周期长;
无法在线检测。
HPLC:
分离和分析
柱内径2~6mm,固定相粒径<
10μm(球形,匀浆装柱);
高压输送流动相;
柱效高(H↓,n↑);
分析时间大大缩短;
可以在线检测
与经典LC比较,HPLC具有如下优点:
(1)采用高效固定相,柱效高,分离效率高;
(2)采用高压泵输送流动相,流速快,分析速度快,一般需要几分钟到十几分钟即可分析完样品,要求20分钟之内分析结束;
(3)广泛采用高灵敏度检测器,可分析微量或极微量物质的含量。
UV检测器可达到1ng,荧光检测器可达到1pg。
但不是对所有样品都可达到这个灵敏度。
HPLC与GC比较:
相同:
兼具分离和分析功能,均可以在线检测
区别:
分析对象的差别和流动相的差别
1、GC:
分析可气化、热稳定性好、且沸点较低的样品,对于高沸点、挥发性差、热稳定性差、离子型及高聚物的样品难以分析。
可分析样品占有机物的20%。
采用流动相为惰性气体,组分与流动相无亲合作用力,只与固定相作用。
实验过程常需加温操作。
3.HPLC:
可分析溶解后能制成溶液的样品,不受样品挥发性和稳定性的限制,对于分子量大、难气化、热稳定性差及高分子和离子型样品均可检测;
所以用途广泛,约占可分析有机物的80%。
HPLC的流动相为液体,流动相与组分间有亲合作用力;
流动相种类较多,选择余地广;
可选用不同比例两种或两种以上液体作为流动相。
实验过程一般是常温。
与GC比较,HPLC具有的优点:
(1)分析样品范围广,不受样品挥发性和热稳定性的影响;
(2)流动相选择范围宽,可精细调节流动相的条件,使得分析结果符合要求;
(3)一般常温进行,不需要高柱温。
一、定性分析法
HPLC的定性分析法可以分为色谱鉴定法和非色谱鉴定法,后者可以分为化学鉴定法和两谱联用鉴定法。
1.色谱鉴定法:
利用色谱定性参数保留时间和相对保留值,或用已知物对照法对组分进行鉴别分析。
原理是同一物质在相同色谱条件下保留时间相同。
鉴定已知的化合物。
2.化学鉴定法:
利用专属性化学反应的分离后收集的组分进行定性分析。
此法适合于鉴定组分属于哪一类化合物。
3.两谱联用鉴定法:
当相邻两组分的分离度够大时,以制备HPLC获得纯组分,而后与UV、IR、MS或NMR等分析手段进行定性鉴定。
色谱的定量,都需要色谱系统符合一定要求,包括对主要组分的理论塔板数、主要组分与其他组份的分离度,以及重复性和主要组分的峰对称因子等。
分离度和重复性是其中更具实用意义的参数。
n=5.54(tR/Wh/2)2
,R>
1.5,另有规定除外。
重复性:
取各品种项下的对照溶液,连续进样3~5次,除另有规定外,其峰面积测量值的相对标准偏差应不大于2.0%
拖尾因子(T):
为保证分离效果和测定精度,应检查待测峰的拖尾因子是否符合各品种项下的规定。
拖尾因子的计算公式为:
除另有规定外,峰高法定量时T应在0.95~1.05之间
1.外标法:
是以对照品的量对比求算样品含量的方法。
只要待测组分出峰、无干扰、保留时间适宜,即可用外标法定量。
外标法分为校正曲线法,外标一点法以及外标两点法等。
2.内标法:
是以待测组分和内标物的峰高或峰面积比求算含量的方法。
使用内标法可以抵消仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的定量分析误差。
如果在样品处理前加入内标,则可消除方法全过程引起的误差。
内标法可以分为校正曲线法、内标一点法、内标两点法和校正因子法等。
3、内加法:
是将待测组分的对照品加至待测样品溶液中,测定增加对照品后的溶液比原样品溶液中组分的峰面积增加量,以求算该组分含量的方法。
此法不需要内标物,又能克服由于进样不准确带来的定量分析误差。
若只求多组分混合物中某一组分的含量,而无合适的内标物,或者色谱图上无空隙再插入内标峰时可采用此法。
第三节药品分析方法的验证
药品质量标准分析方法验证的目的是证明采用的方法适合于相应样品分析的要求。
在建立药品质量标准时,药品生产工艺变更、制剂的组分改变或原分析方法进行修订时,质量标准分析方法也需要验证。
需要验证的分析项目有:
鉴别试验;
杂质定量或限度检查;
原料药或制剂中有效成分的含量测定;
以及制剂中其他组分的测定;
药品溶出度、释放度;
溶出量。
验证内容有:
准确度;
精密度(包括重复性、中间精密度和重现性);
专属性;
检测限、定量限;
线性、范围;
耐用性等。
一、准确度
准确度是指用该方法测定的结果与真实值或参考值接近的程度,一般用回收率来表示。
准确度应在规定的“范围”内测试。
“范围”指的是确定的测试方法适用的高低限浓度或量的区间。
定量测定的分析方法均需做准确度验证
第五章巴比妥类药物的分析
一、巴比妥类药物的基本结构
环状丙二酰脲结构。
多数为5,5-取代的巴比妥类药,少数有1,5,5-取代的巴比妥类药,还有5,5-取代的