水稻转基因组织培养步骤的具体事宜.docx

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水稻转基因组织培养步骤的具体事宜

农杆菌介导的转化

一．试剂

1

6-BA（6-BenzylaminoPurine）

SigmaCatNo.B-5898

2

KT（Kinetin）

SigmaCatNo.K-0753

3

NAA（Napthaleneaceticacid）

SigmaCatN-0640

4

IAA（Indole-3-aceticacid）

SigmaCatNo.I-5148

5

2,4-D（2,4-Dichlorophenoxyaceticacid）

SigmaCatNo.D-8407

6

Kanamycin

USBCatNo.17924

7

CH（CaseinEnzymaticHydrolysate）

SigmaCatNo.C-7290

8

Hn（hygromycinB）

GiBcoBRLCatNo.10687-010

9

Cn（Carbenicillin）

国产分装

10

Nicotinicacid

SigmaCatNo.N-0765

11

PyridoxineHCl

SigmaCatNo.P-8666

12

ThiamineHCl

SigmaCatNo.T-3902

13

Inositol

SigmaCatNo.I-3011

14

Phytagel

SigmaCatNo.P-8169

15

DimethylSulfoxide-DMSO

SigmaCatNo.D-5879

16

X-gluc（5-bromo-4-chloro-3-indolyl-D-galactoside）

SigmaCatNo.B-3783

17

AS（Acetosringone）

Aldrichchem.,CO01531EG

二．溶液

1.MSmax

NH4NO316.5g

KNO319.0g

KH2PO41.7g

MgSO4∙7H2O3.7g

CaCl2∙2H2O4.4g或CaCl23.32g

逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

2.MSmin母液（100×）

KI0.083g

H3BO30.62g

MnSO4∙4H2O2.23g或MnSO4∙H2O1.69g

ZnSO4∙7H2O0.86g

Na2MoO4∙2H2O0.025g

CuSO4∙5H2O0.0025g

CoCl2∙6H2O0.0025g

注意：

Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合。

加dH2O定容到1000ml室温保存。

3.N6max母液（10×）

KNO328.3g

KH2PO44.0g

（NH4）2SO44.63g

MgSO4∙7H2O1.85g

CaCl2∙2H2O1.66g或CaCl21.25g

逐一溶解药品后，加dH2O定容到1000ml。

4.N6min母液（100×）

KI0.08g

H3BO30.16g

MnSO4∙4H2O0.44g或MnSO4∙H2O0.3335g

ZnSO4∙7H2O0.15g

加dH2O定容到1000ml室温保存。

5.Fe2+-EDTA（100×）

取一个烧杯加300mldH2O以及FeSO4∙7H2O2.78g；

在另一个烧杯中也加300mldH2O加热到70℃后加入Na2EDTA∙2H2O3.73g；

待到两种药品都溶解了，混合，70℃保温2hr，然后加dH2O定容到1L，4℃保存。

6.维生素（100×）

Nicotinicacid0.1g

PyridoxineHCl（VB6）0.1g

ThiamineHCl（VB1）0.1g

Glycine0.2g

Inositol10g

加dH2O定容到1000ml4℃保存。

7.AAmax母液（10×）

KCl29.50g

NaH2PO41.50g或NaH2PO4∙2H2O1.95g

MgSO4·7H2O2.50g

CaCl2∙2H2O1.50g或CaCl21.13g

加dH2O定容到1000ml室温保存。

8.AAmin母液（1000×）

MnSO4∙H2O1.0g

H3BO30.3g

ZnSO4∙7H2O0.2g

KI0.075g

NaMoO4∙2H2O0.025g

CuSO4∙5H2O0.0025g

CoCl2∙6H2O0.0025g

Na2MoO4必须单独溶解后再与其它组分混合，加dH2O定容到1000ml室温保存。

9.2,4-D母液（1mg/ml）

2,4-D100mg

先加1.0ml1NKOH摇5min，然后加10mlH2O继续摇直到2,4-D溶解，加水定容到100ml室温保存。

10.6-BA母液（1mg/ml）

6-BA100mg

加1.0ml1NKOH摇直到6-BA溶解，加水定容到100ml室温保存。

11.NAA母液（1mg/ml）

NAA100mg

加1.0ml1NKOH并搅动直到NAA溶解，加水定容到100ml室温保存。

12.IAA母液（1mg/ml）

IAA100mg

加1.0ml1NKOH摇直到IAA溶解，加水定容到100ml室温保存。

13.100mMAS母液（1mg/ml）

AS0.196g

DMSO10ml

分装到1.5ml离心管4℃保存。

14.1NKOH母液（1mg/ml）

KOH5.6g

用100mlH2O溶解后室温保存。

15.羧苄青霉素2钠（CN）（200mg/ml）

CN干粉1g

用5ml灭菌dH2O溶解后，分装到1.5mlTub中（无菌操作）。

或者用5ml75％酒精溶解，分装到1.5mlTub中（无菌操作）。

16.Astocksolution（继代A）:

硝酸铵16.5g

硝酸钾19.0g

磷酸二氢钾1.7g

七水硫酸镁3.5g

二水氯化钙4g/无水氯化钙3g

加水依次溶解，定容1000ml，室温保存

17.Bstocksolution（继代B）:

四水硫酸锰5.0g

硼酸1.5g

七水硫酸锌2.0g

碘化钾0.75g（未完）

二水钼酸钠0.25g

五水硫酸铜0.0389g

六水氯化钴0.025g

加水依次溶解，定容1000ml，室温保存

（二水钼酸钠单独称，单独溶，缓慢加入，边加边搅）

三．农杆菌介导的水稻愈伤的遗传转化过程

1愈伤诱导

1）成熟种子脱壳后70%酒精灭菌1min，0.15%HgCl2处理15min；

2）灭菌单蒸水洗5-7次；

3）将种子接种到诱导培养基上，每瓶接6-8粒；

4）置黑暗中26±1℃处理约4-7周。

2愈伤继代

挑取浅黄、致密且相对较干的胚性愈伤接种到继代培养基上26±1℃处理2周，不可接太多。

3预培养

挑取致密且相对较干的胚性愈伤接种到预培养基上置黑暗中3至4天。

4农杆菌准备

准备浸染的农杆菌扩大培养。

在相应抗性平皿中涂菌，28度培养箱中培养2－3天

5农杆菌悬浮培养准备

将农杆菌转移（粳稻：

用接种环刮入半环-1环菌，籼稻：

3环-4环菌）到100ml悬浮培养基中28℃摇瓶培养30-60min。

6农杆菌侵染（共培养）

1）经过预培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；

2）调整农杆菌悬浮液的OD600值到0.8-1.0之间；

3）用农杆菌悬浮液浸泡愈伤20－30min；

4）倒去菌液，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；

5）愈伤放在灭菌的滤纸上晾干后，转移到共培养培养基上去。

培养物19-20℃黑暗处理2天。

7水洗和筛选

1）经过共培养的愈伤转移到一个灭菌的三角瓶中；

2）用灭菌单蒸水洗5至7次愈伤；

3）用含有400ppmCn（羧苄青霉素二钠）的灭菌水浸泡愈伤30min（封好口后，可于28度，180至200RPM摇20－30min）；

4）倒去含抗生素的灭菌水，将三角瓶倒立于含滤纸的灭菌小皿中约15min；

5）在灭菌的滤纸上晾干愈伤；

6）转移愈伤到相应抗性的筛选培养基筛选2-3个循环（每个循环约2周）

8预分化与分化

1）经过筛选得到的抗性愈伤转到带抗性的预分化培养基的培养皿中，黑暗处理5-7天；

2）经过预分化的愈伤转移到100ml三角瓶里的分化培养基中，每瓶3粒愈伤，只选亮黄色的抗性愈伤，不必接入太多。

；

3）26℃光照处理，约需40－60天。

9生根

1）从分化瓶中挑出要做生根的苗子，同一块愈伤所得的苗子只选一棵；

2）剪掉所有原有的根，注意不要剪掉分生组织；

3）将苗子转入生根培养基，28℃光照处理7至10天。

10移栽

移去生根管的封口膜，倒入约1cm深的自来水，在光照培养室炼苗3－4天，移栽至准备好的栽种处。

四．培养基

注意：

所有的培养基必须现配现用。

（一）粳稻的转化

1.诱导培养基（用于粳稻）

N6max母液（10×）100ml

N6min母液（100×）10ml

Fe2-EDTA母液（100×）10ml

Vitamin母液（100×）10ml

2,4-D母液2.5ml

脯氨酸0.3g

水解酪蛋白0.6g

蔗糖30g

Phytagel3g

加H2O600-700ml并用KOH调节pH到5.9，煮沸后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口灭菌。

2.继代培养基（用于粳稻）

N6max母液（10×）100ml

N6min母液（100×）10ml

Fe2-EDTA母液（100×）10ml

Vitamin母液（100×）10ml

2,4-D母液2.0ml

脯氨酸0.5g

水解酪蛋白0.6g

蔗糖30g

Phytagel3g

加H2O900ml并用1NKOH调节pH到5.9，煮开后加H2O定容到1000ml，分装到50ml三角瓶中（25ml/瓶），封口膜封口灭菌。

3.预培养培养基（用于粳稻）

N6max母液（10×）12.5ml

N6min母液（100×）1.25ml

Fe2-EDTA母液（100×）2.5ml

Vitamin母液（100×）2.5ml

2,4-D母液0.75ml

水解酪蛋白0.15g

蔗糖5g

琼脂粉1.75g

加H2O250ml并用1NKOH调节pH到5.6，封口膜封口灭菌。

使用前，煮溶培养基，加入5ml葡萄糖母液（灭菌的50%葡萄糖溶液）和250μlAS母液，然后分装到培养皿中（25ml/皿）。

4.共培养培养基（用于粳稻）

N6max母液（10×）12.5ml

N6min母液（100×）1.25ml

Fe2-EDTA母液（100×）