MASSARRAY原理Word文档格式.docx
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SNP分型
1、技术名称
SequenomMassARRAYSNP基因型分析技术
MassARRAY技术流程:
2、技术原理
SequenomSNP检测系统基本原理为基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOFMS)技术。
主要特点是,PCR扩增后的产物,加入SNP序列特异延伸引物,在SNP位点上,延伸1个碱基。
然后将制备的样品分析物与芯片基质共结晶,将该晶体放入质谱仪的真空管,而后用瞬时纳秒(10-9s)强激光激发,由于基质分子经辐射所吸收的能量,导致能量蓄积并迅速产热,从而使基质晶体升华,核酸分子就会解吸附并转变为亚稳态离子,产生的离子多为单电荷离子,这些单电荷离子在加速电场中获得相同的动能,进而在一非电场漂移区内按照其质荷比率加以分离,在真空小管中飞行到达检测器。
MALDI产生的离子常用飞行时间(Time-of-Flight,TOF)检测器来检测,离子质量越小,就越快到达。
理论上讲,只要飞行管长度足够,TOF检测器可检测分子的质量数是没有上限的。
MASSARRAYSNP检测的质谱范围为5000到
8500Dalton。
图2:
飞行时间质谱法对SNP进行分型的原理示意图
质谱检测
3、
技术特点
灵活:
¨
可以自由选择感兴趣的SNP位点
一张芯片上,样本的数量和位置可以自由选择
一张芯片上,样本和SNP位点的配对可以自由选择
准确:
直接检测待测物分子量,准确度超过99.7%
质谱技术灵活检测PCR实验失败或三等位基因的存在
高通量:
一张芯片上可完成384个样品的多重iPLEXGOLD实验
每个反应孔可实现多达40重反应
每天最多能进行十万个基因型分析
性价比高:
无需荧光标记,成本大大降低
即便在低通量的情况下每个基因型分析的成本仍然很低
上海枫林医药临床检验有限公司
上海枫林医药临床检验有限公司作为上海医药临床研究中心的中心实验室是该中心技术支持服务的核心平台.枫林检验作为一个独立的临床实验室服务提供者可以为各级医疗机构提供广泛而专业化的外包检验服务也可以为国内外各医药研究机构提供“独立第三方”形式的临床研究检测服务。
实验室以美国病理家协会(CAP)和ISO15189的质量认证体系为框架进行建设,并构建了与国际接轨的自动化信息系统。
具体业务包括药物分析、药物代谢动力学、药效学等药物临床研究服务;
血液、生化、微生物、免疫、分子生物学和病理等常规检验服务;
以及生物基因分析、生物标志物检测等技术服务。
...
4、优势:
(1)质谱仪检测的是分子最本质的特征之一——分子量,不涉及荧光标记、凝胶电泳等,就能检测一个碱基的差异,准确性高,机器本身出错的概率非常低;
(2)质谱仪的灵敏度非常高,检测窗口内,任何pmol级别的物质都能被检测出来;
(3)通量高:
几秒就能检测完一个反应孔;
(4)操作简单,仪器要求简单,除质谱仪外,都是常规PCR仪器;
(5)灵活:
每天可以完成几个反应至上万个反应;
(6)便宜:
引物不带荧光标记,普通长度(3条引物总长80bp左右),此外在一个反应孔内能完成4个或更多的反应,即通常所说的4重反应;
(7)兼容性强:
质谱仪还能在核酸的其它方向,以及蛋白质组学、微生物鉴定等领域也能应用。
(8)质谱技术是“一管式操作”,即反应体系在生化学实验过程中始终在一个试管内反应,没有多次转移,这样就减少被污染的概率。
甲基化研究
DNA甲基化是表观遗传学的重要组成部分,在维持正常细胞功能、遗传印记、胚胎发育以及人类肿瘤发生中起着重要作用。
MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPERDNA甲基化分析技术结合了碱基特异性酶切反应和MALDI-TOF测序原理。
两者的完美结合使得该技术成为高准确性、高通量及高灵敏度的DNA甲基化定量分析手段。
MassARRAY分子量阵列基因分析系统EpiTYPERDNA甲基化分析技术是高通量DNA甲基化定量技术。
实现多重CpG的甲基化位点的定位定量检测。
配套的EpiTYPER软件为用户提供便捷的数据分析和报
告工具。
实验原理:
碱基特异性酶切(MassCLEAVE)
实验从亚硫酸盐处理待测DNA开始。
经过亚硫酸盐处理DNA中的未甲基化的胞嘧啶(C)转变为尿嘧啶(U),由此在DNA模板中产生了甲基化特异的序列变化。
利用5末端带有T7-启动子的引物进行PCR扩增。
产物经虾碱性磷酸酶(SAP)处理后用于碱基特异性的酶切反应。
酶切后DNA片段的大小和分子量取决于亚硫酸盐处理后的碱基变化。
配套软件EpiTYPER则能自动报告每个相应片段的甲基化程度。
图原理流程
数据处理与输出
EpiTYPER软件系统提供先进方便的DNA甲基化定量分析手段。
该软件系统提供数字和图像注释工具,并能将实验数据与客户提供的DNA序列相吻合。
作为内在的质量控制机制,该系统还包括了基本统计学分析方法及数据可靠程度的评估手段。
图EpiTYPER软件分析示意图
图:
甲基化程度质谱原始图
平台优势:
高性能——能够分析覆盖长达600bp内的多个CpG位点,能够分析福尔马林处理的石蜡组织,无需任何荧光标记。
高精度和高准确性——准确地进行甲基化定量从10%到90%,标准差只有5%,不同实验室的实验结果可比性强、可重复性高。
高性价比——用384孔板进行PCR反应,反应容积小节省试剂,一个扩增产物可以进行多个CpG位点分析。
操作简单——无需设计CpG位点特异性引物,无需进行PCR产物纯化,研究几个到几百个甲基化位点的理想手段,全自动标准化软件和数据报告形式使不同样本的比较简便易行。
CNV定量检测
基因拷贝数多态(CNV)是造成个体差异的重要遗传基础,也是近来基因组学的研究热点。
目前已有超过160万个专为基因组拷贝数变异或更小的基因组区域变异检测而优化设计的TaqMan®
CNV预制试剂盒,结合ABI7900实时定量PCR,可对检测样本进行目标基因(具有拷贝数多态)以及参照基因(没有拷贝数多态)拷贝数定量分析,通过比较两个检测值的比值可以检测样本的候选基因的拷贝数。
检测原理
实验流程
CNV检测的重要性:
与遗传病,如癌症,免疫疾病和神经系统疾病等基因组水平的异常相关
基因计量效应具有相应的表型
CYP2D6基因的拷贝数多态性与药物代谢表型关联
CCL3L1基因的拷贝数多态性影响人对HIV/AIDS病毒的易感性
检测方法:
技术优势
∙具有高度特异性和高重复性的TaqManCNV分析技术。
∙超过160万预合成的CNV检测试剂盒,可用于检测已知基因、已知拷贝数变化区域和非编码基因区域。
∙可根据客户需求采用ABI成熟的算法灵活设计CNV检测试剂盒。
参考文献
1.Gonzalez,E.,etal.,TheInfluenceofCCL3L1Gene-ContainingSegmentalDuplicationsonHIV-1/AIDSSusceptibility,Science.2005,307(5714):
1434-1440
2.Rose-ZerilliMJ,etal.,Copy-numbervariationgenotypingofGSTT1andGSTM1genedeletionsbyreal-timePCR,ClinChem.200955(9):
1680-1685
知名用户
SequenomMassARRAY®
平台应用先进的质谱技术,为基因组学的研究提供了无与伦比的灵敏度和特异性,被认为是行业内的金标准,该平台已在全球卖出300多台,被广泛应用于全球顶尖的基因研究机构,例如:
美国国立卫生研究院,哥伦比亚大学医学中心,英国Sanger中心,日本东京大学,香港大学,香港中文大学,台湾中央研究院,上海瑞金医院血液病研究所,中科院北京基因组所,等等。
科研成果
Sequenom以其卓越的解决方案赢得了全世界科学家的认可。
利用sequenom优秀的技术平台和解决方案,科学家们在以下各个领域已经或即将取得瞩目的进展和应用。
医学
SNP是继人类基因组测序完成后人类基因组研究的又一重要研究领域。
大量优秀的文章和研究成果获得。
尤其是在SNP与疾病发病的关联性方面取得很大的进展。
我国科学家也取得了优秀的成绩。
如协和医科院的林东欣教授在肺癌研究的成果和安徽医科大学张学军教授在银屑病方面的研究成果均发表在《naturegenetics》杂志上。
1、肿瘤发病及其相关SNP研究和肿瘤的诊断。
肿瘤的发生是多种因素的共同作用。
既有环境因素的影响,又有个体内在的易感性。
这些易感性尤其体现在SNP上。
众多研究成果都日益证明SNP与肿瘤的发生发展关系密切。
Sequenom系统在GWAS后的大样本量的验证方面发生了重要作用。
如
TongSunetal.NATUREGENETICS2007,39(5):
605-613
中国医学科学院的林东欣教授实验室和北京基因研究所的曾长青教授实验室联合研究了肺癌发病与SNP相关性,发现在CASP8启动子上存在的6碱基缺失与肺癌的发病风险存在相关性。
采用sequenom系统4995例病人样本和4972例对照样本进行了验证,发现该变异与多种肿瘤的发生相关。
WeiZhengetal.NatureGenetics2009,42
(2),324-328
美国范德比特药学院和上海肿瘤研究所的研究者通过对中国妇女GWAS研究以发现乳腺癌相关变异。
通过1505例病人和对照样本的分析获得29个候选SNPs,经sequenomiplex系统在1554例病人和1576对照进行验证。
后经3472例病例和900对照对四个位点进行进一步研究。
发现位于ESR1基因上游的6q25.1上SNPrs2046210位点同乳腺癌相关联。
几年来,采用GWAS和各种SNP验证方法发现了各种肿瘤的易感SNP位点。
这些位点是否具有广泛的代表性,是否能够为肿瘤的预防、治疗和个体化治疗所用,对SNP检测的方法学要求十分严格,即要求检测的准确性和灵敏度,又要去检测的高通量且价格合适。
Sequenom系统是一个十分合适的系统,通量高,准确度和灵敏度好,且单位检测价格低廉。
非常适合临床应用。
2、各种重要疾病
目前,糖尿病、心脏病、帕金森、银屑病等各种流行性和重点疾病都证明有SNP变异有关联。
Xue-JunZhangetal.NATUREGENETICS2009,42
(2):
205-210
安徽医科大学张学军教授领导的实验室研究了银屑病和SNP的关联性。
GWAS分析发现了9个位点的显著差异,利用sequenommassarray系统在5182例病人和6516对照的研究发现了三个差异显著的SNP位点,其中两个位点为已有报道位点,位于LCE基因簇上的rs4085613位点为新发现的位点。
RobertSladeketal.Nature2007,445,881-885
加拿大的ConstantinPolychronakos实验室采用GWAS分析发现了四个位点与二型糖尿病相关,并经sequenom系统进行验证。
MinervaMCarrasquilloetal.NatureGenetics2008,41
(2),192-198
美国StevenGYounkin团队通过分析844例晚期AD病例和1255例的WGAS研究获得了25个显著相关的位点,利用sequenomiplex进行了进一步的验证工作,发现在Xq21.3上的PCDH11X伤的SNP(rs5984894)与晚期AD相关
3、流行病学和病源微生物检测
Sequenom系统和SNP同样在流行病学和病源微生物的分型检测上具有光明的应用前景。
目前针对于HPV分型的检测、乙肝耐药性的检测、结核病耐压性的检测研究都在飞速进展。
H.YangPNAS2005,102:
7683-7688
HPV已经被证明与宫颈癌、食管癌等肿瘤的发生相关。
但由于HPV分型繁多,只有高危型HPV才有致病风险。
因此,HPV的检测不仅是检测HPV的存在与否,更重要的是检测HPV分型。
利用Sequenom系统,D.M.Kurnita实验室实现了在人血清中进行HPV分型,灵敏度由于RT-qPCR,且特异性得到保证。
后续的研究不仅实现了HPV的分型检测,且可以一次反应进行20中HPV分型。
研究者可以把所有已报道的高危型HPV都包括进来。
一次反应,多种分型检测。
MJallowetal.NatureGenetics41,657-665(2009)
疟疾一致肆虐非洲,来自冈比亚和牛津大学实验室对2500儿童进行了SGWA分析,验证研究利用了3400例儿童,研究发现疟疾的易感性可能同SNP相关联。
4、法医学研究和应用
SNP在个体识别、人种识别以及外形推断方面具有巨大潜力。
在法医学领域,SNP也越来越受到大家的重视。
第一,SNP大都表现为二等位基因标记,即人群中只有二个等位基因,易于分型和确定基因频率,适于混合样品的分析。
第二,突变率非常低,在父权鉴定中非常有利。
第三,适合高通量技术分析,有利于数据库的建立和实现自动化。
特别有意义的是,由于扩增产物的片段大小对于分析降解检材的成功与否至关重要,SNP基因座的片段更短,识别序列可以为45-55bp,因而引物可以设计得距SNP位点很近,更适合分析降解DNA。
当然,SNP也有一些局限性。
经专家估计要达到与目前所用STR试剂盒一样的识别率,至少要50个SNP位点,sequenom作为一个中等位点通量的检测系统,能够在2到3个反应体系中满足需要。
具有非常好的应用前景。
农业研究和应用
1、在重要经济和品质性状筛选上意义重大。
SNP在农业科技研究和应用中同样意义重大。
许多研究证明农作物的经济性状产量、品质都与SNP相关。
在畜禽养殖上,SNP具有潜在的重要意义,尤其是在筛选重要的经济性状如产蛋量、瘦肉率、产仔量还有提高畜禽的抗病性等都有潜在价值。
尤其是随着测序技术的发展,很多物种的基因组测序都已经或逐步完成。
通过技术改进发现存在的SNP,筛选潜在的具有重要经济性状相关联的SNP逐渐得以实施。
TheBovineHapMapConsortium,theGeneticStructureofCattleBreedsGenome-WideSurveyofSNPVariationUncoversScience2009,324:
528
采用一系列测序技术对497牛的37470个SNP位点进行研究。
显示了牛的起源和区域关系。
2、在转基因植物检测中的运用
转基因植物检测是各国商检、CDC和食品检测单位需要检测的重要专项。
目前,转基因植物的获得都是通过常见的如CAMV、FAMV、nos等启动子所启动的。
常规的转基因植物检测通过PCR、RT-QPCR等手段通过多次反应完成转基因植物检测。
根据sequenomiplex反应原理,可以通过引物设计将各种启动子在同一个PCR反应中实现检测。
实现一管反应监测所有转基因植物。
相关研究和试剂盒正在研发中。