蛋白质纯化的方法选择Word文件下载.docx
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新型的设备将透析膜夹在两个板中间，板的一侧加缓冲液，另一侧加需脱盐的蛋白溶液，并在蛋白溶液一侧通过泵加压，可以使两侧溶液在数小时内达到平衡，若增加对蛋白溶液的压力，还可迫使水分和盐更多通过透析膜进入透析液达到对蛋白浓缩的目的。
也有出售的脱盐柱，柱内的填料是小孔径的颗粒，蛋白分子不能进入孔内，先于高浓度盐离子从柱中流出，从而使二者分离。
蛋白纯化的每一步都会造成目的蛋白的丢失，缓冲液平衡的步骤尤甚。
蛋白会结合在任何它能接触的表面上，剪切力、起泡沫和离子强度的快速变化很容易让蛋白失活。
2．3离子交换色谱这是在所有的蛋白纯化与浓缩方法中最有效方法。
基于蛋白与离子交换树脂间的相互电荷作用，通过选择不同的缓冲液，同一种蛋白既可以和阴离子交换树脂（能结合带负电荷的分子）结合，也可以和阳离子交换树脂结合。
树脂所用的带电基团有四种：
二乙基氨基乙基用于弱的阴离子交换树脂；
羧甲基用于弱的阳离子交换树脂；
季铵用于强阴离子交换树脂；
甲基磺酸酯用于强阳离子交换树脂。
蛋白质由氨基酸组成，氨基酸在不同的pH环境中所带总电荷不同。
大多数蛋白在生理pH（pH6～8）下带负电荷，需用阴离子交换柱纯化，极端的pH下蛋白会变性失活．应尽量避免。
由于在某个特定的pH下不同的蛋白所带电荷数不同，与树脂的结合力也不同，随着缓冲液中盐浓度的增加或pH的变化，蛋白按结合力的强弱被依次洗脱。
在工业化生产中更多地是改变盐浓度而不是去改变pH值，因为前者更容易控制。
在实验室中几乎总是用盐浓度梯度去洗脱离子交换柱，利用泵的辅助可以使流入柱的缓冲液中盐浓度平稳地上升，当离子强度能够中和蛋白的电荷时，蛋白就被从柱上洗脱下来。
但在工业生产中盐浓度很难精确控制，所以常用分步洗脱而不足连续升高的盐梯度。
与排阻层析相比，离子交换特异性更好，有更多的参数可以调整以获得最优的纯化效果，树脂也比较便宜。
值得一提的是，即便是用最精确控制的条件，仅用离子交换单一的方法也得不到纯的蛋白，还需要其他的纯化步骤。
2．4亲和层析亲和层析基于目的蛋白与固相化的配基特异结合而滞留，其他杂蛋白会流过柱子。
本方法存在的问题是：
单抗非常昂贵，而且也需先纯化；
单抗与目的蛋白结合力太强．要用苛刻的条件来洗脱，这会使目的蛋白失活并破坏单抗；
混合物中的其他蛋白如蛋白酶也可能破坏抗体或与它们非特异结合；
某些单抗也会在纯化过程中从树脂上解离下来混入产物中，也需要从终产物中去除。
亲和柱通常在纯化过程的后期应用，此时标本体积已缩小，大部分的杂质已经去除。
谷胱甘肽S-转移酶（GlutathioneS-transferase，GST）是最常用的亲和层析纯化标签之一，带有此标签的重组蛋白可用交联谷胱甘肽的层析介质纯化，但本方法有以下缺点：
首先，蛋白上的GST必须能合适地折叠，形成与谷胱甘肽结合的空间结构才能用此方法纯化；
其次，GST标签多达220个氨基酸，如此大的标签可能会影响表达蛋白的可溶性，使形成包涵体，这会破坏蛋白的天然结构，难于进行结构分析，有时即便纯化后再酶切去除GST标签也不一定能解决问题。
另一种可应用的亲和纯化标签是6组氨酸标签，组氨酸的咪唑侧链可亲和结合镍、锌和钴等金属离子，在中性和弱碱性条件下带组氨酸标签的目的蛋白与镍柱结合，在低pH下用咪唑竞争洗脱。
组氨酸标签与GST相比有许多优点，首先，由于只有6个氨基酸，分子量很小，一般需要酶切去除：
其次，可以在变性条件下纯化蛋白，在高浓度的尿素和胍中仍能保持结合力；
另外6组氨酸标签无免疫原性，重组蛋白可直接用来注射动物，也不影响免疫学分析。
虽然有这么多的优点，但此标签仍有不足，如目的蛋白易形成包涵体、难以溶解、稳定性差及错误折叠等。
镍柱纯化时金属镍离子容易脱落漏出混入蛋白溶液，不但会通过氧化破坏目的蛋白的氨基酸侧链，而且柱子也会非特异吸附蛋白质，影响纯化效果。
若目的蛋白可与某种碳水化合物特异结合，或者需要某种特殊的辅因子，可将该碳水化合物或辅因子固相化制成亲和柱，结合后目的蛋白可用高浓度的碳水化合物或辅因子洗脱。
2．5疏水作用层析蛋白是由疏水性和亲水性氨基酸组成的。
疏水性氨基酸位于蛋白空间结构的中心部位，远离表面的水分子。
亲水性氨基酸残基则位于蛋白表面。
由于亲水性氨基酸吸引了许多的水分子，所以通常情况下整个蛋白分子被水分子包围着，疏水性氨基酸不会暴露在外。
在高盐浓度的环境中蛋白的疏水性区域则会暴露并与疏水性介质表面的疏水性配基结合。
不同的蛋白疏水性不同，与疏水作用力大小也不同，通过逐渐降低缓冲液中盐浓度冲洗柱子，在盐浓度很低时，蛋白恢复自然状态，疏水作用力减弱被洗脱出来。
疏水性树脂的选择性是由疏水性配基的结构决定的，常用的直链配体为烷基配体（alkylligands）和芳基配体（arylligands），链越长结合蛋白的能力也越强。
理想树脂种类的选择应根据目的蛋白的化学性质而定，不能选择结合力太强的树脂，结合力太强的树脂会很难洗脱，所以开始时应选用中等结合力的苯基树脂探讨条件。
为了使选择合适的介质更容易，AmershamBiosciences推出了疏水作用树脂选择试剂盒，里面包括5种不同的树脂供比较。
疏水层析很适合作为离子交换纯化的下一个步骤，因为疏水作用层析在高盐浓度下上样，从离子交换得到的产物不需更换缓冲液即可使用。
蛋白又在低盐缓冲液中洗脱，又省去了下一步纯化前的更换缓冲液的步骤，既节约了时间，又减少了蛋白的丢失。
2．6排阻层析也叫凝胶过滤或分子筛。
排阻层析柱的填充颗粒是多孔的介质，柱中围绕着颗粒所能容纳的液体量叫流动相，也称无效体积。
太大的蛋白不能进入颗粒的孔内，只能存在于无效体积的溶液中，将会最早从柱中洗脱出来，对这部分蛋白无纯化效果。
由于各种蛋白的分子大小不同，扩散进入特定大小孔径颗粒内的能力也各异。
大的蛋白分子会被先洗脱出来，分子越小，洗脱出来的越晚。
为得到最佳的纯化效果，应将孔径大小选在目的蛋白能在无效体积和总柱床体积的中点附近洗脱。
排阻层析有其他方法所不具备的优点，首先所能纯化的蛋白分子量范围宽，TosohBiosep公司的聚合物树脂，排阻极限可达200000kD；
其次，树脂微孔的形状适合分离球形的蛋白质，纯化过程中也不需要能引起蛋白变性的有机溶剂。
应该注意的是某些蛋白不适合用凝胶过滤纯化，因为本技术所用树脂有轻度的亲水性，电荷密度较高的蛋白容易吸附在上面。
排阻层析从不用于纯化过程的早期，因为这种方法要求标本高度浓缩，上样量只能在柱体积的1%～4%之间，柱子要细而长才能得到好的分离效果，树脂本身也比较昂贵，规模化的工业生产中不太适用。
2．7电泳丙烯酰胺凝胶电泳通常用来查看蛋白混合物样品的复杂程度和监测纯化效果。
这种方法分离效果极好，可惜很难在不丧失精度情况下放大到制备规模，因为随着胶厚度的增加，电泳时的热效应会严重干扰蛋白的泳动。
在基础研究中，有时仅需要少量的纯蛋白进行研究，如蛋白质测序等，此时电泳纯化不失为一种简便快速的好方法。
丙烯酰胺凝胶电泳也是蛋白纯化过程中重要的分析工具，可以检测目的蛋白是在哪个梯度的离子交换柱盐洗脱液中；
可用来判定近年来随着各学科的迅猛发展，对蛋白纯化技术的需求不断增长，已有的纯化方法被日益改进，新型的纯化方法也相继涌现。
羟磷灰石是磷酸钙的结晶，由于其理化性质不够稳定，结合能力差，很难用于层析。
近来Bio-Rad公司对其进行了改进，提高了钙和磷的比例，使形成球形、多孔、性质稳定的陶瓷羟磷灰石颗粒，其带正电的钙离子和负电性的磷酸根离子可分别与蛋白的羧基及氨基结合。
通过调整缓冲液的pH值，酸性及碱性氨基酸可选择性地与此树脂结合，改变缓冲液的盐浓度可将蛋白洗脱分离。
资料显示，使用这种方法能使两种等电点、分子量和疏水性相同的蛋白很好分离。
亲和纯化方面，Sigma发展了利用FLAG标签的纯化方法，FLAG序列为N-AspTyrLysAspAspAspAsp-Lys-C，分子量小且亲水性，与其融合表达的蛋白不易形成包涵体，活性也不受影响，用该公司抗FLAG抗体亲和树脂即可纯化目的蛋白。
其他新型标签及相应纯化系统还有CBP（CalmodulinBindingPeptide，CBP）、Promega公司的BCCP（Biofincarboxylcarrierprotein，BCCP）标签和亲和素一生物素纯化系统、麦芽糖结合蛋白（MaltoseBindingProtein，MBP）标签、Biolabs公司的IMPACT-CN系统、Novagen公司的CBD-Tag和，I7-Tag系统等。
相信随着时间的推移，会有更多更好的方法出现，合理充分地应用这些方法，对科研、生物制药、疫苗、诊断试剂研制等工作都会有很大帮助
蛋白质纯化
三．蛋白质的分离纯化
蛋白质在组织或细胞中一般都是以复杂的混合物形式存在，每种类型的细胞都含有成千种不同的蛋白质。
蛋白质的分离和提纯工作是一项艰巨而繁重的任务，到目前为止，还没有一个单独的或一套现成的方法能把任何一种蛋白质从复杂的混合物中提取出来，但对任何一种蛋白质都有可能选择一套适当的分离提纯程序来获取高纯度的制品。
（一）蛋白质分离纯化的一般步骤
1．原料的选择
首先了解所需提纯蛋白的分布，针对性的选择破碎某种组织或细胞的方法，或直接收集原料部分（如血液）。
破碎方法：
匀浆、电动捣碎或超声波破碎方法等。
2．粗分：
蛋白质混和溶液，简单易处理快速方法，除去大部分杂蛋白。
3．精制备：
利用不同蛋白质性质的差异，采用不同的方法，如：
离子交换层析、分子筛、吸附层析、亲和层析、电泳、离心、结晶，以及一些免疫的方法进一步纯化。
（常需要几种方法配合）
大部分蛋白质都可溶于水、稀盐、稀酸或碱溶液，少数与脂类结合的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂中，因此，可采用不同溶剂提取分离和纯化蛋白质及酶，同时仍保留其生物学活性和化学完整性。
注意：
保持中性PH值，适当的温度，近生理状态的缓冲体系，加入适当的酶的抑制剂及金属离子络合剂（EDTA）等。
（二）蛋白质的分离纯化技术
能从成千上万种蛋白质混合物中纯化出一种蛋白质的原因，是不同的蛋白质在它们的许多物理、化学、物理化学和生物学性质有着极大的不同，这些性质是由于蛋白质的氨基酸的序列和数目不同造成的，连接在多肽主链上氨基酸残基可是荷正电的、荷负电的、极性的或非极性的、亲水的或疏水的，此外多肽可折叠成非常确定的二级结构（α螺旋、β折叠和各种转角）、三级结构和四级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况，利用待分离的蛋白质与其它蛋白质之间在性质的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。
根据蛋白质以下几种性质：
溶解度、分子大小、所带电荷、物理吸附性质、和生物学的亲和性等不同设计分离方法。
1．利用溶解度差别的分离方法
（1）溶液PH值的影响
PH值＝蛋白质等电点
蛋白质分子成中性
易积聚和沉淀（溶解度最小）
不易积聚沉淀（溶解度改变）
PH值>
蛋白质等电点
蛋白质分子带负电
PH值<
蛋白质分子带正电
不同蛋白质因组成氨基酸残基种类和数量不同，因此其等电点不同，通过改变溶液PH值，使要分离的蛋白质大部分或全部沉淀或存于溶液中。
（2）某些蛋白质沉淀剂的作用
有些离子型的表面活性剂、生物碱或酸类试剂，可通过改变蛋白质带电性质使其沉淀。
如：
苦味酸（2,4,6-三硝基酚）、钨酸、丹宁酸（鞣酸）、三氯醋酸等含多价离子，能中和蛋白质分子的大部分电荷
复合物
沉淀
静电
（3）溶液中盐离子浓度的影响
低盐浓度的蛋白质溶液
蛋白质的外围聚集了带相反电荷的离子
加强了蛋白质和水的作用
溶解度升高。
这种由于加入中性盐而使蛋白质溶解度增加的现象称盐溶作用。
同时稀盐溶液因盐离子与蛋白质部分结合，具有保护蛋白质不易变性的优点，因此在提取液中加入少量NaCl等中性盐，一般以0.15摩尔/升浓度为宜。
缓冲液常采用0.02-0.05M磷酸盐和碳酸盐等渗盐溶液。
如果盐浓度增加，大量的盐离子可与蛋白质离子竞争溶液中的水分子，从而导致溶液中的水合程度下降，失去水化层的裸露的蛋白质分子易于积聚而沉淀，这种现象称盐析。
蛋白质溶解度受溶液中中性盐离子强度影响
N=ΣCnZn2/2
（C：
离子强度；
Z：
所带电荷）
最多用的中性盐
硫酸胺
硫酸铵分级沉淀法，先用某段的低盐浓度将先行沉淀的杂蛋白去掉，再将盐浓度调到该段高浓度
所需蛋白沉淀。
它的优点是温度系数小而溶解度大（25度时饱和溶液为4.1M，即767克/升；
0度时饱和溶解度为3.9M，即676克/升），在这一溶解度范围内，许多蛋白质和酶都可以盐析出来；
另外硫酸铵分段盐析效果也比其他盐好，不易引起蛋白质变性。
影响盐析的因素有：
（1）温度：
除对温度敏感的蛋白质在低温（4度）操作外，一般可在室温中进行。
一般温度低蛋白质溶解度降低。
但有的蛋白质（如血红蛋白、肌红蛋白、清蛋白）在较高的温度（25度）比0度时溶解度低，更容易盐析。
（2）pH值：
大多数蛋白质在等电点时在浓盐溶液中的溶解度最低。
（3）蛋白质浓度：
蛋白质浓度高时，欲分离的蛋白质常常夹杂着其他蛋白质地一起沉淀出来（共沉现象）。
因此在盐析前血清要加等量生理盐水稀释，使蛋白质含量在2.5-3.0%。
（4）溶剂极性的影响
与水混溶的有机溶剂（常用甲醇、乙醇或丙酮）能减少水和蛋白质间的作用力
使蛋白质脱水。
另外，有机溶剂降低了溶液的介电常数，减弱了蛋白质与水分子间的作用，增强了蛋白质分子间的作用
蛋白质分子易于凝集沉淀。
一些和脂质结合比较牢固或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶，不溶于水、稀盐溶液、稀酸或稀碱中，可用乙醇、丙酮和丁醇等有机溶剂，它们具的一定的亲水性，还有较强的亲脂性、是理想的提脂蛋白的提取液。
但必须在低温下操作。
丁醇提取法对提取一些与脂质结合紧密的蛋白质和酶特别优越，一是因为丁醇亲脂性强，特别是溶解磷脂的能力强；
二是丁醇兼具亲水性，在溶解度范围内（度为10%，40度为6.6%）不会引起酶的变性失活。
另外，丁醇提取法的pH及温度选择范围较广，也适用于动植物及微生物材料。
选用适当的有机溶剂可粗分蛋白质组分.
（5）分配层析：
原理是每种物质在不同的溶剂相中的溶解度不同。
分配系数＝溶质在溶剂A中的浓度/溶质在溶剂B中的浓度
根据不同蛋白质在同种溶剂中的分配系数不同将蛋白质分离开。
可将两种溶剂
有效分配系数＝分配系数*（溶剂A体积/溶剂B体积）
固定相
流动相
2．利用分子大小不同的分离纯化方法
（1）透析：
是利用比较大的蛋白质分子不能穿透半透膜的原理设计的。
透析在纯化中极为常用，可除去盐类（脱盐及置换缓冲液）、有机溶剂、低分子量的抑制剂等。
透析膜的截留分子量为5000左右。
缓冲液的PH、温度4℃.
（2）超过滤：
原理是利用压力使样品溶液通过半透膜，滤过水和其它小分子，使大分子蛋白质留在膜内，从而浓缩了蛋白质并缩短操作时间。
超滤一般用于浓缩和脱色
（3）离心分离置换缓冲液：
分子大小、质量和形状不同，在离心场中表现出不同的行为。
沉降速度法（用于分离沉降系数不同的物质）
沉降平衡法（用于分离密度不同的物质）
利用离心机分离物质
许多酶富集于某一细胞器内，匀浆后离心得得到某一亚细胞成分，使酶富集10~20倍，再对特定的酶进行纯化。
差速离心，分辨率较低，仅适用于粗提或浓缩。
速率区带法，如离心时间太长所有的物质都会沉淀下来，故需选择最佳分离时间，可得到相当纯的亚细胞成分用于进一步纯化，避免了差速离心中大小组分一起沉淀的问题，但容量较小，只能用于少量制备。
等密度梯度离心常用的离主介质有蔗糖、聚蔗糖、氯化铯、溴化钾、碘化钠等等。
（4）凝胶过滤（分子排阻层析或分子筛层析）
这是根据分子大小分离蛋白质混合物最有效的方法之一，注意使要离的蛋白质分子量在凝胶的工作范围内。
选择不同的分子量凝胶可用于脱盐、置换缓冲液及利用分子量的差异除去热源。
洗脱液和洗脱方式：
①加入中性盐
NaCl、KCl、
逐渐提高浓度，置换蛋白质。
洗脱条件
②改变PH值
使蛋白质样品解离度降低
亲和下降
洗脱
③改变离子强度的同时改变PH值
洗脱方式
阶段梯度洗脱
连续梯度洗脱
洗脱可采用保持洗脱剂成分一直不变，也可采用改变洗脱剂的盐度或pH的方法洗脱，后一种可分分段洗脱和梯度洗脱。
梯度洗脱一般效果好，分辨率高，特别是使用交换容量小，对盐浓度敏感的离子交换剂，多用梯度洗脱。
控制洗脱剂的体积（与柱床体体积相比）、盐浓度和pH，样品组分能从离子交换柱上分别洗脱下来。
3、根据蛋白质分子带电性质不同的分离方法
（1）电泳
原理是指在外界电场的作用下，带电物质向其所带电荷的相反电极方向的移动。
影响电泳迁移率的因素：
缓冲液、电场、支持介质
电泳的类型：
按载体介质划分
无介质的自由溶液电泳
有支持介质的电泳：
纸、薄层、凝胶（淀粉、琼脂糖、聚丙烯酰胺）
按电泳支持物形状划分：
U型管、柱状、板状、毛细管状等。
按分离规模分：
分析和制备型。
按电泳形式分：
单向、双向、电泳和层析相结合方式。
按电压分：
高压和常压。
按原理分：
等速电泳、免疫电泳和聚焦电泳等。
a.分析测定蛋白质分子量的常用方法之一——SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳，SDS（十二烷基硫酸钠）是一种阴离子去污剂。
蛋白质电泳迁移率完全取决于它的分子量，数值与分子量的对数呈线形关系。
b.等电聚焦电泳：
主要依赖两性电解质载体。
应用广泛
氨基酸分析
蛋白质高效分离
DNA酶切片段等分析鉴定
c.毛细管电泳：
A.毛细管自由溶液区带电泳钠（CZE）
B.毛细管凝胶电泳（CGE）
C.毛细管等电聚焦电泳（CIEF）
D.胶束毛细管电动力学色谱（MECC）
（2）离子交换层析
原理：
离子交换剂以一种不溶的惰性物质为支持物，通过化学反应（酯化、氧化和醚化等）共价引入带电基团。
根据蛋白质电荷性质不同分离蛋白质。
纤维素
葡萄糖凝胶
离子交换剂的类型
化学合成的树脂类
天然的大分子产物经加工制成
常用EDTA等阴离子交换树脂——CH2CH2N+H（CH2CH3）2
CM等阳离子交换树脂
——CH2COO-
4．根据蛋白质吸附性质不同的分离方法
利用不同蛋白质被吸附剂吸附的强弱不同，在洗脱中吸附弱的物质先被洗脱，强的后被洗脱的特点，可达到分离的目的。
吸附剂
有机吸附剂：
氧化铝、硅胶、活性炭和羟基磷灰石等。
无机吸附剂：
淀粉、聚酰胺凝胶和纤维素
多用于薄层层析
5．利用蛋白质的特异性配体分离方法——亲和层析
根据有些生物大分子具有生物学的特异性，可以和相应的物质特异而可逆的结合，后者成为配体（多数也是生物大分子）
介质：
凝胶过滤的介质大都适合于亲和层析（最多是琼脂糖凝胶）
应用：
抗原和抗体、激素和受体、酶和底物、产物、抑制剂、辅酶基因与互补核酸和阻遏蛋白相互作用等。
具有结合效率高，分离速度快的特点。
吸附后可改变缓冲液的离子强度和PH的方法洗脱下来，也可用更高浓度的同一配体溶液或亲和力更强的配体溶液洗脱
亲和层析除特异性的吸附外，仍然会因分子的错误认别和分子间非选择性的作用力而吸附一些杂蛋白质，另洗脱过程中的配体不可避免的脱落进入分离体系。
（1）金属螯合介质
过渡金属离子Cu2＋、Zn2＋和Ni2＋等以亚胺络合物的形式键合到因定相上，由于这些金属离子与色氨酸、组氨酸和半胱氨酸之间形成了配价键，从而形成了亚胺金属—蛋白螯合物，使含有这些氨基酸的蛋白被这种金属螯合亲和色谱的固定相吸附。
螯合物的稳定性受单个组氨酸和半胱氨酸解离常数所控制，从而亦受流动相的pH和温度的影响，控制条件可以使不同蛋白质相互分离。
（2）小配体亲和介质
配体有精氨酸、苯甲酰胺、钙调因子、明胶、肝素和赖氨酸等等。
（3）抗体亲和介质
即免疫
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