耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育Word文件下载.docx

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用，并可为乳制品发酵生产提供优良发酵菌种，为乳

酸菌微胶囊、乳酸杆菌冻干粉等益生菌制剂的生产或

摄生生物食品提供优质菌种。

1材料与方法

1.1菌株和培养基

嗜酸乳杆菌（Lactobacillusacidophilus）购自中国

工业微生物菌种保藏管理中心。

培养于MRS培养基。

筛选使用的选择培养基在MRS液体培养基中添加

0.3%的牛胆盐。

1.2生长曲线的测定

[8]

将活化好的菌种按5%（体积比）接种量接种

MRS液体培养基中，37℃恒温静置培养。

每隔2小时

取样在600nm波长下测定OD值，以时间为横坐标，

OD

600

值为纵坐标，绘制嗜酸乳杆菌的生长曲线。

1.3耐胆盐能力的测定

取活化好的嗜酸乳杆菌（OD

0.65左右）培养液

1mL，3000r/min离心收集菌体，并用生理盐水洗涤两

次，漩涡振荡制成1mL菌悬液，分装成2管，离心收集

菌体。

一管加入1mL选择培养基，另一管加入1mL

MRS培养基，振荡均匀后37℃静置培养，分别在培养

1.5、2.0、2.5h时，进行菌落计数，计算存活率。

存活率=

用选择培养基处理后长出的菌落数

未处理的菌落数

×

100%

1.4紫外诱变

[9-10]

紫外灯照射前，先开灯预热20min～30min。

吸取

1mL菌悬液到培养皿中，开盖于紫外诱变箱中，20W

紫外灯下，通过改变菌液稀释倍数、照射时间和照射

距离（紫外灯管到培养皿的垂直距离）来控制致死率。

诱变结束后向培养皿中倒入45℃～50℃MRS固体培

养基，摇匀，凝固后用牛皮纸包好，整个操作过程需在

黑暗红灯下操作，37℃避光培养3d，计算致死率。

致死率=

N

-N

式中：

为照射时间为0s的培养皿上再生的单

个菌落数；

N为诱变后培养皿再生出的单个菌落数。

1.5紫外诱变参数的确定

先进行单因素试验，确定紫外照射时间、照射距

离及菌液稀释倍数对致死率的影响，在此基础上进行

三因素三水平正交试验，以致死率（90%左右）为指标

确定其最佳诱变条件。

1.6耐胆盐突变菌株的筛选

诱变结束后向培养皿中倒入45℃～50℃MRS固

体培养基，摇匀，凝固后用牛皮纸包好，37℃避光培养

3d，在培养皿中挑选黄色的生长快的菌落，将其编号

Abstract：

ThestudywasdesignedtoenhancetheacidandbilesalttolerantabilityofLactobacillusacidophilus

byUVmutation.Parameterswithalethalrate90.5%forUVmutationdeterminedbyorthogonaltestwere20W

UV，bacteriawasdilutedtoaroundOD

0.65，illuminateatadistanceof30.5cmfor60s.Themutantwas

screenedontheselectivemediumwithasimulatedhumanintestinalbilesaltconcentrationof0.3%andpH=2.

Cellcountingwascarriedoutafterincubationfordifferentperiods.L.a.abrwasscreenedoutthatwithan

enhancedabilitytotoleratehighbilesaltconcentrationwithasurvivalrateof19.57%，10.87%and4.78%

afterincubatedfor1.5h，2.0hand2.5hrespectively，whileunderthesamesituation，thestarterbacteriawas

3.68%，1%and0.23%.

Keywords：

Lactobacillusacidophilus；

UVmutation；

bilesalttolerantability

帖金鑫，等：

耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的紫外诱变选育生物工程

112并做菌种保藏。

将各菌株接种于MRS液体培养基中，

取OD

为0.65左右的培养液，测定各菌株耐胆盐能

力（方法同1.3），并将其与出发菌株进行比较，从中筛

选出耐胆盐能力较强的菌株，命名并保存。

1.7诱变菌株遗传稳定性检验

将诱变菌株接种于MRS液体培养基中于37℃培

养箱中连续传代发酵5代，每次传代都要进行耐酸、耐

胆盐能力的测定。

2结果与分析

2.1嗜酸乳杆菌的生长曲线

嗜酸乳杆菌的生长曲线见图1。

由图1可以看出，嗜酸乳杆菌在MRS液体培养基

中经过一个较短的延迟期后进入对数生长期。

由于培

养基中营养物质减少，嗜酸乳杆菌在培养16h以后进

入平衡期，菌体浓度基本保持不变，因此宜选用培养

8h~12h时间段的嗜酸乳杆菌菌体制成菌悬液，进行

诱变处理。

2.2照射时间对致死率的影响

照射时间对致死率的影响见图2。

从图2可知，当菌液稀释倍数为10

7

、照射距离为

26.5cm时，随着照射时间的推移，UV对嗜酸乳杆菌的

致死率迅速增加，在照射第30秒时，82%的嗜酸乳杆

菌已经死亡。

60s时菌株的致死率均为90%。

60s后，

菌体急剧死亡，当达到90s时致死率达到最大，已为

99%。

2.3照射距离对致死率的影响

照射距离对致死率的影响如图3所示。

由图3可知，当菌液稀释倍数为10

、照射时间为

30s时，随着照射距离的缩短嗜酸乳杆菌和保加利亚

乳杆菌的致死率大大提高，当照射距离为18.5cm时，

菌株的致死率达到了90%以上。

由图3还可知，确定

诱变的最佳照射距离为26.5cm，嗜酸乳杆菌的致死率

为75%。

2.4菌液稀释倍数对致死率的影响

菌液稀释倍数对致死率的影响，见图4。

从图4可知，紫外照射时间为30s、照射距离为

26.5cm时，稀释倍数对嗜酸乳杆菌的致死率影响不

大，考虑到稀释倍数过大或过小对计算致死率所带来

的不便，确定诱变的最佳稀释倍数为10

此时，嗜酸乳

杆菌的致死率为74.3%。

近年来研究表明，致死率在80%～90%左右时的

突变一般为正向突变。

因此对嗜酸乳杆菌紫外诱变选

择了在20W的紫外灯下，诱变稀释倍数为10

6

，紫外

灯照射时间为60s，照射距离为30.5cm的诱变条件

（此时致死率为92.5%）。

李小平在高降胆固醇嗜酸乳

杆菌的紫外诱变选育一文的研究结果基本相同，其致

死率为90.5%

[11]

图1嗜酸乳杆菌的生长曲线

Fig.1ThecurveofLactobacillusacidophilusgrowth

1.2

1.0

0.8

0.6

0.4

0.2

O

D

02420

培养时间/h

681012141618

图2紫外诱变致死曲线

Fig.2DeathcurveofUVirradiation

100

98

96

94

92

90

88

86

84

82

80

致

死

率

/

%

30120

照射时间/s

6090

图3照射距离对致死率的影响

Fig.3Effectofirraditondistanceomfatalityrate

95

85

75

70

65

60

30.518.5

照射距离/cm

26.522.5

图4菌液稀释倍数对致死率的影响

Fig.4Effectofbacteriumconcentrationonfatalityrate

78

76

74

72

68

1100

稀释倍数（/×

10

）

生物工程帖金鑫，等：

1132.5耐酸耐胆盐嗜酸乳杆菌的筛选

2.5.1耐酸嗜酸乳杆菌的筛选

嗜酸乳杆菌出发菌株及各诱变菌株在pH为2的

选择性培养基中培养不同时间后存活菌数结果如表1

所示，各菌株的存活率情况如图5所示。

由表1可知，嗜酸乳杆菌，在处理1.5h后，对于

A0、A1和A3活菌数仅降低了一个指数级，而A4菌

株仍保持在10

8

处理2h时，A0A1和A4活菌数比

1.5h时降低了一个指数级，而A2和A3保持不变。

处

理2.5h时，A1和A2与A0保持在同一指数级10

，而

A3、A4是10

可以初步判断，A4的耐酸能力最强。

从图5可知A2菌株发生了负突变；

A1、A3、A4的

耐酸性均强于出发菌株A0，耐酸能力A4＞A3＞A1，A4

处理1.5h时其存活率为52.17%，而出发菌株A0仅

为4.78%，处理2.0h时A4菌株存活率为26.52%是

出发菌株（2.17%）的12.22倍，处理2.5h时的存活率

为16.09%是出发菌株（1.30%）的12.38倍。

经SAS软

件统计分析，与出发菌株相比，A2发生了显著的负

突变；

A1菌株与A0菌株差异不显著；

A3、A4菌株

的耐酸性极显著地高于出发菌株，并且A4极显著地

高于A3菌株。

取A3、A4做菌种保藏，并将A4用于后

续研究。

2.5.2耐胆盐嗜酸乳杆菌的筛选

L.acidophilus在模拟人肠道胆汁盐浓度（0.3%）的

选择性培养基中处理不同时间后的活菌计数结果（表

2）可以初步判断：

诱变得到的嗜酸乳杆菌A2、A3、A4

菌株较出发菌株A0的耐胆盐能力都有所增强，其中

A4耐胆盐能力增加幅度最大，其在不同处理时间后的

活菌数都比其它菌株多。

综合分析可知L.acidophilus在模拟人肠道胆汁盐

浓度（0.3%）pH为2的选择性培养基中处理不同时间

后的活菌计数，诱变得到的嗜酸乳杆菌菌株较出发菌

株A0的耐胆盐能力都有所增强，其中A4耐胆盐能力

增加幅度最大，其在不同处理时间后的活菌数都比其

它菌株多，由图5可以看出，A4菌株的耐胆盐能力最

强，在胆盐浓度0.3%的选择培养基上处理1.5h时，

它的存活率（19.57%）是出发菌株A0（3.68%）的5.32

倍；

处理2.0h时，它的存活率（10.87%）是出发菌株

A0（1%）的10.87倍；

处理2.5h时，它的存活率（4.78%）

是出发菌株A0（0.23%）的20.78倍。

A4菌株在处理

2.5h后的存活率甚至比出发菌株处理1.5h的存活率

还要高。

经SAS软件统计分析，嗜酸乳杆菌A4在胆盐

浓度0.3%的选择培养基中处理2.5h时其耐胆盐能力

处理时间/h

嗜酸乳杆菌菌落数（平均值±

标准误）（/CFU/mL）

A0A1A2A3A4

0（2.20±

0.12）×

（2.30±

0.08）×

0.15）×

（2.20±

0.21）×

0.14）×

1.5（8.10±

0.10）×

（8.50±

0.20）×

（1.50±

5

（2.50±

（4.50±

2.0（2.20±

0.09）×

（3.10±

（7.60±

4

（1.10±

0.11）×

2.5（5.00±

0.30）×

（1.00±

（7.50±

表2嗜酸乳杆菌在胆盐浓度0.3%的选择培养基上不同处理时间后的活菌数

Table2ThenumberofsurvivedL.acidophilusinselectivemediumcontaining0.3%bilesaltatdifferentintervals

55

50

45

40

35

30

25

20

15

存

活

A0A4

菌株编号

A1A2A3

2.5h

2.0h

1.5h

图5嗜酸乳杆菌在pH=2的选择培养基中不同处理时间后的存活率

Fig.5SurvivalratesofLactobacillusacidophilusculturedin

selectivemedium（pH2）atdifferentintervals

0（2.31±

（2.10±

0.23）×

0.45）×

（2.40±

0.47）×

0.05）×

1.5（1.12±

0.03）×

（6.50±

0.41）×

（1.20±

0.06）×

2.0（5.01±

（7.10±

（1.60±

0.31）×

（4.60±

0.27）×

（6.10±

0.19）×

2.5（3.02±

（3.50±

（3.70±

表1嗜酸乳杆菌在pH2的选择培养基中不同处理时间后的活菌数

Table1ThenumberofsurvivedLactobacillusacidophilusculturedinselectivemedium（pH=2）atdifferentintervals

注：

A0为出发菌株，A1、A2、A3、A4为诱变后存活下来的菌株。

114图6嗜酸乳杆菌不同处理时间后存活率

Fig.6ThesurvivalrateofL.acidophilusatdifferentintervals

A1A3

与A0、A1、A3相比，差异极显著，将A4命名为L.a.abr。

2.6L.a.abr的遗传稳定性

将诱变筛选所得诱变菌株L.a.abr，连续传代培养

5代，每次传代都要在pH为2以及含0.3%胆盐的选

择性培养基中处理2.5h测定其耐酸及耐胆盐能力，结

果如图7。

由图7可以看出，筛选得到的耐酸耐胆盐突变菌

株遗传稳定性较好，不容易发生退化。

表明L.a.abr耐

胆盐能力基本保持稳定，为后续的研究以及作为新的

出发菌株提供稳定的基础。

3讨论

L.a.abr是一株耐酸耐胆盐的嗜酸乳杆菌。

在含

pH为2以及0.3%胆盐的选择性培养基中培养1.5、

2.0、2.5h时的存活率分别为19.57%、10.87%、4.78%，而

L.a的存活率分别为3.68%、1%、0.23%。

由此可见对

于嗜酸乳杆菌，紫外诱变是一种有效的育种手段，通

过紫外诱变，可使其耐胆盐能力显著提高。

人体消化道正常pH范围为2~8，正常胆汁盐浓

度为0.35%~0.5%。

本实验选择性培养基的胆盐浓度

为0.3%pH为2，在确保通过胃的同时更好地模拟了

人体十二指肠的高胆盐环境。

赵瑞香采用MRS培养

基，模拟人体高胆汁盐环境对嗜酸乳杆菌的抗性进行

了研究。

结果表明，在0.3%胆汁盐条件下培养，活菌

数10

CFU/mL以上

[12]

，而L.a.abr在同等条件下的活菌

数可达10

以上，说明经过诱变的菌种其耐胆盐能力

明显增强。

一般来讲，胃肠道来源乳杆菌对酸的耐受

能力高于对胆盐的耐受能力，肠道来源的乳杆菌对胆

盐的耐受能力高于胃来源的乳杆菌对胆盐的耐受能

力。

大多数人胃肠道源乳杆菌对酸和胆盐的耐受能力

均不强，对酸的耐受性普遍强于对胆盐的耐受性

[13]

实

验证明，而L.a在pH为2的培养基中处理2.5h后的

存活率为1.30%；

筛选出的L.a.abr在2.5h时的存活

率为16.09%，是L.a的12.38倍。

由此可见，L.a.abr的

耐酸耐胆盐能力比出发菌株都大幅增强，可更好的发

挥益生作用。

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（1）:

19

收稿日期：

2012-11-26

图7嗜酸乳杆菌L.a.abr耐酸耐胆盐能力的遗传稳定性

Fig.7Hereditarystabilityofacidandbilesalttoleranceability

ofLactobacillusacidophilusstrainL.a.abr

18

16

14

12

2

F1F5

传代次数

F2F3F4

胆盐耐受性

耐酸性

115标回收率为97.78%~100.29%，RSD