食品微生物学实验指导新国标Word文档格式.docx

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（一）机械裝置部分：

1）镜座：

是显微镜的支架，由底座和镜臂组成。

2）载物台：

又称镜台，用于安放载玻片，其上安有玻片夹和玻片移动器，调节移动器上的螺旋可使载玻片前后左右移动。

镜台中央有一孔，称通光孔，可使反光镜上的光反射到物镜中来。

3）镜筒：

是空心的园筒，长度为160mm，用于调整显微镜的长度和总的放大倍数，其上端连接目镜，下端连接转换器。

4）转换器：

其上安装三个物镜，镜检时旋转转换器即可换物镜头。

注意转换物镜时。

必须用手按住园盘旋转，勿用手指直接推动物镜，以免使物镜与转换器之间的螺纹松脱而损坏显微镜。

5）调焦裝置：

包括粗细调焦旋钮，是调节镜筒上下移动的裝置。

（二）光学系统部分：

1）物镜：

又称为镜头。

有三个物镜头，二个干燥系物镜，一个油系物镜。

物镜上标有主要参数，其含意是：

例如：

上排100/1.25是放大倍数为100倍，数值口径为1.25，下排160/0.17是指镜筒长为160mm，盖玻片的厚度小于0.17mm。

它是显微镜的最重要的部分。

普通显微镜接物镜的工作原理

2）目镜：

供眼睛观察物像用的，它将物镜放大的物像再放大，配有三个目镜，其上标有放大倍数。

显微镜的总放大倍数是目镜放大倍数与物镜放大倍数的乘积.

3）聚光器：

起聚集光线的作用，它可上下移动以调节最适光度。

其下方安装有可变光圈,用以调节光的强度。

4）反光镜：

安装在镜座上。

它是一个有平凹两个面的双面镜。

其作用是采集外来光线，并且送入聚光器，一般采集自然光时用平面镜，采集人工光源时用凹面镜。

三、实验仪器及试剂：

双目显微镜、二甲苯、苯酚、擦镜纸、固定片等

四、实验方法及步骤：

一）显微镜的使用方法：

1、准备工作：

取出显微镜时，应一手握镜臂,一手托镜座，轻拿轻放，切忌碰撞和猛震。

显微镜应放在离桌边60mm左右的位置。

再将登子的高低调节好，不得将显微镜倾斜。

2、采光：

将低倍镜与镜筒调节成一条直线，用双眼向下看，同时调节电光源。

直至全视野有均匀的明亮度，效果最佳为至。

也可同时调节聚光镜和光圈。

3、放置标本：

下降载物台，将标本片放在载物台上，用玻片夹夹住，把标本移动至中央孔的位置。

4、调焦：

眼睛看着低倍镜头，缓慢转动粗调旋钮，使低倍物镜头下端接近于玻片。

再用左眼看目镜，慢慢调节粗调旋钮载物台下降（此时切勿向上调节，以防损坏物镜头），当看到模糊物像时，再转动细调旋钮，直至看到清晰图像为止。

5、转高倍镜观察：

用手按住转换器，慢慢地旋转，当听到“咔嚓”一声即表明物镜已转到正确位置上，再稍微调节一下细调旋钮就可看到清晰图像。

这是因为显微镜的成套物镜设计为共焦点。

二）显微镜的保养：

1、下降载物台，取下玻片。

2、清洁镜筒，用擦镜纸擦净用过的物镜和目镜，如发现擦不净时，用擦镜纸沾少许二甲苯擦净，最后用干净的擦镜纸擦去残余的二甲苯，放入镜头盒内收好。

3、清洁：

擦净显微镜的其它部位。

4、将显微镜的物镜转成八字形，缓慢下降载物台，聚光镜降至最低位置、关闭光圈及将调压开关至最低后关闭电源，拔下插座，盖上防尘罩，做好使用登记。

五、实验结果记录：

绘出你所看到的标本图，并注明菌名、菌各部位名称及放大倍数。

六、实验结果分析及问题讨论：

实验二微生物培养基的配制及灭菌

1、学习培养基的配制方法。

2、掌握高压蒸汽灭菌的原理和方法。

二、培养基的配制：

培养基是人工配制的适合于微生物生长繁殖或积累代谢产物的营养基质。

其中含有碳源，氮源，无机盐，生长因子和水等。

并且要根据微生物的需求调节其酸碱度及培养基的状态。

所以学习培养基的配制是很重要的环节。

三、实验仪器及培养基：

1、培养基及试剂：

营养琼脂、马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、马铃薯、蔗糖、葡萄糖、琼脂粉、苯酚等

2、器材及耗材：

高压蒸汽灭菌锅、恒温培养箱、恒温干燥箱、电炉、电子天平、250mL、100mL烧杯、试管、250mL三角瓶、漏斗、棉花、量筒、玻棒、10mL移液管、粗棉线、园塑料篓，产气管等

一）其主要步骤是：

玻璃仪器的清洗及干燥→制做棉塞→配制液体培养基（加凝固剂配制成固态培养基）→调节酸碱度→过滤、灌装及包扎→灭菌→检验。

下面介绍重要的几步操作。

1、制做棉塞：

试管和三角瓶都需要做合适的棉塞，棉塞可起过滤作用，避免空气中的微生物进入容器内。

所用的棉花应是透气性很好的新鲜衣棉。

制做棉塞时，要求棉花紧贴玻璃壁，没有邹纹和缝隙，松紧适宜。

过紧易挤破管口和不易塞入，过松易掉落和污染。

棉塞的长度约为管口直径的2～3倍，棉塞应有2/3塞进管内（见下图）。

2、配制液体培养基：

培养基应先配制成液态的。

按配方准确称出各种原料，用总量的1/2～1/3的水将原料溶解，难溶的可稍加热溶解。

3、配制固态培养基：

按配方称好凝固剂，用少量水调成糊状，待液态培养基煮沸后，离开电炉将糊状的凝固剂倒入内混匀，并且补足配方所需的水，再加热煮沸。

4、调节酸碱度：

培养基的酸碱度可用精密试纸或酸度计来测量。

调节时可用5％氢氧化钠或5％盐酸进行调节酸碱度，调节时要特别注意避免过头再回调，因为这样容易影响培养基的体积和渗透压。

最后检查总体积是否足量，少了补充水份，多了稍加热蒸发水份。

5、过滤分裝：

若有杂质或固形物，用两层纱布趁热过滤（气温低要保温过滤）。

分裝时加入试管的量为试管长度的1/5～1/4.锥形瓶约为容积的1/3～1/2。

分裝时不得使培养基沾污瓶口及试管口，以免浸湿棉塞，造成污染。

（见下图）

6、加棉塞：

培养基分装后，将做好的棉塞塞好，再包上一层防潮纸，用绵绳系好。

在防潮纸上标明培养基的名称、制备组和姓名、日期等。

准备灭菌。

7、灭菌：

采用高压蒸汽灭菌：

灭菌是指杀死一定环境中的所有微生物。

高压蒸汽灭菌是湿热灭菌的一种。

其原理是通过加热使微生物体内的蛋白

质凝固变性，达到杀菌的目的。

蒸汽灭菌的优点是蒸汽穿透力强，使蛋白质易于凝固变性，另外灭菌过程中产生的蒸汽凝固在物体的表面，同时放出大量的潜热，这种潜热能迅速提高灭菌物体的温度，缩短灭菌的全过程。

是灭菌效果最好的一种方法。

其操作过程如下：

（1）在灭菌锅内加适量的水，再把用灭菌的物品放入锅内，盖上锅盖，对称地拧紧螺栓，以防漏气。

（2）灭菌锅开始加热，同时打开排气阀，待将锅内冷空气完全排净后排气阀内有热气排出3～5分钟后将排气阀关闭。

至压力表升至压力为0.1MPa或温度为121℃时开始计时。

通过调节电源或调节排气阀维持一定的压力（温度）。

达到灭菌时间后（20分钟）停止加热。

（在灭菌过程中应保持恒温恒压）

（3）待压力表降至0位后，再打开排气阀，打开锅取出灭菌物品。

如试管要制成斜面时，待试管温度降到50℃～60℃时再摆成斜面，过早会产生较多的冷凝水。

（4）最后将锅内的水倒出，以防生锈。

8、检验：

检验的目的是检查配制的培养基灭菌是否彻底。

将灭菌后的培养基置于37℃恒温箱中保养24～48小时，若无菌生长，证明灭菌彻底，可保存备用。

二）实验步骤：

1）营养琼脂（用于一般细菌培养）：

确定所需配制营养琼脂的体积YmL，然后确定称取Xg营养琼脂。

用量筒量取80％蒸馏水于烧杯中，在电炉上煮沸，将烧杯拿下。

其余的20％蒸馏水，先将少量蒸馏水将营养琼脂搅成糊状后转入煮沸的蒸馏水中，然后继续加热至煮沸（加入营养琼脂后一定要搅拌至煮沸），然后补足至YmL，调好pH后。

分装至试管（锥形瓶）塞好棉塞包扎后于121℃20分钟高压灭菌。

如是试管,待培养基温度降至50℃～60℃后摆成斜面.冷却后取2～3支置于37℃恒温培养1～2天，确定无菌后方可使用。

（具体要求见试剂标签）

2）马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）（用于霉菌，酵母菌培养计数）

称取Xg马铃薯葡萄糖琼脂。

其余操作同上。

3）配制马铃薯液体培养基：

马铃薯200g蔗糖20g水1000mL自然pH，121℃，灭菌20分钟

制法：

马铃薯去皮，切成块煮沸30分钟，然后纱布过滤，再加糖，熔化后补充至1000mL。

吸取10mL装入带有产气管的18×

180mm的试管中。

121℃，灭菌20分钟

五、实验结果记录：

1、所配制培养基的名称及灭菌参数。

2、将冷却的培养基于37℃恒温培养24～48小时后，检验所配培养基是否灭菌彻底。

六、实验结果分析及问题讨论：

实验三酵母菌形态观察及微生物液体接种技术

1、通过观察了解酵母菌的形态结构。

2、掌握微生物液体接种培养技术。

3、掌握无菌操作技术及学会观察接种培养的结果。

二、实验原理：

酵母菌是单细胞的真菌,细胞较大,不必染色即可用显微镜观察其形态.特别是出芽生殖时的芽体形态.

在微生物的研究工作中,为了使微生物不断延续其生命需一次次地将接种到新的培养基中让其繁殖.接种操作决不允许不需要的微生物进入培养基造成污染.将污染降低到最低限度的接种技术称为无菌操作技术.这次实验学习在无菌操作条件下,用接种环或滴管等工具将菌种接到液体培养基中,再进行培养的操作技术。

三、实验材料及器材：

1、菌种：

马铃薯琼脂斜面培养18～24小时的酵母菌

2、培养基及试剂:

马铃薯液体培养基、马铃薯固体培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚等

3、器材及耗材：

双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、产气管、滴瓶、圆塑料篓、塑料篓、浆糊等

1、微生物液体产气培养实验前的准备：

做好试管棉塞，于试管内放入小产气管（发酵管），小产气管管口朝下，再加入10毫升麦芽汁液体培养基，贴上标签，写好班次和学号，于121℃下高压蒸汽灭菌20分钟，冷却后备用（每人二支）。

2、由固体斜面菌种接到液体培养基的无菌接种技术

①点燃酒精灯，在酒精灯的上方将试管棉塞旋松（切勿将棉塞拔出），以便接种时易入拔出。

②左手握二支试管，外则为固体斜面菌种管，内则为液体待接种试管，液体管的管口向上倾斜，以防液体培养基流出。

③右手拿接种环，在火焰中将接种环烧红灭菌；

再用右手小拇指和无名指夹住棉塞（绝对不许将棉塞放在桌上），将试管上半部在火焰上方通过两三次后，停在火焰上方；

把烧红的接种环伸入菌种试管内，先与试管壁接触一会使之冷却，再移至斜面挑取一环酵母菌，接入液体培养基中，搅拌一下取出。

④接种完后将试管口在火焰中通过几次，在塞上棉塞放于试管架上。

⑤将接种环在火焰上烧红，以杀死残余的菌。

⑥培养：

检查试管的棉塞是否塞紧，标签上的字是否清楚。

然后置于28℃恒温箱中培养24～48小时。

3、酵母菌产气结果观察：

观察小试管中是否有气泡产生及感官检验。

4、酵母菌形态的观察：

①制片：

取洁净的玻片一块，在其中央滴一小滴无菌水，用接种环以无菌操作的方式从固体斜面上挑取少量的酵母菌，与载玻片上的水滴混匀，涂成一薄层；

取干净盖玻片一块，小心地将盖玻片一端与菌液接触，然后缓慢地将盖玻片放下，用手轻轻地压一下将气泡压去，再用滤纸吸去多余的菌液。

②显微镜观察:

将制好的酵母菌片置于显微镜下，先用低倍镜找到酵母菌，再转入高倍镜下仔细观察酵母菌的整体形态，出芽酵母菌的形态，菌体内的液泡及内含物.将光圈调小还可看到酵母菌体外的荚膜物质。

③绘制出你所看到的酵母菌形态结构图，要注明放大倍数及各部分的名称。

1、酵母菌形态的观察结果记录：

绘出你所看到的标本图，并注明菌名、各部位名称及放大倍数。

2、记录酵母菌液体接种结果及结论。

实验四微生物的死活鉴别及固体培养接种技术

1、掌握鉴别酵母菌死活的染色原理和操作方法。

2、掌握无菌操作技术及微生物固体接种培养技术。

3、学会观察接种培养的结果。

用稀释美兰染液可进行酵母菌死活的鉴别。

美兰是一种弱氧化剂，氧化态时为兰色，还原态时呈无色。

被染成兰色的为死菌，无色的为活菌。

这是因为活细胞新陈代谢旺盛，具有还原能力，染液进入细胞后即被还原成无色，而死细胞无还原能力。

但染液浓度过高或染色时间过久，超出了活细胞的承受能力，会使菌体死亡，从而影响实验结果的。

三、实验材料和器材：

1、菌种：

2、培养基及试剂：

马铃薯液体培养基、马铃薯固体培养基、二甲苯、95％乙醇、0.1%美兰染液、苯酚等

双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓、浆糊等

1、固体斜面接种方法（见下图）：

在酒精灯下无菌操作，将

接种环伸入待接试管斜面的基部，缓慢地走之字图形地接种，然后放入28℃恒温培养箱中培养24～48小时。

2、酵母菌固体接种培养结果观察:

：

（包括菌落形状,色泽，质地，气味，透明度等）。

3、酵母菌的死活鉴别：

先滴一滴0.1%美兰染液于干净的载玻片中央，无菌操作取一环酵母菌与0.1%美兰染液混合均匀，染色30秒～1分钟盖上盖玻片，用滤纸吸掉多余的染色液，镜检。

1、记录酵母菌死活鉴别结果并解释原因。

2、记录酵母菌固体接种结果。

实验五利用血球计数板的微生物计数法

学习利用血球计数板对微生物进行计数的原理和方法。

利用血球计数板在显微镜下直接计数，是一种常用的微生物计数方法。

此法是将单细胞微生物的菌悬液或孢子悬液，注入血球计数板与盖玻片之间的计数室中，在显微镜下在进行计数的。

由于计数室的容积是一定的，所以可根据显微镜下观察的微生物的数量计算出单位体积内的微生物总数。

血球计数扳的构造

a.平面图（中间平台分为两半，各刻有一个方格网）

b.侧面图（中间平台与盖玻片之间有高度为0.1mm的间隙）

血球计数板计数网的分区和分格

血球计数板的计数室如下图所示，其中央为计数室，通常有两种规格25×

16型或16×

25型.常用的为25×

16型，其长和宽各为1mm，盖上盖玻片后，其间的距离为0.1mm，因此计数室的容积为0.1立方毫米。

细胞数（CFU/mL）=50000×

A×

B

式中：

A－5个中方格中细胞总数

B－菌液的稀释倍数

三、实验材料和器材:

1、菌种:

固体斜面培养18～24小时酵母菌

马铃薯固体培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚等

3、器材及耗材:

双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、血球计数板、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、圆塑料篓、长塑料篓、血红蛋白吸管、10mL塑料离心管等

四、实验方法及步骤:

1、酵母菌菌悬液的计数和酵母菌菌悬液中出芽率的计数:

取一块干净的血球计数板,在显微镜下用低倍镜找到中

央计数室。

上升镜筒,将盖玻片盖在计数室上。

②用吸管吸取酵母菌菌悬液（先将菌液摇匀一下）,将滴管在血球计数板和盖玻片之间的缝隙间靠一下,菌悬液即被吸入计数室内,用手轻压盖玻片,以免溶液过多而改变了计数室的体积,用滤纸吸取多余的菌液,静止一会,让菌体自然沉降并且稳定下来。

③计数:

分别统计五个中方格的酵母菌的数量和出芽的酵母菌数量.应取计数室对角线上的五个中方格或取计数室右上,右下,左上,左下,中央的五个中方格.压线的菌以取上不取下,取左不取右的菌计数.

④计完后取下盖玻片,用蒸馏水洗净血球计数板,用滤纸吸干净水份后,盖上干净的盖玻片,再滴菌液,于显微镜下重复计数三次。

五、实验结果记录及计算:

1、计数。

测定次数

中

方菌

格

编数

号

第一次

第二次

酵母菌

出芽

2

出芽

3

5

五个中方格的总菌数

2、计算:

每毫升菌液中含酵母菌的CFU（采用两位有效数字，及10的指数表示）。

4、计算:

每毫升菌液中含出芽的酵母菌的个数（同上）及出芽率。

实验六微生物大小的测量

了解测微尺的构造和原理，学习接目测微尺的校正方法及微生物大小的测定。

微生物细胞的大小是微生物形态特征之一。

也是分类鉴定的依据之一。

其大小的测量是在显微镜下用接目测微尺来测量。

由于在目镜中观测到的是显微镜放大后的物像，又因为放大倍数不同时，目镜测微尺每格实际代表的长度也随之变化，因此目镜测微尺在使用前必须用标准物镜尺进行校正。

接目测微尺是一块圆形玻璃片,其中央尺等分成100格。

物镜测微尺又称标准尺，是一块中央刻有精确刻度的载玻片，放在载物台上使用的，专用于校正接目测微尺。

常用的是0.01mm物镜测微尺。

是将长1毫米的直线等分成100个小格，每格长度即为0.01mm（10微米）。

三、实验材料和器皿：

固体斜面培养18～24小时酵母菌。

马铃薯固体培养基、二甲苯、95％乙醇等

3、器材及耗材:

双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、物镜物镜测微尺、目镜测微尺、接种环、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓等

1、校正目镜测微尺：

将目镜头上的透镜旋下，把目镜测微尺裝入镜筒内，在显微镜里看到目镜测微尺的刻度。

将物镜测微尺放在载物台上，有盖玻片的一面朝上，切勿放反了。

调整光线后，先在低倍镜下找到物镜测微尺的尺子。

然后转高倍镜观察到两把尺子，调节目镜测微尺，使两把尺的刻度线平行。

再调节物镜测微尺，使目镜测微尺的一条刻度线与物镜测微尺上的一条刻度线重合，再寻找另一重合线，分别数出物镜测微尺及目镜测微尺的格数。

以此计算在此放大倍数下目镜测微尺每一小格所代表的实际长度。

物镜测微尺的10格内含有目镜测微尺共45格，此物镜测微尺内有10小格，所以目镜测微尺每小格代表的实际长度＝10格×

10微米÷

45格＝2.2微米。

2、测量微生物菌体的大小：

将物镜测微尺取下，把自制的酵母菌水浸片放于载物台上，通过旋转目镜筒的方法测出酵母菌菌体的长和宽，测量5个酵母菌菌体（先数格数，后计算）。

五、实验结果记录及计算：

1、校正目镜测微尺数据记录：

放大倍数：

目镜测微尺的格数：

物镜测微尺的格数：

目镜测微尺每小格代表的实际长度（微米）＝

2、结果记录：

放大倍数：

酵母菌编号

酵母菌占目镜测微尺的格数

计算（微米）

长

宽

3、总结：

酵母菌的平均长度为（微米）。

平均宽度为（微米）。

最大的酵母菌的长为（微米）。

其宽度为（微米）。

最小的酵母菌的长为（微米）。

实验七霉菌的湿室载片培养及根霉、曲霉、毛霉、青霉的形态观察

1、学习湿室载片培养的操作方法。

2、掌握根霉、毛霉、曲霉、青霉的形态结构及制片方法。

3、观察根霉、毛霉、曲霉、青霉的细胞结构

霉菌的结构在制片过程中易被破坏，因而影响观察，所以采用湿室载片培养法进行培养，此法便于将生长完好的霉菌菌落载片直接置于显微镜的低倍镜下观察。

霉菌的菌丝较粗大，细胞容易收缩变形，因此采用乳酸石炭酸美兰溶液作为介质进行制片。

此溶液具有不使细胞变形，可杀菌防腐，不易干燥，能保持较长时间，又有一定的染色能力。

通过观察掌握根霉的菌丝是无隔膜的，并且生有特殊的匍匐菌丝和假根，气生菌丝成簇生长，一般不分枝，顶端长有孢子囊。

在高倍镜下仔细观察孢子囊的结构分为孢子囊梗，囊托，囊轴，囊衣，和孢子。

根霉主要用于酿酒和生产各种有机酸。

毛霉采用湿室载片培养法。

其菌丝比根霉要细些，也是无隔膜的。

菌丝的分枝有两个类型：

一种为单轴式，即无分枝。

另一种为假轴状分枝。

菌丝顶端都生有球形的孢子囊，囊壁上常有针状的草酸钙结晶，囊壁很薄，孢子成熟飞出后留下的残迹称为囊领。

囊内有囊轴，形状不一。

囊轴与孢子梗之间无囊托。

毛霉的营养菌丝生长到一定时期能形成厚垣孢子，是一种休眠体。

青霉的菌丝是有隔膜，为多细胞多核的霉菌。

菌丝的首端形成扫帚状分枝，顶部着生分生孢子，分生孢子的结构由孢子梗、副枝、梗基、小梗、和孢子组成。

青霉除用于食品工业外，还主要用于医药工业中。

曲霉的菌丝与根霉、毛霉不同。

营养菌丝具有隔膜，是多核多细胞的。

营养菌丝的足细胞向上长出成束的气生菌丝，其顶端生有的孢子称为分生孢子。

分生孢子的结构为：

无隔膜的分生孢子梗、顶囊、初生梗、次生梗和孢子。

幼年的分生孢子结构在高倍镜下可清楚地看见。

1、菌种：

根霉、毛霉、青霉、曲霉斜面培养菌种。

马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）、大米麦麸固体培养基、葡萄糖豆芽汁固体培养基、二甲苯、95％乙醇、苯酚、乳酸石碳酸美蓝染液、琼脂粉等。

双目显微镜、恒温培养箱、恒温干燥箱、洁净工作台、紫外线灯管、紫外线灭菌手推车、接种环、湿室载片培养装置、试管、酒精灯、滤纸、擦镜纸、盖玻片、载玻片、打火机、棉花、滴瓶、长塑料篓等

四、实验方法及