项目名称肿瘤发生发展中关键蛋白的功能与调控首席科学家肖智雄文档格式.docx

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4）研究PIK3CA对p63的功能调控，解析PIK3CA突变体蛋白调控p63蛋白表达的分子机制，阐明PI3K通路与p63调控细胞迁移和侵袭的功能相关性。

5）应用常见肿瘤标本，对Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2、TAp63和ΔNp63基因等的表达进行定性、定量和定位分析，揭示其在肿瘤中表达的动态时空关系。

2．阐明抑癌蛋白p53家族的下游关键新靶点以及上游调控新蛋白对肿瘤发生发展的分子调控机制

1）研究p53下游新靶点Killin对S期监控点的调控，阐明Killin抑制DNA合成、激活CHK1/2的分子途径及凋亡机理，确定Killin/N8-50多肽与DNA结合前后的结构。

2）解析p53选择性调控的分子机制，从KRAB锌指蛋白家族中筛选p53调控分子，确定其调控的细胞学效应。

3）解析SIRT1-p53复合体的晶体结构。

4）阐明p63-CD82通路调控细胞迁移和侵袭的机理，研究p63调控MAPK的机制，阐明p63-MAPK通路与细胞迁移和侵袭的相关性。

3．揭示细胞周期中关键蛋白调控有丝分裂和染色体稳定性及在肿瘤发生发展中的功能和调控

1）建立微管动态不稳定性的检测分析体系，阐明微管相关蛋白（e.g.PRC1）对微管动态不稳定性的直接调控机制。

2）揭示微管相关蛋白（PRC1，Nlp）及其磷酸化修饰对有丝分裂的调控机制。

3）应用动物模型并结合人类肿瘤标本检测，明确微管相关蛋白（PRC1，Nlp）及其磷酸化修饰与恶性肿瘤发生发展及转移的关系。

4）解析微管相关蛋白（PRC1，Nlp及其截短体）的三维结构。

4．探究p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制在pIgR诱导EMT恶性转化中的影响

选择有深厚研究背景的、与EMT恶性转化密切相关的pIgR为主攻研究对象，以免疫球蛋白转运调控与恶性转化调控系统为核心研究内容，构建工程细胞株、工程动物模型等研究系统，探究pIgREMT恶性转化的分子机制，重点从免疫防御向免疫背叛转变的分子开关以及受体酪氨酸激酶家族和p53对其调控机制两个研究视角出发，研究pIgR功能逆转的动态调控机制，阐明p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化调控网络的关键节点分子；

在此基础上，引入“基因敲除”与“化学干预”平行研究策略，利用国家化合物库，筛选发现小分子调控探针，从外源性干预角度入手，佐证内源性调控的本质。

四个子课题研究内容相互关联，从点到面，将深入探讨原癌-抑癌蛋白信号网络互动在肿瘤发生发展过程中的重要作用和分子机制。

二、预期目标

本课题总体目标是以恶性肿瘤细胞为研究对象，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白通路相互作用和信号网络互动在细胞生长、凋亡、细胞周期和肿瘤细胞迁移等最基本生命过程中的功能和调控，发现和鉴定肿瘤发生发展中新的关键调控蛋白。

我们的研究将进一步完善现有生命科学基础理论以及细胞癌变理论体系，同时以这些信号通路网络和重要蛋白质的分子作用机制为突破点，为癌症治疗提供新策略和新靶点。

力求在肿瘤发生发展领域中取得原创性、前瞻性、突破性研究进展，提升我国癌症研究水平，保持国际先进行列。

本项目的五年预期目标：

1．建立一系列适合于肿瘤生长凋亡、迁移和侵袭研究的抑癌蛋白相互作用研究体系，筛选、发现和鉴定一批选择性p53家族上游调控蛋白、全新性下游作用靶点及其相互作用，阐明p53-p63信号网络在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用机制。

2．建立一系列适合肿瘤迁移和侵袭研究的原癌蛋白通路的研究体系，揭示恶性肿瘤迁移过程中GTPaseRas/Rho家族蛋白的关键重要信号通路及网络互动的功能特点。

3．研究细胞周期调控关键蛋白对有丝分裂调控的分子作用机制，揭示该类蛋白及其网络互动在恶性肿瘤发生发展过程中的关键作用。

4．明确免疫球蛋白受体pIgR在EMT恶性转化中的重要作用，揭示免疫球蛋白受体pIgR诱导EMT恶性转化的分子机制。

5．人才培养及基地建设：

人才培养：

为我国培养一批研究肿瘤发生发展机制的创新性人才，打造一支颇具国际竞争力的优秀创新群体，重点培养2-3名国际知名领衔学科带头人、2-3名国家杰出青年获得者、2-3名中国科学院百人计划入选者和一批博士后、博士生、硕士生。

希望通过本项目的实施，取得具有国际影响力并原创性科研成果。

在国际重要学术刊物上发表高水平论文50篇以上，其中在影响因子大于10的刊物上发表10-15篇，申请专利10-15项。

基地建设：

综合应用基因差异筛选技术、蛋白质组学技术、细胞内蛋白质三维结构成像技术、活细胞与活体成像技术、肿瘤细胞迁移研究技术、体外微管动态不稳定性分析技术、遗传操作与模式动物技术、X射线单晶衍射分析结合二维和多维核磁共振（NMR）技术，建立体内外多参数同步化、时空定量可视化的原癌蛋白与抑癌蛋白结构与功能研究体系，打造国际同行瞩目的代表中国原创水平的从事原癌蛋白与抑癌蛋白之间网络互动与肿瘤发生发展机制研究的平台基地。

课题设置：

1．课题设置的总体思路

课题的设置主要考虑当前癌症研究领域的研究重点和发展趋势，并结合我国常见恶性肿瘤诊治水平提高的重大需求。

以研究原癌蛋白-抑癌蛋白网络通路及其调控在细胞生长增殖、细胞周期调控、肿瘤细胞迁移和炎癌转化等方面的分子机制为出发点，深入探讨原癌蛋白-抑癌蛋白信号网络互动，以原癌蛋白Ras/Rho家族、PI3K/Akt、GSK3b等以及抑癌蛋白p53家族、BRCA1、PTEN及其网络互动为切入点，研究新的上下游调控蛋白的生物学功能及其在肿瘤发生发展中的作用。

并以这些关键蛋白为靶点，筛选可调控其功能的小分子化合物，为临床肿瘤诊疗奠定分子生物学基础。

2．各课题研究内容及其与项目预期目标的关系

本项目的设置以上述思路为基础，分为四个课题：

（1）研究原癌蛋白Ras/Rho家族新的上游调控蛋白和下游作用靶点在EMT、肿瘤转移的分子作用机制；

（2）研究抑癌蛋白p53家族下游关键新靶点、上游调控新蛋白、以及相关信号通路对细胞生长、凋亡、细胞周期、细胞迁移和侵袭的功能和调控；

（3）研究细胞周期中关键新蛋白调控有丝分裂、染色体组稳定性以及在肿瘤发生发展中的作用；

（4）研究免疫蛋白和小分子化合物在EMT和肿瘤转移的调控与干预的分子机制。

本项目以正常细胞癌变过程中最基本的生物学过程，包括细胞周期、细胞增殖与凋亡、EMT和细胞迁移和侵袭为中心，以调控这些基本生物学过程的关键蛋白和信号通路为主线。

前两个课题分别从原癌蛋白Ras/Rho家族和抑癌蛋白p53家族的功能、信号通路和调控机制进行并行和相互交叉的研究；

课题三着重研究生命现象中最基本的细胞周期中调控有丝分裂的关键蛋白，及其与前两个课题所涉及的原癌蛋白－抑癌蛋白信号网络中关键蛋白的互动；

课题四研究免疫球蛋白受体以及受体酪氨酸激酶家族对EMT和肿瘤转移的调控网络。

同时研究小分子化合物对这些过程的干扰，为肿瘤诊断治疗提供新方法和新靶点。

本项目的主要目标是深入研究原癌-抑癌蛋白的相互作用。

课题一和课题二以原癌蛋白PIK3CA、Apak、Gankyrin、调控抑制癌蛋白p53、p63为主线。

同时研究p53、p63对PI3K和MAPK等关键生长信号通路的反馈调控。

课题三以细胞有丝分裂调控关键蛋白PRC1、Nlp为切入点，研究微管相关蛋白网络对细胞有丝分裂过程中纺锤体形成以及中心体、染色体分离的调控，同时研究p53对这些蛋白分子及其网络互动的上游调控。

课题四以免疫球蛋白受体EMT恶性转化的分子机制研究为切入点，研究免疫球蛋白受体功能逆转的动态调控机制以及p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化中新的关键节点蛋白的结构组成，阐明其动态变化的网络调控机制。

四个子课题研究平台相互交叉、研究内容相互关联，从点到面，课题一和课题二中已建立的蛋白组学、蛋白质结构解析平台、和课题四已建立的小分子化合物筛选平台为整个项目研究关键蛋白的功能、调控及分子机制提供技术平台和支持。

其相互关系如下图所示：

三、研究方案

课题一：

研究原癌蛋白Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点在肿瘤细胞迁移的分子作用机制

基于原癌蛋白Ras等诱导肿瘤的小鼠模型，利用ORIS系统，应用高通量基因沉默技术和高内涵技术等手段鉴定恶性肿瘤迁移过程中关键蛋白质，并探讨这些蛋白质在肿瘤发生发展过程中的功能与调控；

深入研究Gankyrin等癌基因以及Hippo/MST1-YAP2信号转导通路在肿瘤迁移中的作用；

人肿瘤中Gankyrin等关键调控蛋白的表达水平与肿瘤细胞的转移程度的相关性分析；

利用NMR解析Gankyrin等关键蛋白质及其复合体的结构，我们将利用已建立的稳定表达各种PIK3CA突变体的细胞株分析PI3K信号通路调控ΔNp63蛋白表达的分子机制。

利用特异性磷酸化抗体重点探索Akt蛋白激酶激活状态对ΔNp63蛋白表达调控的影响。

验证p63是否是介导PI3K信号通路调控肿瘤转移的关键因素。

研究并评估p63信号通路在肿瘤细胞迁移和侵袭中的临床相关性。

承担单位：

四川大学，军事医学科学院，中科院生物物理所

课题负责人：

肖智雄教授

主要学术骨干：

李慧艳副研究员，袁增强研究员

经费比例：

27%

课题二：

研究抑癌蛋白p53家族及新的上游调控蛋白和下游作用靶点对肿瘤发生发展的分子调控机制

研究p53下游新靶点蛋白Killin对细胞周期S期监控点的功能和调控。

明确Killin在S期染色质上的定位、及其与DNA复制蛋白RPA和PCNA之间相互关系，阐明Killin抑制DNA合成的分子机理。

揭示Killin在DNA损伤应答过程中的功能，阐明Killin激活DNA监测点蛋白CHK1和CHK2的分子途径及细胞凋亡机理，为肿瘤化疗放疗提供进一步的理论基础。

通过NMR溶液结构分析，确定Killin/N8-50多肽与DNA结合前后的结构及抑制DNA合成的分子机理。

解析对p53蛋白功能选择性调控的分子机制。

以我们新发现的选择性调控p53下游细胞凋亡活性的KRAB型锌指蛋白Apak为切入点，从KRAB锌指蛋白家族400多个成员中筛选鉴定新的p53选择性调控分子，确定它们所调控的细胞学效应及与肿瘤发生发展的关系，探索Apak对p53靶基因转录调控区的表观遗传学调节机制。

解析SIRT1-p53蛋白复合体的晶体结构。

以我们发现的p63下游新靶点CD82/KAI1为切入点，阐明p63-CD82通路调控细胞迁移和侵袭的分子机理。

同时研究p63调控MAPK的分子机制，阐明p63-MAPK信号通路与细胞迁移和侵袭的功能相关性。

四川大学，军事医学科学院，中科院生物物理所

梁朋教授

李沁桐副教授，李力副研究员，杨娜副研究员

26.5%

课题三：

研究有丝分裂关键调控蛋白在肿瘤发生发展中的作用及分子机制

研究有丝分裂调控关键蛋白PRC1和Nlp的分子作用机制及其网络互动对细胞周期及有丝分裂的调控，并揭示这些蛋白及其作用网络对恶性肿瘤发生发展及转移的作用机制，最终明确以这些蛋白为核心的网络互动、信号传导及蛋白修饰在恶性肿瘤发生发展及转移，甚至治疗过程中的重要意义。

建立微管动态不稳定性的检测分析体系，阐明微管相关蛋白（e.g.PRC1）对微管动态不稳定性的直接调控机制。

揭示微管相关蛋白（PRC1，Nlp）及其磷酸化修饰对有丝分裂的调控机制。

应用动物模型并结合人类肿瘤标本检测，明确微管相关蛋白（PRC1，Nlp）及其磷酸化修饰与恶性肿瘤发生发展及转移的关系。

解析微管相关蛋白（PRC1，Nlp及其截短体）的三维结构。

中国医学科学院，北京大学

姜伟教授

童彤研究员,夏斌教授

课题四：

研究免疫蛋白和小分子化合物在肿瘤发生发展中的调控与干预的分子机制

选择有深厚研究背景的、与EMT恶性转化密切相关的pIgR为主攻研究对象，以免疫球蛋白转运调控与恶性转化调控系统为核心研究内容，构建工程细胞株、工程动物模型等研究系统，探究pIgR在EMT恶性转化中的分子机制，重点从免疫防御向免疫背叛转变的分子开关以及受体酪氨酸激酶家族和p53对其调控机制两个研究视角出发，研究pIgR功能逆转的动态调控机制，阐明p53、RTK及免疫球蛋白受体三者之间动态调控机制，剖析EMT恶性转化调控网络的关键节点分子；

中科院上海药物所

耿美玉研究员

俞强研究员，黄敏副研究员

20%

四、年度计划

研究内容

预期目标

第

一

年

1．建立一系列适合于肿瘤细胞迁移和侵袭研究的研究体系；

利用Oris系统和高内涵技术鉴定关键蛋白质;

2，研究Killin与RPA和PCNA在细胞周期的相对定位；

筛选Apak的DNA结合序列，研究Apak选择性调控p53介导的细胞凋亡的分子机理。

3.研究PRC1对中心体介导的微管形成和动态不稳定性；

研究确定Nlp与BRCA1相结合的功能域，检测其对细胞内中心体分离，纺锤体形成和细胞有丝分裂的影响。

4.检测分析pIgR高表达前后基因和蛋白表达的差异，初步探讨前述获得的候选目标分子（群）在pIgR诱导EMT的具体调控机制；

研究pIgR表达情况与EMT恶性转化的临床相关性研究。

1.建立肿瘤细胞转化及迁移和侵袭模型；

筛选、发现一批新的Ras通路关键介导子及肿瘤转移相关蛋白质。

2.筛选、发现和鉴定一批新的p53家族下游关键靶点及其相互作用蛋白质。

分析Killin作为DNA单链高亲合蛋白抑制DNA合成的分子机理以及Apak的DNA结合能力在其选择性调控p53靶基因中的功能。

3．分析PRC1对体外微管动态不稳定性的直接调控机制；

初步明确Nlp与BRCA1结合的细胞生物学意义。

4.初步鉴定pIgR介导EMT的调控分子及其在pIgR诱导EMT的可能调控机制；

初步分析明确pIgR与EMT恶性转化在1-2种肿瘤组织的临床相关性。

发表6-12篇研究论文。

二

1.探讨Gankyrin，Hippo/MST1-YAP2等对Ras诱发的肿瘤迁移能力的影响以及影响细胞迁移和侵润的分子机制;

分析PIK3CA突变体蛋白调控ΔNp63蛋白表达的分子机制。

2.检测Killin对ATM和ATR蛋白磷酸化及稳定性的影响；

筛选KZNF家族中新的p53调控分子，确认其选择性功能；

筛选SIRT1及SIRT1与底物p53肽段结合复合物的结晶条件；

鉴定与ΔNp63调控CD82/KAI1和MKP3表达的分子机制。

3.研究PRC1对纺锤体形成的影响；

明确PLK1在Nlp蛋白分子的磷酸化位点及与BRCA1相互作用的关键位点。

明确BRCA1-Nlp-PLK1之间网络互动对Nlp在中心体定位，有丝分裂及蛋白稳定性的作用。

4.研究候选目标分子（群）在pIgR诱导EMT的具体调控机制；

进一步研究pIgR表达与EMT恶性转化的临床相关性；

探讨pIgR转运相关分子对其介导的EMT效应的影响。

1.阐明Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2等参与肿瘤细胞迁移和侵袭的分子机制；

验证筛选到的新的Ras通路关键介导子对肿瘤迁移和侵袭的影响。

阐明PI3K信号通路调控ΔNp63蛋白表达的分子机制；

2.阐明Killin诱导CHK1和CHK2磷酸化及稳定性增加的分子机制；

获得一批新的p53上游调控分子；

获得SIRT1与p53相互作用的结构基础；

阐明ΔNp63调控CD82/KAI1和MKP3表达的分子机制。

3.阐明微管相关蛋白PRC1对体外纺锤体形成的直接调控机制；

阐明Nlp被PLK1磷酸化修饰的细胞生物学意义，明确BRCA1-Nlp-PLK1之间的网络互动的细胞生物学功能。

4.阐明候选目标分子（群）在pIgR诱导EMT的分子调控机制；

明确pIgR与肿瘤EMT恶性转化的相关性；

确定pIgR作为复发转移预测标志物及潜在药靶的可行性；

初步阐明调控pIgR转运相关分子对其介导的EMT效应的影响。

发表6-12篇研究论文；

申请1-2项中国发明专利。

三

1.分析Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2蛋白质结构，以与人肿瘤转移程度的相关性;

研究PIK3CA对ΔNp63的负调控的生物学意义。

2.研究Killin，ATM/ATR的磷酸与及DNA合成复制叉停顿的功能相关性；

研究KZNF家族成员与p53的相互作用及肿瘤相关性；

研究SIRT1对p53活性调控的蛋白结构基础；

研究ΔNp63对MAPK信号通路的负调控的分子机制。

3.分析PRC1对细胞内微管动态不稳定性及纺锤体形成的影响；

研究Nlp蛋白关键磷酸化位点及其功能相关性；

分析BRCA1的磷酸化对细胞转化能力的影响。

4.研究与转运相关调控分子对pIgR诱导EMT的影响机制，探讨其作为转移标志物的可行性；

分析受体酪氨酸激酶与pIgR在恶性转化中的功能相关性及其在pIgR介导的EMT发生发展中的作用机制；

在此基础上，初步研究p53对受体酪氨酸激酶家族分子（群）在pIgR介导的EMT发生发展中的影响机制；

1.分析Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2蛋白质结构；

明确Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2与人肿瘤转移程度的相关性；

阐明PI3K信号通路对ΔNp63调控的生物学意义。

2.阐明Killin诱导细胞凋亡的信息通道；

揭示对p53具有选择性调控作用的KZNF在肿瘤发生发展中的功能；

明确p53去乙酰化修饰的结构与其功能的相关性；

揭示p63与MAPK通路及在肿瘤转移中的的功能关联。

3.阐明PRC1对细胞内微管动态不稳定性、纺锤体形成以及染色体稳定性的直接调控机制；

阐明Nlp磷酸化修饰在细胞恶性转化过程中的意义，明确p53-BRCA1-Nlp-PLK1信号网络互动在致癌过程中的作用机理。

4.阐明与转运相关调控核心分子对pIgR诱导EMT的影响机制，明确其作为转移标志物的可行性；

揭示与pIgR诱导EMT相关的受体酪氨酸激酶及其调控机制，明确p53对该过程的影响。

发表7-12篇研究论文；

四

1.研究Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2在动物模型中对肿瘤细胞迁移和侵润的影响；

研究PI3K-p63信号通路调控肿瘤细胞转移的分子机制。

2.建立Killin基因敲除小鼠；

利用小鼠模型确认KZNF家族成员对p53调控的重要性；

模拟p53肽段设计抑制SIRT1去乙酰化酶活性的小分子抑制剂；

研究ΔNp63-MAPK信号通路与肿瘤转移的临床相关性。

3.研究PRC1在裸鼠模型中对与肿瘤发生发展及转移的作用；

研究PRC1-AuroraB-Nlp为核心的中小体蛋白分子网络，并确定该网络对中小体形成以及对细胞胞质分裂的作用。

4.完善受体酪氨酸激酶对pIgR从免疫防御向免疫背叛转变分子调控机制以及p53对其的影响机制，探讨候选分子作为转移标志物的可行性；

筛选靶向免疫球蛋白受体EMT调控网络的活性小分子。

1.明确Gankyrin、Hippo/MST1-YAP2在动物模型中对肿瘤细胞迁移和侵袭的影响；

阐明PI3K信号通路对ΔNp63蛋白表达的机制，解析PIK3CA-ΔNp63通路与对肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用机制。

建立1-2个KZNF家族基因的敲除或者转基因小鼠模型；

筛选增强p53抗肿瘤活性的新型小分子抑制剂；

揭示p63-MAPK通路与肿瘤转移的临床相关性。

3.揭示PRC1在细胞恶性转化过程中及临床肿瘤发生发展及转移的作用；

阐明Nlp在中小体形成过程中的作用，明确以PRC1-AuroraB-Nlp为核心的网络互动的细胞生物学功能。

4.阐明受体酪氨酸激酶对pIgR从免疫防御向免疫背叛转变分子调控机制以及p53对其的影响机制，明确候选分子作为转移标志物的可行性；

发现影响免疫球蛋白受体EMT调控网络的活性小分子（群）；

发表研究论文8-12篇；

申请3-5项中国发明专利。

五

1.研究p63信号通路在肿瘤细胞迁移和侵袭中的临床相关性；

研究Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点的表达谱，并分析其与肿瘤细胞迁移和侵袭的临床相关性。

2.研究Killin/N8-50多肽与DNA结合前、结合后在溶液中的结构；

研究不同KZNF成员之间的表达谱，构建KZNF与p53选择性调控之间的网络关系。

3.解析PRC1蛋白和Nlp蛋白关键功能域的三维结构；

设计筛选能够模拟或抑制PRC1/Nlp蛋白的小分子化合物；

研究这些小分子化合物对肿瘤生长、增殖的抑制作用。

4.继续筛选靶向pIgR-EMT调控网络的活性小分子；

研究有价值的探针干预EMT恶性转化的分子机制。

1.评估p63信号通路在肿瘤细胞迁移和侵袭中的临床相关性；

揭示Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点的表达谱，评估与肿瘤转移临床相关性；

阐明Ras/Rho家族上游调控蛋白和下游作用靶点家族在Ras调控网络中的地位与功能意义。

2.获得Killin/N8-50多肽的NMR结构；

阐明KZNF家族类似Apak的成员在p53调控网络中的地位与生理意义；

阐明p53-p63信号网络在肿瘤细胞迁移和侵袭中的作用机制。

3.解析PRC1和Nlp蛋白及其功