《分子生物学》实验讲义Word下载.docx

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它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性，从而抑制酶的活性。

异硫氰酸胍：

目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂，它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。

它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来，又对RNA酶有强烈的变性作用。

氧钒核糖核苷复合物：

由氧化钒离子和核苷形成的复合物，它和RNA酶结合形成过渡态类物质，几乎能完全抑制RNA酶的活性。

RNA酶的蛋白抑制剂（RNasin）：

从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。

RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂，可以和多种RNA酶结合，使其失活。

其它：

SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

方法一：

1.取材料2g，液氮中研磨成细粉末，等份转入2个冰上预冷的50m1离心管中。

2.每管加入l0m165℃预热的2×

CTAB提取液和500ulβ-巯基乙醇，剧烈涡旋匀浆

65℃水浴温育30min。

3.每管加入10m1氯仿:

异戊醇（24:

1），涡旋混匀，冰浴10min。

4℃，12000rpm离心10min。

4.取上清，加入1/3体积8mol/LLiCl和500ulβ-巯基乙醇，-20℃下沉淀过夜。

5.4℃，15000rpm离心20min。

6.弃上清，沉淀用4ml异硫氰酸胍变性液溶解，加入120ulβ-巯基乙醇和880ul2mol/L

NaAc（pH4.0），混匀后加入5ml酚:

氯仿:

异戊醇（25:

24:

4℃，12000rpm离心15min。

7.取上清，加入等体积酚:

1），涡旋混匀，冰浴5min。

4℃，14000rpm离心10min。

8.取上清，加入等体积氯仿:

1）涡旋混匀。

9.取上清，加入1/10体积3mol/LNaAc（pH5.2）和2.5倍体积无水乙醇，-20℃下放

置2h或过夜。

10.4℃，15000rpm离心20min，弃上清，沉淀用预冷的75%乙醇漂洗2次，冰上空

气干燥RNA沉淀。

（每次漂洗时，14000rpm离心10min）。

11.加入400ulRNase-freeddH20溶解沉淀，取5ul稀释100倍测UVλ230，260，280

下的OD值，检测RNA样品的纯度及浓度。

取5ug进行RNA电泳检测rRNA的完整性，其余样品加入3倍体积的无水乙醇于-70℃下保存。

方法二：

采用TRNzol提取法：

1.每50—100mg左右的烟草叶片，在液氮中研磨成粉末后，加入１mL的Trizol，充分摇匀（注意样品总体积不能超过所用Trizol体积的10％）。

2.15－30℃放置5分钟，使得核酸蛋白复合物完全分离。

3.4℃，10000g，离心10分钟。

4.取上清液于一新管中，每使用1mLTrizol加入0.2mL的氯仿，盖好管盖，剧烈振荡15秒，室温放置3分钟。

5.4℃，10000g，离心15分钟，样品会分成三层：

黄色的有机相，中间层和无色的水相，RNA主要集中在水相中，水相的体积约为所用TRNzol试剂的60%。

6.移上清液至一新的离心管，每使用1mLTrizol加入0.5mL的异丙醇，混匀，室温放置10分钟。

7.4℃，10000g，离心10分钟，弃去上清液。

8.加入１mL75%DEPC-乙醇洗RNA沉淀，涡旋混匀。

9.4℃不超过7500g离心5分钟，弃去上清液。

10.在超净台打开吹风吹干，注意不要干燥过分，否则RNA会很难溶解，然后每管加入20—30μLDEPC处理水充分溶解，取2μL总RNA，用1.2%的甲醛变性琼脂糖凝胶进行电泳鉴定。

附：

聚合酶链式反应（PCR）

聚合酶链式反应（PolymeraseChainReaction，PCR）是体外酶促合成特异DNA片段的一种方法，为最常用的分子生物学技术之一。

典型的PCR由

（1）高温变性模板；

（2）引物与模板退火；

（3）引物沿模板延伸三步反应组成一个循环，通过多次循环反应，使目的DNA得以迅速扩增。

其主要步骤是：

将待扩增的模板DNA置高温下（通常为93℃-94℃）使其变性解成单链；

人工合成的两个寡核苷酸引物在其合适的复性温度下分别与目的基因两侧的两条单链互补结合，两个引物在模板上结合的位置决定了扩增片段的长短；

耐热的DNA聚合酶（Taq酶）在72℃将单核苷酸从引物的3’端开始掺入，以目的基因为模板从5’→3’方向延伸，合成DNA的新互补链。

PCR能快速特异扩增任何已知目的基因或DNA片段，并能轻易在皮克（pg）水平起始DNA混合物中的目的基因扩增达到纳克、微克、毫克级的特异性DNA片段。

因此，PCR技术一经问世就被迅速而广泛地用于分子生物学的各个领域。

它不仅可以用于基因的分离、克隆和核苷酸序列分析，还可以用于突变体和重组体的构建，基因表达调控的研究，基因多态性的分析，遗传病和传染病的诊断，肿瘤机制的探索，法医鉴定等诸多方面。

通常，PCR在分子克隆和DNA分析中有着以下多种用途：

（1）生成双链DNA中的特异序列作为探针；

（2）由少量mRNA生成cDNA文库；

（3）从cDNA中克隆某些基因；

（4）生成大量DNA以进行序列测定；

（5）突变的分析；

（6）染色体步移；

（7）RAPD、AFLP、RFLP等DNA多态性分析等。

一、试剂准备

1.DNA模版

2．对应目的基因的特异引物

3．10×

PCRBuffer

4．2mMdNTPmix：

含dATP、dCTP、dGTP、dTTP各2mM

5．Taq酶

二、操作步骤 

1．在冰浴中，按以下次序将各成分加入一无菌0.5ml离心管中。

10×

PCRbuffer5μl

dNTPmix（2mM）4μl

　引物1（10pM）2μl

　引物2（10pM）2μl

Taq酶（2U/μl）1μl

DNA模板（50ng-1μg/μl）　1μl

加ddH2O至 

50μl

视PCR仪有无热盖，不加或添加石蜡油。

2．调整好反应程序。

将上述混合液稍加离心，立即置PCR仪上，执行扩增。

一般：

在93℃预变性3-5min，进入循环扩增阶段：

93℃40s→58℃30s→72℃60s，循环30-35次，最后在72℃保温7min。

3．结束反应，PCR产物放置于4℃待电泳检测或-20℃长期保存。

4．PCR的电泳检测：

如在反应管中加有石蜡油，需用100μl氯仿进行抽提反应混合液，以除去石蜡油；

否则，直接取5-10μl电泳检测。

三、PCR反应体系的组成与反应条件的优化

　PCR反应体系由反应缓冲液（10×

PCRBuffer）、脱氧核苷三磷酸底物（dNTPmix）、耐热DNA聚合酶（Taq酶）、寡聚核苷酸引物（Primer1，Primer2）、靶序列（DNA模板）五部分组成。

各个组份都能影响PCR结果的好坏。

1．反应缓冲液：

一般随TaqDNA聚合酶供应。

标准缓冲液含：

50mMKCl，10mMTris-HCl（pH8.3室温），1.5mMMgCl2。

Mg2+的浓度对反应的特异性及产量有着显著影响。

浓度过高，使反应特异性降低；

浓度过低，使产物减少。

在各种单核苷酸浓度为200μM时，Mg2+为1.5mM较合适。

若样品中含EDTA或其它螯合物，可适当增加Mg2+的浓度。

在高浓度DNA及dNTP条件下进行反应时，也必须相应调节Mg2+的浓度。

据经验，一般以1.5-2mM（终浓度）较好。

2．dNTP：

高浓度dNTP易产生错误掺入，过高则可能不扩增；

但浓度过低，将降低反应产物的产量。

PCR中常用终浓度为50-400μM的dNTP。

四种脱氧三磷酸核苷酸的浓度应相同，如果其中任何一种的浓度明显不同于其它几种时（偏高或偏低），就会诱发聚合酶的错误掺入作用，降低合成速度，过早终止延伸反应。

此外，dNTP能与Mg2+结合，使游离的Mg2+浓度降低。

因此，dNTP的浓度直接影响到反应中起重要作用的Mg2+浓度。

3．TaqDNA聚合酶酶：

在100μl反应体系中，一般加入2-4U的酶量，足以达到每min延伸1000-4000个核苷酸的掺入速度。

酶量过多将导致产生非特异性产物。

但是，不同的公司或不同批次的产品常有很大的差异，由于酶的浓度对PCR反应影响极大，因此应当作预试验或使用厂家推荐的浓度。

当降低反应体积时（如20μl或50μl），一般酶的用量仍不小于2U，否则反应效率将降低。

4．引物：

引物是决定PCR结果的关键，引物设计在PCR反应中极为重要。

要保证PCR反应能准确、特异、有效地对模板DNA进行扩增，通常引物设计要遵循以下几条原则：

⑴引物的长度以15-30bp为宜，一般（G+C）的含量在45-55%，Tm值高于55℃［Tm=4（G+C）+2（A+T）］。

应尽量避免数个嘌呤或嘧啶的连续排列，碱基的分布应表现出是随机的。

⑵引物的3’端不应与引物内部有互补，避免引物内部形成二级结构，两个引物在3’端不应出现同源性，以免形成引物二聚体。

3’端末位碱基在很大程度上影响着Taq酶的延伸效率。

两条引物间配对碱基数少于5个，引物自身配对若形成茎环结构，茎的碱基对数不能超过3个，由于影响引物设计的因素较多，现常利用计算机辅助设计。

⑶人工合成的寡聚核苷酸引物需经PAGE或离子交换HPLC进行纯化。

⑷引物浓度不宜偏高，浓度过高有两个弊端：

一是容易形成引物二聚体（primer-dimer），二是当扩增微量靶序列并且起始材料又比较粗时，容易产生非特异性产物。

一般说来，用低浓度引物不仅经济，而且反应特异性也较好。

一般用0.25-0.5pM/μl较好。

⑸引物一般用TE配制成较高浓度的母液（约100μM），保存于-20℃。

使用前取出其中一部分用ddH2O配制成10μM或20μM的工作液。

5．模板：

PCR对模板的要求不高，单、双链DNA均可作为PCR的样品。

虽然PCR可以用极微量的样品（甚至是来自单一细胞的DNA）作为摸板，但为了保证反应的特异性，一般还宜用μg水平的基因组DNA或104拷贝的待扩增片段作为起始材料。

原材料可以是粗制品，某些材料甚至仅需用溶剂一步提取之后即可用于扩增，但混有任何蛋白酶、核酸酶、TaqDNA聚合酶抑制剂以及能结合DNA的蛋白，将可能干扰PCR反应。

6．PCR循环加快，即相对减少变性、复性、延伸的时间，可增加产物的特异性。

四、注意事项

１．PCR反应应该在一个没有DNA污染的干净环境中进行。

最好设立一个专用的PCR实验室。

２．纯化模板所选用的方法对污染的风险有极大影响。

一般而言，只要能够得到可靠的结果，纯化的方法越简单越好。

３．所有试剂都应该没有核酸和核酸酶的污染。

操作过程中均应戴手套。

４．PCR试剂配制应使用最高质量的新鲜双蒸水，采用0.22μm滤膜过滤除菌或高压灭菌。

５．试剂都应该以大体积配制，试验一下是否满意，然后分装成仅够一次使用的量储存，从而确保实验与实验之间的连续性。

６．试剂或样品准备过程中都要使用一次性灭菌的塑料瓶和管子，玻璃器皿应洗涤干净并高压灭菌。

７．PCR的样品应在冰浴上化开，并且要充分混匀。

实验二RNA电泳检测

继分析DNA的Southern杂交方法出现后，1977年Alwine等人提出一种与此相类似的、用于分析细胞总RNA或含polyA尾的RNA样品中特定mRNA分子大小和丰度的分子杂交技术，这就是与Southern相对应而定名的Northern杂交技术。

这一技术自出现以来，已得到广泛应用，成为分析mRNA最为常用的经典方法。

与Southern杂交相似，Northern杂交也采用琼脂糖凝胶电泳，将分子量大小不同的RNA分离开来，随后将其原位转移至固相支持物（如尼龙膜、硝酸纤维膜等）上，再用放射性（或非放射性）标记的DNA或RNA探针，依据其同源性进行杂交，最后进行放射自显影（或化学显影），以目标RNA所在位置表示其分子量的大小，而其显影强度则可提示目标RNA在所测样品中的相对含量（即目标RNA的丰度）。

但与Soughern杂交不同的是，总RNA不需要进行酶切，即是以各个RNA分子的形式存在，可直接应用于电泳；

此外，由于碱性溶液可使RNA水解，因此不进行碱变性，而是采用甲醛等进行变性电泳。

虽然Northern也可检测目标mRNA分子的大小，但更多的是用于检测目的基因在组织细胞中有无表达及表达的水平如何。

电泳系统等实验用具的预处理

电泳槽、梳子等必须用去污剂洗干净，蒸馏水冲洗，乙醇擦洗干净后，用3％双氧水处理20min，再用1‰DEPC水彻底冲洗干净，待用。

所有的试剂必须用1‰DEPC水配制，试剂瓶、培养皿等玻璃用品180℃高温烘烤8～12h。

所有磁缸洗净后，用1‰DEPC处理过夜。

甲醛变性凝胶电泳检测RNA的完整性，步骤如下：

A.配置琼脂糖凝胶

1.称取0.3g琼脂糖于一个180℃烘过10h或1‰DEPC水处理过的三角瓶中，加入30ml1×

MOPS缓冲液，微波炉加热熔化。

2.凝胶冷却至60-70℃后，依次加入0.5ml甲醛和1.5μlEB储备液（10mg/ml），混匀。

3.在通风橱中灌制凝胶，插好上样体积为20μl的梳子。

B.上样样品的制备

1.在一DEPC水处理过的0.5ml离心管中依次加入2μl10×

MOPS，3.5μl甲醛，10ul去离子甲酰胺，4.5ulRNA储备液；

2.离心管在65℃水浴锅中保温10min，立即放置到冰上保持2min，向冰浴中的样品

加入2μl上样染料，混匀后上样电泳。

3.以1×

MOPS为电泳缓冲液，5v/cm恒压预电泳5min，上样后以4v/cm电压电泳40min

左右，在凝胶成像系统中观察RNA的完整性。

Northern分析

RNA的印迹转移

A.电泳系统等实验用具的预处理

B.RNA上样量一致性的确定

1.首先根据紫外分光光度计测定的A260/A280和A260/A230值来初步估算RNA含量和纯度。

然后甲醛变性凝胶电泳进一步确定各样品RNA的含量。

2.然后将RNA样品上样于加样孔中，每个样品含总RNA约40μg。

恒压4V/cm电泳40min，电泳结束后于成像系统中观察各样品上样量是否一致。

C.用于印迹转移的RNA甲醛变性凝胶电泳

在确定各样品上样量一致后，按同样的方法进行RNA电泳。

D.RNA的印迹转移

1.甲醛变性胶的处理

电泳结束后，用刀片切去凝胶多余的部分并切去左上角作为方向标记。

然后，将变性凝胶放入2×

SSC溶液中漂洗5min，除去凝胶中的甲醛和染料。

2.尼龙膜的处理

剪取比凝胶大约1mm的带正电尼龙膜，并剪去左上角与凝胶的形状相对应。

将尼龙膜置于20×

SSC溶液中放置平衡，直至尼龙膜从下往上全部湿透（注：

若尼龙膜在水面上漂浮数分钟后仍未湿透，则此膜不能用于RNA的印迹转移）。

3.Whatman3MM滤纸的处理

将Whatman3MM滤纸剪成与尼龙膜一致的形状，在20×

SSC溶液中浸透，待用。

4.RNA的下行印迹转移

①在一叠吸水纸上铺上三层处理好的Whatman3MM滤纸，使其平整利于印迹转移。

②将处理好的尼龙膜置于Whatman3MM滤纸上，然后将凝胶叠放于尼龙膜上，并使其方向一致，凝胶的RNA面紧贴尼龙膜。

③用玻璃棒平压胶面，使凝胶和尼龙膜之间不留气泡。

④在凝胶上面铺两层与胶同样大小的Whatman3MM滤纸，然后用同样滤纸在转移缓冲液（20×

SSC溶液）和凝胶上面的Whatman3MM滤纸之间搭起纸桥。

⑤静置印迹转移16h，期间注意更换吸水纸。

尼龙膜中RNA的固定

1.印迹转移结束后，将尼龙膜浸入2×

SSC中洗膜5min后，除去尼龙膜上的琼脂糖，取出膜，置于滤纸上晾干，用铅笔在尼龙膜上标明上样孔的位置，然后夹在两张滤纸之间于120℃烘烤30min，固定RNA于尼龙膜上。

将凝胶置于成像系统中观察RNA是否转移完全。

2.固定好RNA的尼龙膜，用保鲜膜及锡箔纸张包好，于4℃保存。

探针的制备

1.在一0.5ml灭菌后的离心管中加入PCR纯化产物（约含线性DNA1ug）作为待标记模板。

2.加入2u19-merRandomPrimer，用H20（或TEBuffer）定容至14u1。

3.95℃加热3分钟后迅速置于冰中冷却，放置5分钟。

4.加入10×

Buffer，dNTPMixture各2.5ul，用于标记的（X-32P-dCTP（50uCi））5u1，用H20定容至24ul。

5.加入1ulExo-freeKlenowFragment37℃反应30分钟。

6.65℃加热5分钟使酶失活（或者加入EDT至终浓度为30mM）。

杂交

A.预杂交

将固定好RNA的尼龙膜于2×

SSC溶液中浸泡2min，使其充分湿润。

然后将RNA膜浸入65℃预热的预杂交液Churchbuffer中，65℃预杂交4h。

B.探针杂交

将（2.2.2.3）中标记好的探针沸水浴3分钟，使其充分变性，然后迅速置于冰上冷却。

预杂交结束后，倒出杂交管中的预杂交液。

加入18ml新的高效杂交液Churchbuffer，加入变性探针，65℃杂交16h。

洗膜和检测

杂交结束后，按以下步骤洗膜：

1.5×

SSC，0.1%SDS，室温，15min。

2.2×

3.0.1×

SSC，0.1%SDS，37℃，15min。

4.洗膜后，用滤纸吸去膜表面水分，保鲜膜包裹。

5.用monitor检测放射性强度，在暗室中压上X光片，两面覆以增感屏，-70℃曝光2-3day。

6.曝光结束后，在暗室中取出X光片。

显影3min，定影5min。

注意事项

1．操作时必须仔细、小心，严格按同位素操作规程进行，以防止同位素污染。

2．必要时，可采用SephadesG-50柱层析法纯化标记的探针（见本节附录），以去除标记反应中未结合的（游离的）核苷酸。

3．膜的重复使用：

结合了待测RNA的膜与探针杂交后，可经碱或热变性方法将探针洗脱，膜可反复使用与其它探针杂交。

方法如下：

杂交的膜（注意：

杂交过的膜在保存过程中不能干燥，否则探针将会与膜形成不可逆的结合）置100℃0.5%SDS中煮沸3min，自然冷却至室温后，将膜放入双蒸水中漂洗2-3遍。

取出膜，用滤纸吸去膜表面的水份。

将膜直接进行另一种探针的杂交或用保鲜膜包好，室温下真空保存。

附录一：

有关试剂的配制

A.叶片RNA提取试剂配制:

1.叶片RNA提取CTAB缓冲液（2X）:

2%（w/v）CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）

100mmol/LTris-Cl（pH8.0）

20mmol/LEDTA（pH8.0）

6mol/LNaCl

浓盐酸调pH为8.0。

2.异硫氰酸胍变性液:

4mol/L异硫氰酸胍（!

）

42mmol/L柠檬酸钠

0.83%（w/v）十二烷基肌氨酸钠

用1‰DEPC水配制处理12h后121℃，高压灭菌30min后使用

3．TE（pH8.0）

10mmol/LTris-Cl

1mmol/LEDTA，用10mol/LNaOH调pH8.0。

B.RNA电泳MOPS缓冲液（10X）：

200mmol/LMOPS（pH7.0）

20mmol/LNaOAC

10mmol/LEDTA（pH8.0）

C.杂交液20XSSC：

3mol/LNaCl

0.3mol/L柠檬酸钠.2H2O

浓盐酸调pH为7.0。

D.DEPC（diethylprocarbonate）水：

用超纯水配置1‰DEPC水。

处理24h后121℃，高压灭菌30min后使用

E.3M醋酸钠（sodiumacetate,pH5.2）用1‰DEPC水配制处理12h后121℃，高压灭菌30min后使用

F.8M氯化锂（Lithiumchloride,LiCl）用1‰DEPC水配制处理12h后121℃，高压灭菌30min后使用

实验三反转录合成第一链cDNA

逆转录-聚合酶链反应（ReverseTranscription-PolymeraseChainReaction，RT-PCR）的原理是：

提取组织或细胞中的总RNA，以其中的mRNA作为模板，采用Oligo（dT）或随机引物利用逆转录酶反转录成cDNA。

再以cDNA为模板进行PCR扩增，而获得目的基因或检测基因表达。

RT-PCR使RNA检测的灵敏性提高了几个数量级，使一些极为微量RNA样品分析成为可能。

该技术主要用于：

分析基因的转录产物、获取目的基因、合成cDNA探针、构建RNA高效转录系统。

一、反转录酶的选择

1．Money鼠白血病病毒（MMLV）反转录酶：

有强的聚合酶活性，RNA酶H活性相对较弱。

最适作用温度为37℃。

2．禽成髓细胞瘤病毒（AMV）反转录酶：

有强的聚合酶活性和RNA酶H活性。

最适作用温度为42℃。

3．Thermusthermophilus、Thermusflavus等嗜热微生物的热稳定性反转录酶：

在Mn2+存在下，允许高温反转录RNA，以消除RNA模板的二级结构。

4．MMLV反转录酶的RNaseH-突变体：

商品名为SuperScript和Super