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EHessentialhypertention原发性高血压

Glnglutamine谷酰胺

Gluglutamicacid谷氨酸

Glyglycine甘氨酸

HDLhighdensitylipoprotein高密度脂蛋白

LDLlow-densitylipoprotein低密度脂蛋白

PCRpolymerasechainreaction多聚酶链反应

RASrenninangiotensinsystem肾素血管紧张素系统

Rpmrevolutionsperminute转/分钟

SBPsystolicbloodpressure收缩压

SNPsinglenucleotidepolymorphism单核苷酸多态性

TCtotalcholesterol总胆固醇

TGtriglyceriede甘油三脂

TRIstrihydroxymethylaminomethane三羟甲基氨基甲烷

专业：

内科学（心血管病）研究生：

高丙峰导师：

刘兴德教授

摘要

目的：

探讨ACE基因I/D多态性和β2-AR基因Arg16Gly和Gln27Glu基因多态性与EH和EH+CH的关系，旨在从遗传学角度为EH和EH+CH的防治提供基础研究资料。

方法：

选取自2007年1月～2008年6月贵阳医学院附属医院住院EH和EH+CH的患者，分为EH和EH+CH两组。

EH组78例，其中男53例，女25例，年龄﹙65.80±

9.70﹚岁；

EH+CH组114例，其中男78例，女36例，平均年龄﹙66.40±

9.30﹚岁，均经头颅CT或MRI确诊。

全部患者的诊断符合中国高血压指南（2005年修订版）诊断标准（在未服抗高血压药的情况下，收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg）。

对照组62例，其中男41例，女21例，年龄﹙64.50±

9.90﹚岁,为我院门诊健康体检者。

受试者空腹12小时，抽取肘静脉血2ml,加入到2%EDTA抗凝的试管中。

运用分子生物学方法检测ACE基因I/D及β2-ARArg16Gly和Gln27Glu基因多态性。

结果

II、ID和DD基因型频率在对照组依次为40.32%、53.23%和6.45%，在EH组依次为26.92%、55.13%和17.95%，在EH+CH组依次为27.19%、55.26%和17.55%；

I和D等位基因频率在对照组依次为66.94%和33.06%，在EH组依次为54.49%和45.51%，在EH+CH组依次为54.82%和45.18%。

②与对照组比较，EH组和EH+CH组的DD基因型和D等位基因频率均显著增高，差异有显著性（P<

0.05），而EH组和EH+CH组间的DD基因型和D等位基因频率无显著性差异。

Arg16Arg、Arg16Gly和Gly16Gly基因型频率在对照组依次为9.68%、72.58%和17.74%，在EH组依次为6.41%、55.13%和38.46%，在EH+CH组依次为7.02%、54.39%和38.59%；

Arg和Gly等位基因频率在对照组依次为45.97%和54.03%，在EH组依次为33.97%和66.03%，在EH+CH组依次为34.21%和65.79%。

与对照组比较，EH组和EH+CH组的Gly16Gly基因型和Gly等位基因频率显著增高，差异有显著性（P<

0.05），而EH组和EH+CH组间的Gly16Gly基因型和Gly等位基因频率无显著性差异。

⑤Gln27Gln、Gln27Glu和Glu27Glu基因型频率在对照组依次为16.13%、70.97%和12.90%；

在EH组依次为17.95%、69.23%和12.82%；

在EH+CH组依次为24.56%、68.42%和7.02%；

Gln和Glu等位基因频率在对照组依次为50.00%和50.00%，在EH组依次为52.56%和47.44%，在EH+CH组依次为58.77%和41.23%。

⑥与对照组比较，EH组和EH+CH组的Gln27Gln、Gln27Glu和Glu27Glu基因型和Gln和Glu等位基因频率相应指标间比较无显著性差异，EH组和EH+CH组间上述相应指标间比较亦无显著性差异。

结论：

①ACE基因DD基因型可能是原发性高血压和高血压性脑出血的遗传易感基因。

②β2-AR基因Gly16Gly基因型可能是原发性高血压和高血压性脑出血的遗传易感基因。

③β2-ARGln27Glu多态性可能在原发性血压和高血压性脑出血的发病机制中不起主要作用。

关键词：

原发性高血压；

脑出血；

血管紧张素转换酶；

β2肾上腺素受体；

基因多态性

任向前导师：

郑克教授

前言

原发性血压是严重危害人类健康的主要疾病之一，它是导致脑卒中、冠心病、心功能不全、肾脏疾病的主要因素，患病率和死亡率逐年增高，其脑血管意外是我国原发性血压最常见的并发症，年发病率约为120～180/10万，其中脑出血是临床神经系统常见的急、危、重症，也是导致人类三大死亡原因之一。

高血压性脑出血具有发病快、死亡率高、病残率高、复发率高及恢复慢的特点，不管采取内科保守治疗还是外科手术治疗，到目前为止治疗效果总的来说还是不理想，病残率和致残率依然很高。

而高血压性脑出血已呈现出越来越明显的增加趋势，不断加剧的患病人数日益增长与防治措施相对无力之间的矛盾已引起医务人员的普遍关注。

寻求更好的治疗方法和途径已是迫在眉睫。

由于高血压是脑出血最危险、最重要的危险因素，控制高血压对防治脑出血至关重要[1]。

因高血压是脑出血最主要的危险因素，与血压水平或高血压相关的基因可能通过血压和其他途径在脑出血的发生、发展中起重要作用，故高血压相关基因日渐成为脑出血的重要候选基因。

原发性高血压是遗传因素和外界环境因素相互作用的结果，其中遗传因素的影响占30%～50%。

理论上，任何编码血压调节蛋白的基因都是原发性高血压的候选基因，其中肾素血管紧张素系统和肾上腺素受体相关基因成为研究所关注的热点。

本研究拟探讨ACE基因I/D及β2-ARArg16Gly和Gln27Glu基因多态性与原发性高血压和高血压性脑出血的关系，进一步研究原发性高血压和高血压性脑出血的分子遗传机制，为原发性高血压和高血压性脑出血的防治提供基础研究资料。

原发性高血压（essentialhypertension,EH）是一种严重危害人类健康的疾病，其发病是遗传和环境因素共同作用的结果。

肾素-血管紧张素系统（renin-angiotensinsystem，RAS）在高血压的发生和发展中起着重要作用，其相关基因也成为重要的高血压候选基因，其中对血管紧张素转换酶（angiotensinconvertingenzyme,ACE）基因插入/缺失（insertion/deletion，I/D）多态性的研究已成为近年来的热点之一。

本研究拟对原发性高血压和高血压性脑出血患者进行ACE基因I/D多态性分析，以探讨I/D基因多态性与EH和高血压性脑出血（essentialhypertension+cerebralhemorrhage,EH+CH）的关系，为EH和EH+CH的防治提供基础研究资料。

材料与方法

1研究对象

1.1EH组

入选患者均来源于贵州地区无血缘关系的汉族EH患者78例，其中男53例，女25例，年龄﹙65.80±

9.70﹚岁。

EH的诊断符合中国高血压指南（2005年修订版）诊断标准：

在未服抗高血压药的情况下，收缩压≥140mmHg和/或舒张压≥90mmHg。

并经病史、临床查体及实验室生化检查排除继发性高血压。

1.2EH+CH组

入选者均来源于贵州地区无血缘关系的汉族人，于2007年1月～2008年6月在贵阳医学院附属医院住院患者114例，其中男78例，女36例，平均年龄﹙66.40±

9.30﹚岁；

脑出血均为经头颅CT或MRI证实，继发性高血压所致脑出血患者除外。

1.3对照组

来自我院门诊体检的无血缘关系的贵州地区汉族人群共62例，其中男41例，女21例，年龄﹙64.50±

9.90﹚岁，三大常规、生化全项、X线胸片、心电图及腹部超声等指标均无异常。

并排除有高血压、糖尿病、冠心病病史者。

2仪器和试剂

2.1主要仪器和设备

名称型号产地或厂家

⑴梯度PCR扩增仪EppendoffAG德国

⑵稳压稳流电泳仪DYY-III2型北京六一仪器厂

⑶普通冷冻、冷藏冰箱美菱公司

⑷台式高速离心机TGL-16B上海安亭科学仪器厂

⑸台式低速离心机80-2上海医疗器械有限公司

⑹电热恒温水温箱HH.W21-420型江苏太仓市科教仪器厂

⑺电子分析天平JA1003上海精科天平

⑻凝胶图像分析系统UVPGD-8000美国

⑼紫外线透射分析仪VC-A2北京

⑽0754紫外分光光度仪普析通用公司

⑾微波炉WP800SL23中国顺德格兰仕电器厂

⑿震荡器AC-2太仓市科教仪器厂

⒀琼脂糖电泳槽Ⅲ-34A太仓市科教仪器厂

⒁微量移液器上海科华实验系统公司

⒂-80℃低温冰箱ULT-1386-3日本三洋公司

⒃实验室纯水系统RODI-50H-RE锐思捷科学仪器有限公司

⒄水平电泳槽DYY-III型北京六一仪器厂

2.2主要试剂配制或来源

（1）0.5×

TBE配制:

称取Tris碱5.4g,硼酸2.75g,吸取0.5mmol/LEDTA（PH=8.0）

2ml，溶解于约80mlddH2O中，混匀使完全溶解，加ddH2O定容至100ml，即为5×

TBE溶液，上液按1:

9体积加ddH2O即为0.5×

TBE缓冲液，转至试剂瓶中备用

（2）TE（PH=8.0）[10mmol/LTris-HCl（PH=8.0）,1mmol/LEDTA（PH=8.0）]

配制100mlTE,需于80mlddH2O中加入1mmol/LTris-HCl（PH=8.0）1ml,0.5mmol/LEDTA（PH=8.0）0.2ml。

混匀后加ddH2O定容至100ml，转至试剂瓶中，以1.034×

105Pa高压蒸气灭菌15min后4℃保存备用。

（3）氯仿:

异戊醇（V:

V=24:

1）配制氯仿：

异戊醇100ml，需氯仿96ml、异戊醇4ml，混匀后转入棕色试剂瓶中4℃保存。

（4）70％乙醇：

取无水乙醇70ml，加ddH2O定容至100ml，转至试剂瓶中4℃保存备用。

（5）STE[0.1mmol/LNaCl,10mmol/LTris-HCl（PH=8.0）1mmol/LEDTA（PH=8.0）]：

配制100mlSTE，需于80mlddH2O中加入NaCl0.585g,1mmol/LTris-HCl（PH=8.0）1ml,0.5mmol/LEDTA（PH=8.0）0.2ml,混匀后加ddH2O定容至100ml，转至试剂瓶中，以1.034×

（6）10%SDS溶液（PH=7.2）称取SDS10g，溶解于约70mlddH2O中，加热至68℃助溶。

用数滴浓HCl或1mmol/LHCl调节PH至7.2（室温状态下用PH计测定），加ddH2O定容至100ml转至试剂瓶中备用。

（7）引物100mmol/L上海捷瑞生物工程有限公司

（8）dNTP10nmol/L　天根生化科技（北京）有限公司

（9）D2000DNAMarker300ul/支　天根生化科技（北京）有限公司

（10）TaqDNApolymerase2.5u/ul　天根生化科技（北京）有限公司

（11）Tris-饱和酚：

PH8.0　　上海试剂三厂

（12）无水乙醇　上海振兴化工一厂

（13）乙二胺四乙酸（EDTA）　Sigma公司（美国）

（14）SDS　　天根生化科技（北京）有限公司

（15）蛋白酶K　　　　　　　10mg/ml　天根生化科技（北京）有限公司

（16）溴化乙锭（EB）　　　　　10mg/ml上海试剂三厂

（17）氯仿　上海振兴化工一厂

（18）琼脂糖　西班牙进口

（19）液体石蜡　上海试剂三厂

（20）三羟甲基氨基甲烷（Tris）　瑞星科技有限公司

（21）硼酸　上海云岭化工厂

（22）溴酚蓝　天津市化学试剂一厂

3试验方法

3.1标本采集：

受试者空腹12h，抽取肘静脉血2ml,加入到一2%EDTA抗凝的试管，分离出血浆检测血脂；

白细胞-70℃冰冻保存用于提取DNA。

休息时坐位测量肘部血压，脱去鞋帽只穿内衣测量身高、体重，计算体重指数（BMI）＝体重（Kg）/身高（m2）。

3.2实验室检测

采用氧化酶法测定包括血清总胆固醇（TC）、甘油三脂（TG）、低密度脂蛋白胆固醇（LDL-C）、高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）等指标。

以上指标均经全自动生化分析仪测定，表示单位为mmol/L。

3.3ACE基因提取、扩增

3.3.1经典微量法分离提取DNA

操作步骤：

2mlEDTA抗凝冷冻全血于玻璃试管内加双蒸水配平，管盖顶处标号

↓

4000r/m离心5min

↓

弃上清，加入ddH2O，上下颠倒混匀，反复洗涤4000r/m离心5min至淡红色

最后一次尽量去上清，1.0～1.5ml沉淀转入2mlEpp管内，加双蒸水至2ml

弃上清，再加ddH2O至2ml重悬白细胞沉淀，上下颠倒混匀

4000rpm离心5min×

2

弃上清（留至250ul～300ul），加STE溶液至0.5ml，上下颠倒混匀

加10%SDS溶液50ul，10mg/ml蛋白酶K液10ul，上下颠倒混匀

37℃恒温水浴温和振荡或静止过夜

次日，白细胞彻底消化（指无可见的沉淀块）后，取出

加入等体积饱和酚（约600ul），充分混匀2min

12000rpm离心5min

小心吸出上清，转入另一无菌Epp管中，管盖顶处编号

300ul饱和酚，300ul氯仿:

异戊醇，吸上清500ul，转入另一无菌Epp管中

加入500ul氯仿:

异戊醇，充分混匀2min

小心吸出上清300ul分别置另两1.5mlEpp管中分装，管盖顶处编号

加30ul3mol/LNAAC

再加入1000ul的无水乙醇，缓慢摇动即可见DNA丝状物

弃上清，沉淀用1ml70%乙醇洗涤×

2，每次8000rpm离心3～5min

取其中一管用DNA抽干机抽干乙醇或室温风干沉淀

用100ulTE溶液溶解DNA沉淀

3.3.2DNA的鉴定

（1）取5ul完全溶解的DNA加去离子水至500ul，混匀，转移到比色杯中；

（2）用紫外分光光度计比色，波长分别置于260nm与280nm,记录光密度（值）,OD260的读数用于计算核酸的浓度，OD260与OD280的比值代表DNA的纯度；

（3）1OD260值相当于50ug/mlDNA,DNA的含量计算公式为OD260×

50ug/ml×

100（稀释倍数）

（4）DNA的纯度=OD260/OD280；

若比值小于1.6，表明DNA样品中含有蛋白质，需重新纯化；

若比值大于2.0，表明DNA样品中含有RNA,可用RNA酶进行处理。

本实验提取的DNA的纯度在1.7～1.9之间。

3.3.3PCR扩增DNA

（1）引物设计参照VolkerHerrmann的研究结果[2]，并与GeneBank核对,ACE基因的扩增：

按Rigat方法[3]进行。

PCR引物序列（上海生工合成）

引物1:

5ˊ-CTGGAGACCACTCCCATCCTTTCT-3ˊ

引物2:

5ˊ-GATGTGGCCATCACATTCGTCACA-3ˊ

使用Eppendorf梯度PCR扩增仪进行扩增。

（2）25ulPCR反应体系：

PCR反应体积25ul,包含无菌双蒸水16ul,10×

PCR缓冲液2.5ul,25mmol/L氯化镁2.0ul，2.5mmol/L4种dNTP2.0ul,上下游引物﹙10mmol/L﹚各0.5ul，样本DNA1.0ul，TaqDNA聚合酶﹙2.5u/ul﹚0.5ul。

3.3.4扩增反应条件：

PCR反应条件为94℃预变性5min,94℃变性45s,55℃退火50s,72℃延伸55s,共循环30周期，72℃最后一次延伸7min终止扩增。

3.3.5PCR扩增产物鉴定

电泳分离：

取6ulPCR扩增产物与6×

加样缓冲液2.5ul混匀后，加样于2％琼脂糖凝胶（含1ug/ml溴化乙锭），其中第一点样孔内加D20004.5ul作为对照,扩增产物依次加样后电泳，电压为160V，电泳时间30min，在紫外线灯下及凝胶成像分析仪（UVP）下鉴定PCR扩增产物电泳条带。

3.4结果分析

统计ACE基因PCR扩增产物电泳条带ACE基因PCR扩增出现两种DNA片段：

一种是490bp的DNA片段，为插入型（I型）；

另一种是190bp的DNA片段，为缺失型（D型）。

在群体中有II、ID及DD三种基因型。

II型纯合子个体只出现490bp片段，DD型纯合子个体只有190bp片段,ID型杂合子个体同时具有490bp和190bp片段。

根据条带，确定各基因型的具体例数，鉴定ACE基因I/D多态性。

4统计学处理

4.1通过凝胶电泳结果判读个体基因型，计算各组样本基因型频率，等位基因频率计算采用平衡法：

A=AA+1/2AC；

C=CC+1/2AC。

4.2所有数据均以均数±

标准差表示（

±

s），两组间等位基因频率和基因型的比较采用χ2检验，两组间均数比较采用单因素方差分析，P<

0.05认为有显著性差异。

以上资料统计学处理，在SPSS11.5软件包中进行。

结果

1.EH组和EH+CH组的一般情况

EH组和EH+CH组的一般情况见表1。

表1EH组和EH+CH组的一般情况（

s）

Tab1ThegeneralinformationofthepatientswithEHandEH+CH（

项目

EH（n=78）

EH+CH（n=114）

对照组（n=62）

Age（Y）

65.80±

9.70

66.40±

9.30

64.50±

9.90

sex（F/M）

25/53

36/78

21/41

BMI（Kg/m2）

22.90±

3.24

23.85±

2.84

23.58±

2.29

SBP（mmHg）

158.45±

17.30*

159.70±

16.20*

119.00±

10.00

DBP（mmHg）

96.00±

12.30*

97.00±

11.20*

73.00±

8.00

TC（mmol/L）

4.89±

1.26

4.95±

1.06

4.96±

0.97

TG（mmol/L）

1.68±

0.82

1.69±

0.71

1.66±

0.63

LDL-C（mmol/L）

2.22±

0.85

2.20±

0.87

2.10±

0.83

HDL-C（mmol/L）

1.14±

0.35

1.15±

0.34

1.21±

0.38

注：

与对照组比较，*P＜0.05。

Age：

年龄；

Y：

岁；

sex：

性别；

F：

女性；

M：

男性；

BMI：

体重指数；

SBP：

收缩压；

DBP：

舒张压；

TC：

总胆固醇；

TG：

甘油三酯；

LDL-C：

低密度脂蛋白；

HDL-C：

高密度脂蛋白

由表1可见，与对照组比较，EH组和EH合并CH组的血压显著增高，差异有显著性（P<

0.05），而性别构成、年龄、体重指数、总胆固醇、甘油三酯、高密度脂蛋白、低密度脂蛋白均无显著性差异；

EH组和EH合并CH组两组间的上述指标比较亦无显著性差异。

2.ACE基因I/D多态性的电泳结果

ACE基因I/D多态性的电泳结果见图1。

1：

marker;

2、3：

ID基因型；

4、6：

DD基因