酶工程 复习资料Word文档格式.docx

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第二章

经过预先设计，通过人工操作，利用微生物的生命活动获得所需要的酶的技术过程，称为酶的发酵生产。

酶的发酵生产是当今产酶的主要方法，因为微生物具有种类多、繁殖快、易培养、代谢能力强等特点。

1.试述酶生物合成的基本过程。

a．RNA的生物合成——转录：

转录的起始、RNA链的延伸、转录的终止、RNA前体加工成为成熟的

RNA分子。

b．蛋白质的生物合成——翻译：

氨基酸活化生成氨酰-tRNA、肽链合成的起始、肽链的延伸、肽链合

成的终止、蛋白质前体加工修饰成具有特定空间结构的功能蛋白。

2.何谓酶生物合成的诱导作用是简述其原理。

加入某些物质使酶的生物合成开始或加速进行的现象，称为酶生物合成的诱导作用。

原理：

当无诱导物存在时，调节基因产生的阻遏蛋白与操纵基因结合，覆盖RNA聚合酶的结合部位，RNA聚合酶无法与启动基因结合，结构基因无法转录，酶合成受受阻。

当诱导物存在时，其与阻遏蛋白结合，使阻遏蛋白构象发生改变而降低与操纵基因的结合能力，RNA聚合酶与启动基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以表达。

3.什么是酶生物合成的反馈阻遏作用试简述其原理。

酶生物合成反馈阻遏作用指酶催化反应的产物或代谢途径的末端产物使酶的生物合成受到阻遏。

无阻遏物存在时，调节基因产物阻遏蛋白无法与操纵基因结合，结构基因正常转录，相应酶得以正常表达。

当阻遏物存在时，其与阻遏蛋白结合使之空间构象发生改变，阻遏蛋白与操纵基因结合，抑制RNA聚合酶与启动基因的结合，下游结构基因转录受阻，酶无法正常表达。

4.简述分解代谢的阻遏作用的原理及解除方法。

分解代谢阻遏之所产生，是因为细胞内某些物质经分解代谢产生ATP，ATP则是由ADP和AMP经磷酸化转变而来，ATP合成，即意味着胞内ADP、AMP浓度下降，cAMP通过水解作用以补充胞内AMP浓度，故胞内cAMP浓度下降。

同时腺苷酸环化酶活性降低，cAMP合成受阻，致使胞内cAMP浓度进一步降低。

故而cAMP-CAP复合物浓度随之降低，启动基因特定部位无足够cAMP-CAP复合物与之结合从而抑制了RNA聚合酶与启动基因的结合，结构基因无法表达，酶合成受阻。

解除方法：

在培养环境中控制某种易降解物质的量，或在必要时添加适量的cAMP。

5.酶的生物合成有哪几种模式同步合成型、延续合成型、中期合成型、滞后合成型。

6、如何控制微生物发酵产酶的工艺条件a．保藏的菌种用于生产之前要通过细胞活化使细胞的生命活力得以恢复；

b.根据不同细胞和不同用途的不同要求配置各营养组分适宜的培养基；

c.根据不同菌种、不同产物、不同工艺条件等不同情况调节培养基pH、温度、溶解氧量使之处于适宜状态。

7．提高酶产量的措施主要有哪些

添加诱导物、控制阻遏物浓度、添加表面活性剂、添加产酶促进剂。

10.简述固定化微生物细胞发酵产酶的特点

提高产酶；

可以反复使用或连续使用较长时间；

基因工程菌的质粒稳定、不易丢失；

发酵稳定性好；

缩短发酵周期，提高设备利用率；

产品容易分离纯化；

适于胞外酶等胞外产物的生产。

11.固定化微生物原生质体发酵产酶有何特点

变胞内产物为胞外产物；

提高产酶率；

稳定性较好；

易于分离纯化。

第三章

动植物细胞培养产酶2，何为抗体酶试述获得抗体酶的主要方法。

答：

抗体酶又称为催化性抗体，是一类具有生物催化功能的抗体分子。

1）半抗原诱导法。

以预先设计的过渡态类似物作为半抗原，与载体蛋白（如牛血清蛋白）偶联制成抗原，然后免疫动物，再经过单克隆抗体制备技术制备，分离，筛选得到所需的抗体酶。

2）酶蛋白诱导法。

是以某种酶蛋白作为抗原诱导抗体酶产生的方法。

首先选定一种酶蛋白作为抗原来免疫某种动物，在酶蛋白抗原的诱导下，动物体内产生与酶分子特异结合的抗体；

再将获得的酶抗体来免疫该动物，并采用单克隆抗体制备技术制备得到与酶抗体特异结合的抗抗体。

那么抗抗体结合部位的构象与用作抗原的酶分子的结合中心的构象相同。

对抗抗体进行筛选，就有可能获得具有催化活性的抗体酶。

3，植物细胞培养产酶有何特点答：

1）产率高。

2）生产周期（与完整植株相比较）短，一般为15~30天。

3）易于管理，减轻劳动强度。

4）提高产品质量。

5）其他：

对剪切力敏感，生产周期长，许多植物细胞的生长和代谢需要一定的光照。

5，试述植物细胞产酶的工艺条件及其控制。

1）温度的控制。

一般为25度左右。

通常不高于35度，不低于20度。

2）PH的控制。

一般为~。

通常介于~的微酸性范围。

3）溶解氧的调节控制。

一般通过通风和搅拌来供给。

不能太强烈，以免破坏细胞。

4）光照的控制。

根据植物细胞的特性及目标次级代谢物的种类不同，进行光照的调控。

5）前体的添加。

为提高次级代谢物产量在培养过程中添加目的代谢物的前体。

6）刺激剂的应用。

促使植物细胞的物质代谢朝着生成某些次级代谢物的方向进行，强化次级代谢物的生物合成，提高某些次级代谢物的产率。

6，动物细胞培养过程中要注意控制哪些工艺条件答：

1）温度。

一般在度，允许波动范围在度之内。

2）PH。

一般在条件下生长最好，通常在~的微碱性范围内。

3）渗透压。

一般在700~850kPa范围内。

4）溶解氧。

一般通过调节进入反应器的混合气体的量及其比例调控溶解氧。

混合气体由空气，氧气，氮气，二氧化碳四种气体组成。

二氧化碳兼有调节供氧和调节PH的双重作用。

7，举例说明动物细胞产酶的工艺过程。

以生产组织纤溶酶原活化剂为例：

1）配制人黑色素瘤细胞培养基。

2）人黑色素瘤细胞培养：

A将人黑色素瘤的种质细胞用胰蛋白酶消化处理，细胞分散后，用的磷酸缓冲液洗涤，计数，稀释成细胞悬浮液；

B在消毒好的反应器中装进一定量的培养液，将上述细胞悬浮液接种至反应器中，接种浓度为1000~3000个细胞/ml，于37度的CO2培养箱中，通入含5%CO2的无菌空气，培养至长成单层致密细胞；

C倾去培养液，用的磷酸缓冲液洗涤细胞2~3次；

D换入一定量的无血清Eagle培养液，继续培养；

E每隔3~4天，取出培养液进行tPA（组织纤溶酶原活化剂）的分离纯化；

F再向反应器中加入新鲜的无血清Eagle培养液，继续培养，以获得大量tPA。

3）组织纤溶酶原活化剂的分离纯化。

在获得的上述培养液中加入一定量的蛋白酶抑制剂和表面活性剂，过滤去沉淀，适当稀释后，采用亲和层系技术进行分离，得到tPA溶液。

经过浓缩，葡聚糖G-150凝胶层次，冷冻干燥，得到精制tPA干粉。

第四章

1细胞破碎的方法：

机械破碎法通过机械运动产生剪切力，使组织细胞破碎物理破碎法通过各种物理因素，使组织细胞的外层结构破坏，而使细胞破碎化学~通过各种化学试剂对细胞膜的作用，从而使细胞破碎

酶促~通过细胞本身的酶系或外加酶制剂的催化作用，使细胞外层结构受到破坏，从而达到细胞破碎2.酶提取主要方法：

盐溶液提取酸~碱~有机溶剂提取3酶沉淀分离方法的原理P-91表4-3

特点：

盐析法主要用于蛋白类酶的分离纯化，盐析时，温度一般维持室温，对温度敏感的酶应低

温条件，溶液的PH应调到欲分离的酶等电点附近

等电点主要用于从粗酶液中除去某些等电点相距较大的杂蛋白。

加酸或加碱的过程中，要一边搅

拌一边慢慢加，以防局部过酸或过碱，引起酶变性失活。

有机溶剂分离效果受溶液PH的影响。

该方法比盐析法洗出的沉淀易于离心或过滤分离，不含无

极盐，分辨率也高，但容易引起酶变性失活，所以必须在低温条件下操作，而且沉淀析出后要尽快分离，减少有机溶剂对酶的影响

复合`~复合沉淀剂与酶形成复合物，溶解度降低选择性~对酶没有明显影响

4膜分离技术借助一定孔径的高分子膜，将不同大小不同形状不同特征的物质颗粒或分子进行分离

的技术称为~

应用超滤蛋白质除盐浓缩及分离纯化

反渗透海水淡化电场膜分离：

脱盐海水淡化纯水制备，从发酵液中分离柠檬酸，谷氨酸及

凝胶电洗脱。

5超临界萃取又称超临界流体萃取，是利用欲分离物质与杂质在超临界流体中溶解度不同而达到分离

的一种萃取技术特点P-129

双水相萃取利用溶质在两个互不相溶的水相中溶解度不同而达到分离特点P-128影响因素第3段6离子交换层析利用离子交换剂的可解离集团对各种离子的亲和力不同而达到分离目的一种层析分

离方法。

要点离子交换剂的选择处理装柱上柱洗脱和收集再生

亲和层析利用生物分子与配基之间所具有的可逆亲和力，使生物分子分离纯化的技术控制好温度PH等条件，以免酶失活母体和配基的偶联结合

凝胶层析利用流动相中所含各种组分的相对分子质量不同而达到物质分离的一种层析技术操作

要点制备胶时，防止气泡产生，为此将各种所需比例的贮存液混合以后，应该抽气处理2洗脱液体积一般为凝胶床体积的120%3上柱体积为凝胶床10%，不得超过30%凝胶的选择与处理装柱上柱洗脱

7连续凝胶电泳：

只用一层凝胶，采用相同的PH和相同的缓冲液

不连续凝胶电泳：

采用2或3层性质不同的凝胶重叠起来使用，采用2中不同的PH和不同缓冲液，

能使浓度较低的各种组分在电泳过程中浓缩成层，从而提高分辨率

梯度连续凝胶电泳：

采用自上而下浓度逐渐升高，孔径逐渐减小的梯度凝胶电泳。

主要测定球类蛋白

质的分子质量

SDS-凝胶电泳巯基乙醇能使蛋白质分子中二硫键还原，SDS能使蛋白质分子的请柬，疏水键打开，并

与蛋白质分子结合。

为此，蛋白质—SDS复合物迁移速率不再受蛋白质原有电荷及分子形状影响，只取决于蛋白质相对分子质量。

8酶结晶方法盐析~有机溶剂~透析平衡~等电点~温度差~金属离子复合~

9技术：

细胞破碎提取细心分离过滤与膜分离沉淀分离层析分离电泳分离萃取分离浓缩干燥结晶

第五章——酶的分子修饰

1，试述酶分子修饰的概念和作用

答：

概念：

通过各种方法使酶分子的结构发生某些改变从而改变酶的催化活性的技术过程。

作用：

酶的分子结构发生某些合理改变有可能提高酶的催化效率，增加酶的稳定性，降低或消除酶的抗原性，改变酶的底物专一性。

同时在酶学和酶工程研究方面具有重要的意义。

2，何谓金属离子置换修饰简述其主要修饰过程和作用

把酶分子中的金属离子换成另一种金属离子使酶的催化特性发生改变的修饰方法。

过程：

酶的分离纯化，除去原有的金属离子，加入置换离子

1，阐明金属离子对酶的催化作用的影响2，提高酶的催化效率3，增强酶的稳定性4，改变酶的动力学特性

3，何谓大分子结合修饰有何作用

采用水溶性大分子与酶的侧链基团共价结合，使酶的分子空间构象发生改变，从而改变酶的催化特性的方法。

1，通过修饰提高酶的催化效率2，增强酶的稳定性3，通过修饰降低或消除酶蛋白的抗原性4，简述定点突变技术的主要技术过程及其在酶分子修饰中的应用

定点突变：

指在DNA序列中的某一特定位点上进行碱基的改变，从而获得突变基因的操作技术过程：

1，新酶分子结构的设计

2，突变基因碱基序列的确定3，突变基因的获得4，新酶的获得

应用：

定点突变技术为氨基酸置换修饰和核苷酸置换修饰提供了先进可靠行之有效的手段。

抗体酶：

是一类具有催化功能的抗体

第六章

1953年德国的格鲁布霍费（Grubhofer）和施莱恩（Schleith）采用聚氨基苯乙烯树脂为载体，经重氮化法活化后，分别与羧肽酶，淀粉酶，胃蛋白酶，核糖核酸酶等结合而制成固化酶。

固定化酶是指固定在一定载体上并在一定空间范围内进行催化反应的酶。

固定化方法：

吸附法，包埋法，结合法，交联法和热处理法等。

吸附法：

利用各种固体吸附将酶或含酶菌体吸附在其表面上，而使酶固定化的方法称为物理吸附法，简称吸附法。

包埋法：

将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定的方法。

包括凝胶包埋法和半透膜包埋法。

结合法：

选择适宜的载体，使之通过共价键或离子键与酶结合在一起的固定方法称为结合法。

交联法：

借助双功能试剂使酶分子之间发生交联作用，生成网状结构的固定化酶法称为交联法。

热处理法：

将含酶细胞在一定温度下加热处理一段时间，使酶固定在菌体内而制备得到固定化酶的方法。

（只适应热稳定性较好的酶的固定化）固化酶特性：

1.稳定性

（1）热稳定性提高

（2）保存稳定性好（3）对蛋白酶的抵抗性增强不易被蛋白酶水解（4）对

变性剂的耐受性提高

2.最适温度与游离酶差不多，活化能变化不大，部分固化酶最适温度与游离酶相比，有明显变化。

3.最适PH影响固化酶PH因素主要有两个

（1）载体带电性质，明显影响。

（2）产物性质对最适PH影响，

有一定影响

4.底物特异性不同于游离酶，其变化与底物分子质量的大小有一定关系。

固化酶应用：

工业产业，医药，食品，轻工，分析，环保，能源和科学研究

通过各种方法将细胞固定在水不溶性的载体上，纸杯固定化细胞的过程称为细胞固定化。

提高产率，增加稳定性，利于分离纯化，提高产品质量。

固定化微生物细胞应用：

发酵和制成微生物电极固定化植物细胞：

人工种子，生产色素，香精固定化动物细胞：

生产疫苗

第七章

1.简述酶非水相催化的概念与特点

酶在非水介质中的催化作用称为酶的非水相催化。

它是通过改变反应介质，影响酶的表面结构和活性中心，从而改变酶的催化特性。

主要内容包括有机介质中的酶催化，气相介质中的酶催化，超临界流体介质中的酶催化和离子液介质中的酶催化等。

由于在非水相介质中酶分子受到非水介质的影响，起催化特性与在水相中的有较大的不同。

酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中有显着地提高，而且催化时，酶的底物特异性、立体选择性、区域选择性、键的选择性和热稳定性都有所改变，同时酶在离子液中的催化作用具有良好的稳定性和区域选择性、立体选择性、键的选择性等显着特点。

2.酶在有机溶剂介质中与在水溶液中的特性有何改变

⑴底物专一性：

酶在水溶液中进行催化反应时，具有高度的底物专一性，或称为底物特异性，是酶催化反应的显着特点之一。

在有机介质中，由于酶分子活性中心的结合部位与底物之间的结合状态发生了某些变化，致使酶的底物特异性发生改变。

⑵对称体选择性：

酶在有机介质中催化，由于介质的特性发生改变，从而引起酶的对称体选择性也发生改变。

酶在水溶液中催化的立体选择性较强，而在疏水性强的有机

介质中，酶的立体选择性较差。

⑶区域选择性：

酶在有机介质中进行催化时，具有区域选择性，即酶能够选择底物分子中某一区域的基团优先进行反应。

⑷键选择性：

在同一个底物分子中有两种以上的化学键都可以与酶反应时，酶对其中一种化学键优先进行反应。

⑸热稳定性：

许多酶在有机介质中的热稳定性比在水溶液中的热稳定性更好。

在有机介质中，酶的热稳定性之所以增强，可能是由于有机介质中缺少引起酶分子变性失活的水分子所致。

⑹PH特性：

在水溶液中，缓冲液的PH决定了酶分子活性中心基团的解离状态和底物分子的解离状态，从而影响酶与底物的结合和催化反应。

在有机介质反应中，酶所处的PH环境与酶在冻干或吸附到载体上之前所用的缓冲液PH相同（这种现象称为PH印记或PH记忆）。

酶在有机介质中催化反应的最适PH通常与酶在水溶液中反应的最适PH接近或者相同。

3.什么是必需水和水活度水对非水相中酶的特性有何影响

必需水：

维持酶分子完整的空间构象所必需的最低水量称为必需水。

水活度（Aw）：

是指体系中水的逸度与纯水逸度之比。

通常可以用体系中水的蒸汽压与相同条件下纯水的蒸汽压之比表示。

即Aw=P/P0式中，P为在一定条件下体系中水的蒸汽压；

P0为在相同条件下纯水的蒸汽压。

影响：

⑴水对酶分子空间构象的影响：

酶分子只有在空间构象完整的状态下，才具有催化功能。

在无水的条件下，酶的空间构象被破坏，酶将变性失活。

所以，酶分子需要一层水化层，以维持其完整的空间构象。

⑵水对酶催化反应速度的影响：

有机介质中水的含量对酶催化反应速度有显着影响。

有的酶在水含量较低的条件下，酶的催化反应速度随水含量的增高而升高。

在催化反应速度达到最大时的水含量称为最适水含量。

⑶在有机介质体系中，酶的催化活性会随着结合水量的增加而提高。

在结合水量不变的条件下，体系中水含量的变化对酶的催化活性影响不大。

4.有机溶剂对酶催化有何影响

⑴有机溶剂对酶结构与功能的影响：

有机溶剂对酶分子表面结构的影响；

有机溶剂对酶活性中心结合位点的影响，主要是通过有机溶剂与底物竞争活性中心的结合位点，降低底物的结合能力，从而影响酶的催化活性。

⑵有机溶剂对酶活性的影响：

极性较强的有机溶剂会夺取酶分子的结合水，影响酶分子微环境的水化层，从而降低酶的催化活性，甚至引起酶的变性失活。

⑶有机溶剂对底物和产物分配的影响：

有机溶剂极性过大或过小都会影响底物的浓度从而影响酶的催化速度。

5.如何控制有机介质中酶催化反应的条件

⑴对酶的选择不但要看催化反应速度的大小，还要特别注意酶的稳定性、底物专一性、对映体选择性、区域选择性、键选择性等⑵底物的选择和浓度控制：

根据酶在所使用的有机介质中的专一性选择适宜的底物并且使底物浓度持续维持在一定的浓度范围内。

酶在有机介质中进行催化时，要考虑底物在有机溶剂和必需水层中的分配情况。

⑶有机溶剂的选择：

它的极性选择要恰当，不能过强或过弱。

⑷水含量的控制：

使反应体系保持在最适水含量。

⑸温度控制：

最好在最适温度。

⑹PH的控制：

保持在最适PH，可以通过调节缓冲溶液的PH和离子强度的方法对有机介质中酶催化的PH和离子强度进行调节控制。

6.举例说明酶非水相催化的应用

⑴手性药物的拆分⑵手性高分子聚合物的制备⑶酚树脂的合成⑷导电有机聚合物的合成⑸发光有机聚合物的合成⑹食品添加剂的生产⑺生物柴油的生产⑻多肽的合成⑼甾体转化

知识点：

（1）酶可以在水与有机溶剂的互溶体系中进行催化反应；

也可以在水和有机溶剂组成的双液相体系中进行催化反应；

还可以在只含有微量水的有机介质，又称为微水介质中进行催化反应。

（2）非水酶学就是酶非水相催化。

（3）酶的非水相催化≠酶在有机介质中的催化。

（4）在酶的非水相催化中，研究最多的非水介质是有机溶剂。

有机介质中的酶催化是指酶在含有一定量水的有机溶剂中进行的催化反应。

适用于底物、产物两者或其中之一为疏水性物质的酶催化作用。

（5）有机介质体系包括：

（1）微水介质体系

（2）与水溶性有机溶剂组成的均一体系（3）与水不溶性有机溶剂组成的两相或体系（4）正胶束体系（5）反胶束体系。

微水介质体系是由有机溶剂和微量的水组成的反应体系，是在有机介质酶催化中广泛应用的一种反应体系。

通常所说的有机介质反应体系主要是指微水介质体系。

能在与水溶性有机溶剂组成的均一体系中进行催化反应的酶较少。

胶束又称为正胶束或正胶团，是在大量水溶液中含有少量与水不相混溶的有机溶剂，加入表面活性剂后形成的水包油的微小液滴。

表面活性剂的极性端朝外，，非极性端朝内，有机溶剂被包在液滴内部。

反胶束又称为反胶团，是指在大量与水不相混溶的有机溶剂中，含有少量的水溶液，加入表面活性剂后形成的油包水的微小液滴。

表面活性剂的极性端朝内，，非极性端朝外，水溶液包在胶束内部。

不管采用何种有机介质反应体系，酶催化反应的介质中都含有有机溶剂和一定量的水。

（6）在有机介质中，脂肪酶可以催化油脂与甲醇的酯交换反应，生成生物柴油。

第八章酶定向进化

思考题

1.酶定向进化:

是模拟自然进化的过程，在体外进行酶基因的人工随机突变，建立突变基因文库，在人工控制条件的特殊环境下，定向选择得到具有优良催化特性酶的突变体的技术过程。

酶定向进化的特点：

1适应面广、目的性强、效果显着。

酶定向进化的基本过程包括随机突变、构建突变基因文库、酶突变基因的定向选择等步骤。

2.易错PCR是在采用DNA聚合酶进行目的基因扩增时，通过调整反应条件，如提高镁离子浓度、加入锰离子、改变体系中四种的dNTPs浓度或运用低保真度DNA聚合酶等，增加碱基配对错误的出现频率，而引起基因突变。

通常，经一次突变的基因很难获得满意的结果，由此可以采反复多次易错PCR方法。

即将一次易错PCR扩增得到的正突变基因作为下一次易错的模板，在进行易错PCR,如此反复进行，直至获得较为满意的结果为止。

重排技术是从正基因突变文库中分离得到的同源DNA,用酶切割成随机片段，经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列重新排布而引起基因突变的技术过程。

DNA重排技术将两条或多条正突变基因通过脱氧核糖核酸酶等酶的作用，随机切割成若干DNA片段，然后将这些随机片段在不加引物的条件下经过多次PCR循环，使这些DNA随机片段互为模板和引物进行扩增、延伸，再加入适宜的引物进行PCR反应，获得全长的基因。

经过一次DNA重排获得的突变基因往往未能达到人们的要求，为此，需要经过构建突变文库和筛选的过程，获得的正突变基因在反复经过上述步骤，直到获得所需的突变基因为止。

4.基因家族重排技术：

是从基因家族的若干同源基因出发，用酶切割成随机片段，将经过不加引物的多次PCR循环，使DNA的碱基序列发生重新排布而引起基因突变的技术过程。

基因家族重排技术与DNA重排技术的基本过程大致相同，都要经过基因的随机切割、无引物PCR等步骤以获得突变基因，然后通过构建突变基因文库、采用高通量筛选技术筛选获得正突变基因。

基因家族重排技术与DNA重排技术的主要不同点在于前者从基因家族的若干同源基因出发进行DNA序列的重新排布，而后者则从采用易错PCR等技术所获得的两个以上的正突变基因出发进行DNA序列的重新排布。

其他内容：

体外随机突变的技术主要有：

易错PCR技术、DNA重排技术、基因家族重排技术。

易错PCR技术所引起的基因突变和遗传进化仅在单一分子内发生，所以属于无性进化。

DNA重排技术将存在于两种或多种不同基因中的正突变结合在一起，通过DNA碱基序列的重新排布，形成新的突变基因，属于用性进化。

突变基因文库的构建是将各种不同的突变基因与载体重组，再转入适宜的细胞或包装成重组λ噬菌体的技术过程。

构建突变基因文库的过程主要包括载体的选择、基