高效液相色谱基线地各种问题汇总情况Word文档格式.docx
《高效液相色谱基线地各种问题汇总情况Word文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《高效液相色谱基线地各种问题汇总情况Word文档格式.docx（18页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
9、使用循环溶剂，但检测器未调整。
9、重新设定基线。
当检测器动力学范围发生变化时，使用新的流动相。
10、检测器没有设定在最大吸收波长处。
10、将波长调整至最大吸收波长处
M、基线噪音（规则的）
1、在流动相、检测器或泵中有空气
1、流动相脱气。
冲洗系统以除去检测器或泵中的空气。
2、漏液图2、见第三部分。
检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换泵密封。
3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）
4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备
5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器
N、基线噪音（不规则的）
1、漏液图1、见第三部分。
检查接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
如有必要，更换密封。
检查流通池是否漏液。
2、流动相污染、变质或由低质溶剂配成
2、检查流动相的组成。
3、流动相各溶剂不相溶3、选择互溶的流动相
4、检测器/记录仪电子元件的问题
4、断开检测器和记录仪的电源，检查并更正。
5、系统内有气泡5、用强极性溶液清洗系统
6、检测器内有气泡6、清洗检测器，在检测器后面安装背景压力调节器
7、流通池污染（即使是极少的污染物也会产生噪音。
7、用1N的硝酸（不能用磷酸）清洗流通池
8、检测器灯能量不足8、更换灯
9、色谱柱填料流失或阻塞9、更换色谱柱
10、流动相混合不均匀或混合器工作不正常
10、维修或更换混合器，在流动相不走梯度时，建议不使用泵的混合装置
O、宽峰
1、流动相组成变化1、重新制备新的流动相
2、流动相流速太低2、调节流速
3、漏液（特别是在柱子和检测器之间）
3、见section3。
检查接头是否松动、泵是否漏液、是否有盐析出以及不正常的噪音。
如果必要更换密封。
4、检测器设定不正确4、调整设定
5、柱外效应影响
a、柱子过载
b、检测器对反应时间或池体积响应过大
c、柱子与检测器之间的管路太长或管路内径太大
d、记录仪响应时间太长
5、a、小体积进样（例如：
10ul而不是100ul）以1：
10或1：
100的比例稀释样品
b、减少响应时间或使用更小的流通池
c、使用内径为0.007-0.01的短管路
d、减少响应时间
6、缓冲液浓度太低6、增加浓度
7、保护柱污染或失效7、更换保护柱
8、更换同样类型的色谱柱。
如果新柱子可以提供对称的色谱峰，则用强溶剂冲洗旧柱子。
9、柱入口塌陷9、打开柱入口，填补塌陷或更换柱子
10、呈现两个或多个未被完全分离的物质的峰
10、选择其它类型的色谱柱以改善分离效果
11、柱温过低11、提高柱温。
除非特殊情况，温度不宜超过75℃
12、检测器时间常数太大12、使用较小的时间常数
P、分离度降低
1、流动相污染或变质（引起保留时间变化）
1、重新配置流动相
2、保护柱或分析柱阻塞图
2、去掉保护柱进行分析。
如果必要则更换保护柱。
如果分析柱阻塞，可进行反冲。
如果问题仍然存在色谱柱可能被强保留的污染物损坏，建议使用恰当的再生程序。
如果问题仍然存在，进口可能阻塞了，更换入口处的筛板或更换色谱柱。
Q、所有的峰面积都太小
1、检测器衰减设定过高1、减少衰减的设定
2、检测器时间常数设定太大
2、设定较小的时间常数
3、进样量太少3、增大进样量
4、记录仪连接不当4、使用正确的连接
R、所有的峰面积都太大
1、检测器衰减设定过低1、采取较大的衰减
2、进样过多2、减少进样量
3、记录仪连接不正确3、正确连接记录仪
HPLC日常维护办法之四：
进样阀的问题
以下问题在使用进样阀过程中有可能发生。
A、手动进样阀，转动不灵
1、转子密封损坏1、更换或调整转子密封
2、转子太紧2、调整转子的松紧度
B、手动进样阀，载样困难
1、进样阀安装不当1、重新安装
2、定量环阻塞2、清洗或更换定量环
3、进样器污染3、清洗或更换进样器
4、管路阻塞4、清洗或更换管路
C、自动进样阀，不能转动
1、无压力（或电源）1、提供恰当的压力（电源）
3、进样阀安装不当3、重新安装
D、自动进样阀，其它问题
1、阻塞1、清洗或更换阻塞部件
2、机械故障2、见随机维修手册
3、控制器故障3、维修或更换控制器
液相色谱基线有很多的毛刺，但总体上还是水平的，问这是什么原因导致的？
悬赏分：
5-解决时间：
2006-7-2021:
14
问题补充：
我所用的是液相色谱，配紫外检测器，色谱柱是新的，仪器也没有振动。
毛刺是因信号频率的波动而引起，是比色谱峰的有效值频率更高的基线扰动。
毛刺的存在并不影响色谱峰的分辨，但对检测限有一定影响。
规则的毛刺还算是正常,你把基线放宽,就相当于灵敏度变高。
先给仪器充分的稳定时间再看看。
如果真的是色谱系统出了问题，一般是这几个方面的（不管是气相还是液相都有用）：
1.氢气，空气，载气纯度不高会影响。
2.玻璃衬管是否脏
3.色谱柱是否脏，处理一下或换一个新的试一试
4.检测器清洗一下，可能有未燃烧完的杂质
5.是否漏气
6.进样口是否该换一个垫子
7.仪器是否产生较大振动
8.信号接收器是否已怀或者接触不良
甚至还有过因为工作站出问题导致的毛刺……
小弟初次使用液相色谱，基线波动非常厉害怎么回事
小弟科室一台电化学液相色谱闲置两年没人用过，今天小弟初次使用时调节流速为0.5mL•min工作电压设为+700mV,滤波0。
1Hz,增益5nA
发现基线抖得很厉害，很有规律，就是每当泵“笃”一声时就出现一个波峰，大概0.8nA高，也不出现基线向上向下漂移，很影响测量，请问是怎么回事，谢谢
/\/\/\
__/\___/\___/\___
可能是色谱柱进了气泡，又或者色谱柱还未被流动相跑平衡
（如果是柱子进气泡的话，会出现一组很有规律的峰）
其实基线的波动是难免的，只要波动在允许的范围之内的话，就不会影响测量
你问题说的很详细，但是你还是没说：
你的柱子有没有恒温箱。
首先我怀疑柱温波动。
）解决方法：
控制好柱子和流动相的温度。
其次，我怀疑是流动相，流动相有气泡。
流动相条件变化引起的基线波动大于温度导致的波动。
解决方法：
使用HPLC级的溶剂流动相在使用前进行脱气，有条件可以在线脱气。
如果你的泵压也波动的话，检查系统是否漏液，如果不漏液，就基本上是确定是有气泡了。
其他原因解决方法
1、在流动相、检测器或泵中有空气1、流动相脱气。
2、漏液图2、检查管路接头是否松动，泵是否漏液，是否有盐析出和不正常的噪音。
3、流动相混合不完全3、用手摇动使混合均匀或使用低粘度的溶剂
4、温度影响（柱温过高，检测器未加热）4、减少差异或加上热交换器
5、在同一条线上有其他电子设备5、断开LC、检测器和记录仪，检查干扰是否来自于外部，加以更正。
6、泵振动6、在系统中加入脉冲阻尼器
二
最近在论坛里发现很多虫友在HPLC试验中经常受到基线波动或基线漂移的困扰，下面就我本人在实验中积累的或从别处了解到的一些经验总结如下，欢迎大家指正。
1.液相系统没有平衡好，柱子里的流动相一直在变化，在检测器里面的吸收就会一直变化，导致基线波动的发生；
梯度时如果其实比例的流动相平衡时间过短也会造成基线波动；
2.实验室环境不稳定（比如温度忽高忽低，气流不断变化等），这对于没有柱温箱或只有单向温度变化的HPLC仪器的影响尤其明显；
即使有比较好的柱温箱时，也要注意别让空调的出风口一直对照仪器吹，那样基线也可能会波动；
此外实验室有电磁干扰时，也有可能会导致此问题的发生；
3.检测器的流通池被污染，造成吸收的不恒定，此时需要清洗流通池；
4.检测器灯能量不足时，吸收会变得不稳定，这时基线一般也不稳定，特别是在低波长处尤为明显；
5.当使用低波长检测时，有时流动相会使用两相或以上的等度，这时混合器的很小的混合比例的误差都会被放大，很有可能会使基线发生波动，这时将流动相按比例混合到一个通道里时，一般都会使情况改善很多；
6.流动相里的有机相的截止波长最好要大于检测波长20nm以上，这一点切记，比如甲醇的截止波长是210nm，乙腈是190nm。
当使用230nm以下的检测波长时，如果条件允许，最好使用乙腈，可以避免基线波动，其余类推；
7.仪器出现问题也会造成基线波动，比如
（1）流动相过滤头堵塞、入口主动阀滤芯污染、单向阀被污染物堵塞、泵头有气泡、比例阀出故障、系统流路漏液，比如管路裂开、peek接头没完全连上色谱柱而导致的泄露等；
8.没有脱气机的仪器，当流动相未脱气或脱气未彻底时，基线也会波动；
有脱气机的每次使用前都要检查一下是否正常工作；
9.当大家使用梯度作为组分洗脱方式的时候，有条件的最好使用超纯水，磷酸盐、三乙胺等固体液体加入试剂也最好使用HPLC级别的，因为在梯度中随着有机相（洗脱力较强）的不断增加，流动相系统里的杂质会在基线上反映出来，导致出现鬼峰或基线波动；
10.流动相中的有机相和缓冲液的比例一定要注意调配好，缓冲液的比例不能过大，要不然会出现缓冲盐在柱子里析出的情况，这样不但会造成基线波动的发生，甚至会造成色谱柱毁坏；
11.当色谱柱被污染时，也会造成基线波动，这里尤其要注意的是大家在做合成中控实验的时候，最好不要用合成的原始反应液直接进样，因为原液里面有很多非极性或极性很小的化合物，一旦进入到反相色谱柱里和非极性的C18发生相互作用，很可能就洗脱不下来使色谱柱变性或者慢慢的被洗脱下来，造成以后的分析出现不稳定的鬼峰或者基线波动；
12.一些比较老的液相仪对电压要求很高，电压有点起伏检测器就会反映教明显，比如老的惠普和岛津等仪器，这时需要配一个稳压电源来解决此问题；
此外仪器和电脑之间连接的数据线出问题或老化也可能会使基线波动。
当然上面说了这么多的原因，个人认为还不是很全面，有些没考虑到得地方还请大家不吝补充，以致共同进步，谢谢！
三
高效液相色谱仪（HPLC）现已成为有机化学分析的重要手段之一。
同样，在食品分析中，无论是残留分析还是成分分析，HPLC也已成为不可或缺的分析仪器。
和其它分析仪器一样，你若想让HPLC很好地为你工作、得到可靠的数据，首先你要保养好它，使它处于一个良好的待机状态，这样你操作它进行分析时就可以比较顺利地获得理想的结果。
而且良好规范的操作习惯可以延长仪器使用寿命。
大家在学校或接受仪器公司培训的时候，老师或工程师会提出很多的操作注意事项。
但要是总结归纳一下，最重要的有三点：
脱气、过滤和冲洗。
本文围绕这三点进行讨论，给新从事HPLC分析的工作者一点操作建议，希望能对正确的操作仪器有一点帮助。
更欢迎有经验的专家介绍使用经验，提出好建议。
一、脱气
流动相脱气对于避免HPLC系统出问题，顺利得到一个理想的数据是一个很有效的措施。
HPLC系统内是不希望有气泡存在的。
HPLC泵在输送液体时要产生很大的力量，由于气体的压缩比与液体相比大的多，因而当气泡存在时，你将观察到瞬间的流速降低和系统压力下降。
如果这个气泡足够大，液相泵将不能输送任何溶剂，而且如果压力低于预先设定的压力低限，泵将停止工作。
有些泵设计可以很好地排除气泡，而也有一些泵设计当气泡存在时将停止运转。
当一个气泡通过输液泵时，由于系统压力大，气泡通常会溶解在流动相溶液中，随流动相通过柱子。
但是到达检测器流通池时系统压力又恢复到了大气压，因而气泡可能在检测器流通池中又显现，在色谱图上会出现不规律的毛刺。
为解决这个问题，有些仪器公司设计一个反压控制器，这样可以在检测器出口提供足够的压力保持气泡始终溶解在流动相中直到它们流出检测器。
当然，这个压力不能超过流通池所能承受的压力极限，否则可能损坏检测器。
紫外/可见光（UV/VIS）检测器的液相色谱图中的噪音毛刺通常是气泡进入并通过流通池的征兆。
有些检测器对空气的存在也非常敏感，但表现出的征兆与UV/VIS不同，例如有报导说，当使用荧光（FL）检测器时，流动相中溶解氧的存在可能会使一些化合物失去荧光性。
此外，对于利用待测物质在电极表面发生氧化还原反应引起电流变化而进行检测的电化学（EC）检测器，对流动相中的溶解氧的存在也非常灵敏。
此外，气泡的存在有时还会导致保留时间不重现。
所以，必须注意消除流动相中的空气，并且还应避免空气由管路（如PTFE管）渗透进
流动相中。
如果适当地关注在使用之前脱去流动相中溶解进的空气，上述这些问题均能避免，或把影响降至最低。
常用的脱气方法有如下几种：
1.吹氦脱气法。
利用氦气在液体中溶解度比空气低的特性，在0.1MPa压力下，以约60mL/min流速通入流动相储液容器中10～15min，可以很有效地从流动相中排除溶解的空气，能排除接近80%的氧气。
采用一个高效分布式喷射流装置，一体积的氦气可从流动相中将等体积的几乎全部气体排除。
这意味着1L氦气通过1L流动相就可完成排气这个工作。
这种脱气方法虽然好，但我们国内氦气价格较高，很少有实验室采用此方法。
2.加热回流法。
此法的脱气效果较好。
在操作时要注意冷凝塔的冷却效率，否则溶剂会丢失，混合流动相的比例会有变化。
3.抽真空脱气法。
此法可使用真空泵，降压至0.05～0.07MPa即可除去溶解的气体。
但是由于真空脱气会使混合溶剂组成发生变化，从而影响到实验的重现性，因此多用于单溶剂体系的简单分析。
4.超声波脱气法。
将欲脱气的流动相置于超声波清洗器中，用超声波震荡10～20min。
此法的脱气效果最差。
5.在线脱气法。
现在商品的HPLC仪器，均可配在线脱气机。
在线脱气使用简单，低故障，有效。
建议购买仪器时一定要购买，有的公司是作为选购件，所以与仪器公司谈配置时应与公司确认。
二、过滤
任何颗粒物进入HPLC系统后都会在柱子入口端被筛板挡住，最后的结果是将柱
子堵塞，表现出的特征是系统压力增加并使色谱峰变形。
因此，要采取各种预防措施，包括操作步骤和商品仪器自身的各种过滤设计，努力防止或减少颗粒物进入HPLC系统中，从而延长仪器和色谱柱的使用寿命，并提高数据的可靠性。
在HPLC系统中，颗粒物的主要来源有三个途径：
流动相、被测样品和仪器系统部件的磨损物。
1、流动相
如果流动相均由高效液相色谱级溶剂组成，流动相没有必要过滤。
这是因为高效液相色谱级的有机溶剂，例如乙腈、甲醇等，在制造的工艺过程中都已经过了0.2μm微孔滤膜过滤。
同样的，无论你是买的HPLC级的水还是在实验室使用超纯水净化系统制备的水，最后一步也是通过0.2μm微孔滤膜。
然而，如果有任何一种缓冲液中加入了固体物，例如磷酸盐，流动相过滤将是必要的一个步骤。
虽然缓冲盐可能是可溶解的、高纯的，但它还是可能含有颗粒物质，例如在盖试剂瓶的塑料内盖时，塑料瓶盖子与瓶口边缘挤压就会产生塑料颗粒。
在这种情况下，添加的一种固体物可能完全溶解了，但是少量杂质颗粒存在于流动相中成为残渣。
流动相通过0.45μm微孔滤膜过滤对于从流动相中除去所有颗粒物是一个有效方法。
0.2μm微孔滤膜也可以用，但是它们就这个应用而言并不比0.45μm微孔滤膜更有效，而且它的过滤速度会更慢，特别是当实验室使用的试剂和水的质量不太好时。
建议实验室在编写制定他们流动相制备标准操作程序（SOPs）时规定，可以借鉴国际上同类实验室的规定，即：
流动相制备仅采用HPLC级液体时不需要过滤，反之所有流动相组成在使用前必须过滤。
在连接储液瓶和泵的输液管的末端入口采用下沉式过滤器（常见材质有熔融玻璃砂芯滤板和微孔金属的两种）也是很重要的。
这个过滤器的规格为≥10μm的微孔物质，所以它不能取代流动相过滤步骤，但是它能除去系统中的尘土并保证储液瓶、输液管使用的可靠性。
2、被测样品
液相系统中的第二个颗粒物来源是被测样品。
一些实验室在将他们的样品放置在自动进样器盘（或手动进样）以前，所有样品都先通过一个0.45μm针筒式过滤器过滤。
这是一个有效除去被测样品中颗粒物的方法。
但是这个过程也有一点需要关注：
你使用了针筒式过滤器就不可能100%得到通过过滤器的被测样品，总会有或多或少的丢失。
丢失来自这样几方面：
过滤器滤膜的吸附、过滤器滤出的颗粒物上的吸附、针筒式滤膜过滤器与针筒连接处的渗漏等。
如果有丢失，过滤后液体中被测物的含量或浓度与原基本样液的含量或浓度还相同吗？
这个问题一般需要通过实验确认。
确认这步是要增加工作量和费用的。
过滤器的使用是一种消耗，每个过滤器的价格从几元到十几元。
但在做食品中残留物分析时，由于基质大多比较复杂，所以过滤这步已成为不可或缺的一步。
在实际分析工作中，一般检测每一组样品
会带一个外标、一个添加回收或是质控样品，所以，只要最终检测时得到的信噪比能满足检出限要求，可将这步视为系统误差而忽略。
3、仪器系统部件的磨损物
最后，在HPLC系统中颗粒物的另一个主要来源是输液泵密封垫和进样阀旋转轴的磨损。
关于输液泵密封垫的磨损更换有两种不同建议。
第一种建议认为，在一般实验室中输液泵密封垫通常使用寿命为六个月到一年，因此建
议半年或一年更换这些密封垫，实验室应基于上述观点制定定期预防性维护计划。
该观点认为：
与输液泵密封垫颗粒堵塞柱子而更换新柱子的费用相比，更换密封垫的费用低些。
一些输液泵有玻璃砂芯或筛网，可在流路中滤掉从泵密封垫磨损下来的颗粒物，防止这些颗粒物随流动相流至柱头。
若有这种装置应查阅输液泵操作手册，查看推荐的这种过滤器清洗或更换的间隔。
另一种建议则认为，原装密封垫的密封效果最好，更换以后容易引起流动相渗漏。
所以，只要不漏液就不要轻易更换密封垫。
两种说法都有其道理，具体如何操作，建议与仪器公司工程师沟通，各公司的仪器还是有些不同的。
自动进样器旋转轴的密封随着使用时间也会磨损，但是在我的经验中，即便是高负荷的运转旋转轴密封垫也可以使用几年。
如果你的自动进样器系统有计数进样阀转动次数的功能，你可以设定一个警铃当预设阀转动次数已达到时提醒你。
曾有一种说法，进样器最多转动20,000次，这仅仅是进样10000个；
但这似乎不是实验室涉及的常规样品分析使用寿命，它们的实际使用寿命会更长。
旋转轴密封磨损后会渗液，比较明显的特征是同一样品多次进
样后，峰面积值差别比较大（RSD>
5%）。
当然，输液泵的密封垫和旋转轴的密封垫磨损将增加更多研磨物在流动相中，加速对这些部件的损伤。
此外，如果你日常运行的流动相有缓冲盐，如磷酸缓冲盐，密封垫的磨损会更快。
无论颗粒物源于何物，实验时都要将其除去。
推荐在HPLC系统中采用一个0.45或0.5μm的在线多孔过滤器，接在自动进样器和柱子之间，即使已使用了保护柱。
这个在线过滤器将成为挡板代替柱头的滤板，而且如采用一个玻璃砂芯滤板，既便宜，更换又方便（几分钟就可更换）。
若采用在线过滤，HPLC系统检测每批样品开始前记录下压力值，当压力上升一定值，例如25%或增加500psi，应该更换玻璃砂芯滤板了，更换以后冲洗几分钟系统将恢复到原来的压力值。
三、冲洗
使HPLC系统良好运行的第三个要点是保持系统的清洁。
你需要关注流动相流经该系统的所有地方，对于这些地方经常性的冲洗，将使你的系统保持在“Ready”状态。
1、流动相储液瓶
首先要经常清洗流动相储液瓶，或者每做一批新样品更换一次流动相。
一个脏的储液瓶将会污染注入的流动相。
建议储液瓶中缓冲液使用时间不要超过一周，而有机溶剂使用时间不要超过一个月。
也有人建议储液瓶中保持用溶剂充满，直到更换分析方法储液瓶需更换新溶剂（流动相组成发生变化）时，将旧溶剂倒掉更换新溶剂，这样胜于将溶剂用完。
但这对于分析样品量少的实验室而言似乎有些浪费。
仪器公司的工程师建议储水瓶的水要天天换，每周瓶子还应该用异丙醇清洗一次。
有的实验室则在水里加入0.1～1mM的甲酸抑制微生物的生长。
这些做法看起来有些繁琐，但却能起到“磨刀不误砍柴工”作用。
2、泵
接下来要冲洗的是泵。
千万不要一分析完冲几分钟后就停泵，特别是当流动相中含有难挥发的缓冲液（如磷酸盐）时。
如果仪器不是连续使用，当流动相蒸发时，难挥发物就会粘在活塞密封垫的表面，难挥发物将形成固形物沉淀。
这是泵密封垫磨损和单向阀渗漏的主要原因之一。
所以，无论使用长短，在停泵以前一定要用非缓冲液流动相冲洗泵在半个小时以上，要是流动相中有难挥发缓冲盐则建议冲洗的时间应该更长些。
3、自动进样器
自动进样器也要按规定清洗。
现在的仪器多配有自动进样器的冲洗液瓶，通常只要注意及时更换、补充冲洗液即可。
自动进样器用的洗涤液也要采用与流动相相同的方式处理，并根据溶剂的有效期和规定，清洗储液瓶或更换洗涤液。
现在的自动进样器设置、操作都很简单，如果时间允许（特别是利用夜间运行），每次分析完后设置进1、2针纯溶剂（如甲醇、乙腈），也是一个好做法。
4、色谱柱
对柱子的污染是随使用时间而增加
升级会员 