肿瘤药理学实验方法简.ppt

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药理学实验方法肿瘤药理学实验方法肿瘤药理学实验方法肿瘤（tumor），是机体在各种致病因素的作用下，局部组织的细胞异常增生而形成的新生物（neoplasm），常表现为局部肿块。

（白血病非局部肿块）（白血病非局部肿块）细胞毒类药物生物反应调节剂分化诱导剂化学预防药逆转肿瘤耐药性药物抗肿瘤侵袭、转移的药物放疗及化疗增敏剂抗肿瘤药物细胞毒类药物：

体外实验方法；动物肿瘤体内筛选法；抗癌药作用机理研究方法生物反应调节剂：

体内抗癌试验的方法；免疫功能的研究方法分化诱导剂：

细胞形态学及组织化学研究方法；细胞功能的研究方法；与分化有关的基因及其表达的研究方法化学预防药：

体外诱导细胞转化的方法；体内诱癌试验；化学预防剂作用机理的研究逆转肿瘤耐药性药物：

肿瘤细胞耐药表型和机制；肿瘤耐药细胞株的建立及鉴定；寻找肿瘤耐药性逆转剂的方法抗肿瘤侵袭、转移的药物：

肿瘤侵袭、转移与实验方法概述；肿瘤侵袭、转移的实验动物模型；肿瘤侵袭的体外模型及相关生物学特性研究新血管生成的研究方法放疗及化疗增敏剂：

放疗增敏剂的正名、定义及其研究特点；离体细胞培养实验技术；整体动物实验技术各类抗肿瘤药物所涉及到的药理学实验方法细胞毒类药物：

体外实验方法；动物肿瘤体内筛选法；抗癌药作用机理研究方法生物反应调节剂：

体内抗癌试验的方法；免疫功能的研究方法免疫功能的研究方法。

分化诱导剂：

细胞形态学及组织化学研究方法；细胞功能的研究方法；与分化有关的基因及其表达的研究方法化学预防药：

体外诱导细胞转化的方法；体内诱癌试验；化学预防剂作用机理的研究（附：

胃癌变动物模型）逆转肿瘤耐药性药物：

肿瘤细胞耐药表型和机制；肿瘤耐药细胞株的建立及鉴定；寻找肿瘤耐药性逆转剂的方法抗肿瘤侵袭、转移的药物：

肿瘤侵袭、转移与实验方法概述肿瘤侵袭、转移的实验动物模型肿瘤侵袭的体外模型及相关生物学特性研究心血管生成的研究方法附：

LALA795795自发肺癌实验转移模型放疗及化疗增敏剂：

放疗增敏剂的正名、定义及其研究特点离体细胞培养实验技术；整体动物实验技术各类抗肿瘤药物所涉及到的药理学实验方法肿瘤细胞体外实验方法肿瘤细胞体外实验方法（动物的，人的动物的，人的）动物肿瘤体内实验方法动物肿瘤体内实验方法移植性、诱发性移植性、诱发性（也可在体外诱发也可在体外诱发）、自发性、自发性肿瘤转移的动物实验模型肿瘤转移的动物实验模型肿瘤免疫药理研究方法肿瘤免疫药理研究方法（体外、体内体外、体内）肿瘤药理学基本的实验方法肿瘤药理学基本的实验方法一、肿瘤细胞培养的基本条件基本条件二、肿瘤细胞的培养与传代培养与传代三、肿瘤细胞的活性检测活性检测形态观察细胞排染试验细胞生长曲线抗癌作用测定克隆形成试验半数抑制浓度的计算肿瘤细胞体外实验方法肿瘤细胞体外实验方法（InVitro）无菌室超净工作台消毒器CO2孵箱倒置显微镜酶标仪培养板、培养瓶营养液，等等肿瘤细胞体外实验所需要的肿瘤细胞体外实验所需要的基基本本条条件件原代原代细胞培养细胞培养与与传代传代细胞培养细胞培养贴壁贴壁细胞传代与细胞传代与悬浮悬浮细胞传代细胞传代肿瘤细胞的培养与传代肿瘤细胞的培养与传代肿瘤细胞培养原原代代细细胞胞培培养养原代培养原代培养（PrimaryCulturePrimaryCulture）也称初代培养，即从体内取出组织、接种细胞培养到第一次传代之前（一般可持续1-41-4周）。

此期细胞可见到细胞分裂，但不旺盛。

原代培养细胞细胞克隆形成率（CloningCloningEfficiencyEfficiency）很低。

克隆形成率克隆形成率即细胞群被稀释分散成单个细胞进行培养时，形成细胞小群（克隆）的百分数。

初代培养细胞也可用于检测药物的生物活性。

传代培养传代培养（Passageculture）：

将培养的细胞分散，从容器中取出，以1:

2或l:

3以上的比例转移到另外的容器中进行培养，即为传代培养。

为什么要进行传代？

体外培养的肿瘤细胞密度过大，生存空间不足，可引起营养枯竭从而停止生长。

因此，要在体外持续地培养就必须传代，以便获得稳定的细胞株或得到大量的同种细胞用于研究，并维持细胞种的延续。

肿瘤细胞培养传传代代细细胞胞培培养养细胞“一代”指从细胞接种在培养器皿到分离再培养的一段期间。

细胞倍增时间：

指此次细胞分裂结束到下一次细胞分裂结束所需的时间。

“一代”与“倍增”的概念不同。

在一代中，细胞可培增2-3次甚至5-6次。

肿瘤肿瘤细细胞胞培培养养传代代数与细胞倍增时间传代代数与细胞倍增时间细胞传代后，一般经过游离期、指数增生期指数增生期、坪台期三个阶段游离期：

细胞接种后从悬浮状态到细胞贴瓶；指数增生期指数增生期：

细胞接种23天分裂增殖比较旺盛，是活力最好时期，称指数增生期（对数生长期），适宜进行各种试验；坪台期（停止期）：

细胞密度已饱和，细胞停止增殖，但代谢活动仍在进行。

肿瘤细胞体外培养肿瘤细胞体外培养指数增生期肿瘤细胞培养可分为单层贴壁培养和悬浮培养。

悬浮悬浮培养是指细胞悬浮悬浮于培养基中进行生长或维持。

单层贴壁培养是指细胞贴附在培养器皿表面生长的方法。

将细胞消化后分散成单个细胞后种入器皿，细胞置含37、5%CO2的孵箱中培养，一般经过3-6h，细胞沉于器皿底部，附着于玻璃或塑料层的培养面，分裂，向四周生长，逐渐融合形成细胞单层。

正常二倍体细胞在两个细胞集落生长到相互接触时，由于细胞信息的传递，生长即停止，即生长接触抑制。

恶性转化细胞或恶性肿瘤细胞由于具有失去接触抑制的特性，在生长到细胞相互接触时，还能继续生长，形成重叠层。

细胞生长到旺盛期，即可进行传代。

肿瘤细胞培养悬浮培养与贴壁培养悬浮培养与贴壁培养肿瘤细胞传代悬浮细胞的传代悬浮细胞是指细胞呈单个或细胞团悬浮在培养液中生长，当细胞生长到一定密度时，进入坪台期，即需传代。

传代方法：

取少量细胞悬液移入新培养器皿，加入新鲜培养液即可。

1.打开瓶口，过火后，轻轻倒去培养液。

2.用PBS或用Hanks液2ml洗12次，加入0.05%0.25%胰蛋白酶适量，消化13min。

3.在显微镜下观察细胞呈圆球状时（或肉眼观察培养瓶细胞面出现布纹孔状），表示细胞已从壁上消化下来，倒去胰蛋白酶，可用Hanks液轻轻洗12次。

4.加入新鲜培养液后，用滴管轻轻吹打，使细胞从培养皿或培养瓶表面脱落，混合成细胞悬液，以适量接种入新培养器皿中。

肿瘤细胞传代贴壁细胞的传代贴壁细胞的传代1.培养液中可加入适量青霉素、链霉素；2.用于调pH值的7%NaHCO3用0.1-0.22m滤膜过滤灭菌，勿高压灭菌。

3.洗去胰蛋白酶时应该用D-Hanks液，而不是Hanks液。

4.传代时细胞分散密度要适当，不能太低，因肿瘤细胞的自泌促生长因子会因分散培养而被稀释，达不到肿瘤生长的需求，降低肿瘤细胞的生长增殖力。

肿瘤细胞培养与传代肿瘤细胞培养与传代注意事项注意事项分离纯化外科肿瘤组织中肿瘤细胞的方法1.1.取材取材：

材料主要来源于外科手术或活检肿瘤组织。

取材时避免用坏死组织，要挑选瘤细胞集中和活力较好的部位，瘤性转移淋巴结或胸腹水是较好的培养培养材料。

取材后尽快培养培养，因故不能立即培养培养者，可冻存。

2.2.成纤维细胞排除成纤维细胞排除：

在肿瘤组织中常混杂有一些成纤维细胞，培养培养时能与瘤细胞同时生长，并常压过癌细胞，导致癌细胞生长受阻，应仔细排除。

排除方法常有：

机械刮除法、反复贴壁法、消化排除法、胶原酶消化法等。

成纤维细胞排除机械刮除法机械刮除法是用不锈钢钢丝末端插有橡胶刮头（用胶塞剪成三角形插以不锈钢丝）、或裹少许脱脂棉制成，装入试管中高压灭菌后备用。

刮除程序为：

（1）标记：

镜下观察，用不脱色笔在培养瓶皿的背面圈下生长肿瘤细胞的部位；

（2）刮除：

弃掉培养液，把无菌胶刮伸入瓶皿中，肉眼或显微镜窥视下，刮除无标记空间；（3）用Hanks液冲洗一两次，洗除被刮掉的细胞；（4）注入培养液继续培养，如发现仍有成纤维细胞残留，可重复刮除至完全除掉为止根据肿瘤细胞比成纤维细胞贴壁速度慢的特点，并结合使用不加血清的营养液，把含有两类细胞的细胞悬液反复贴壁，使两类细胞相互分离，操作方法与传代相同。

（1）待细胞生长达一定数量后，倒出旧培养液，用胰酶消化后，Hanks冲洗2次，加入不含血清的培养液，吹打制成细胞悬液；

（2）取编号为此A、B、C三个培养瓶；首先把悬液接种入A培养瓶中。

置温箱中静止培养520分钟后，轻轻倾斜培养瓶，让液体集中瓶角后慢慢吸出全部培养液，再接种入B培养瓶中后；向A瓶中补充少许完全培养液置温箱中继续培养；（3）培养B瓶中细胞520分钟后，按处理A的方法，把培养液注入C培养瓶中；再向B瓶中补加完全培养基。

当三个瓶内都含有培养液后，均在温箱中继续培养。

如操作成功，次日观察可见A瓶主要为成纤维细胞，B瓶两类细胞相杂，C瓶可能主要为癌细胞。

必要时可反复处理多次，直至癌细胞纯化为止。

成纤维细胞排除反复贴壁法消化排除法：

根据成纤维细胞比肿瘤细胞易先脱落的特点。

此法曾用于乳癌细胞的培养，具体程序是：

（1）先用0.5%胰蛋白酶和0.02EDTA（1：

1）混合液漂洗培养细胞一次，然后再换成新的混合液继续消化，并在倒置显微镜下观察和不时摇动培养瓶，到半数细胞脱落下来后，便立即停止消化；

（2）把消化液吸入离心管中，离心去上清，吸入另瓶中，加培养液置温箱中培养；向原瓶内也补加新的培养液继续培养。

经过几次反复处理，可能把成纤维细胞除净。

胶原酶消化法：

利用成纤维细胞对胶原酶较为敏感的特点，通过消化进行选择。

（1）可用0.5mg/ml的胶原酶消化处理，边消化边在倒置显微镜下观察，当发现成纤维细胞被除掉后，即终止消化；

（2）用Hanks洗涤处理一次后，更换新培养液，继续培养，可获纯净肿瘤细胞。

如成纤维细胞未被除净，可再次重复。

其它方法：

有人发现聚丙烯酰胺有抑制成纤维细胞生长的作用；也有人用聚蔗糖制备成比重1.0251.085的密度梯度离心液，加入细胞悬液后，在23中800g离心10分种。

在比重1.0251.050层为成纤维细胞，在比重1.0501.085层为上皮细胞，再经过分离进行培养。

最近也有人应用特殊化学物如SOD抑制成纤维细胞生长的方法。

选用上述任何一种方法，都需进行试验，取得必要经验，找出适合的条件，才能获得好的效果。

肿瘤细胞培养的基本条件肿瘤细胞培养的基本条件肿瘤细胞的培养与传代培养与传代肿瘤细胞的活性检测活性检测形态观察细胞排染试验细胞生长曲线MTT试验克隆形成试验半数抑制浓度的计算肿瘤细胞体外实验肿瘤细胞体外实验肿瘤细胞的活性检测形态观察细胞排染试验细胞生长曲线MTT试验克隆形成试验半数抑制浓度的计算肿瘤细胞的活性检测形态观察n主要观察细胞的一般形态，如大体形态、核浆比例、染色质和核仁大小、多少等以及细胞骨架微丝微管的排列状态等。

实验原理细胞损伤或死亡后细胞膜完整性破坏。

正常的活细胞拒染，而死亡的细胞则染成蓝色。

实验方法取100l细胞悬液加等量0.4台盼蓝染色液，搅动细胞使之与染料混合均匀，滴入血球计数板，稳定2min后进行观察，在l5min内用血细胞计数板计数200个细胞。

未染色的是活细胞，死细胞呈蓝色。

分别计数染色细胞与不染色细胞，求得细胞存活率。

肿瘤细胞的活性检测细胞排染试验细胞排染试验细胞存活率100%未经任何处理的培养细胞，细胞存活率应达95%以上。

细胞生长抑制率观察药物的作用，可对实验组与对照组分别计数活细胞数（即末染色细胞数），再根据下列公式求得细胞生长抑制率。

100%细胞悬液与台盼蓝染色液混匀后，应在5min内计数完毕，时间过长，由于细胞活度下降而通透性增加，从而影响拒染细胞数，因而影响实验的真实结果。

细胞排染试验注意事项在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中随着培养时间延长呈指数生长，以培养时间为横坐标，细胞数的对数为纵坐标作图，可得一条直线，故称此时为对数生长期。

随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致