细胞化学染色-2-25.ppt

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第二节细胞化学染色第二节细胞化学染色（cytochemicalstain）临床检验与输血学系胡嘉波临床检验与输血学系胡嘉波概述概述细胞化学细胞化学（组织化学，组化组织化学，组化）染色染色以以形态学为基础并结合化学或生物化学技术，形态学为基础并结合化学或生物化学技术，对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、对细胞内各种化学成分、代谢产物作定位、定性和半定量检查的一门科学。

可弥补单纯定性和半定量检查的一门科学。

可弥补单纯细胞形态学检查识别的不足。

细胞形态学检查识别的不足。

细胞化学染色临床意义细胞化学染色临床意义:

1.辅助判断急性白血病的类型。

辅助判断急性白血病的类型。

仅从细胞仅从细胞形态学观察白血病的诊断正确率约形态学观察白血病的诊断正确率约5070%，如结合细胞化学染色则可提到，如结合细胞化学染色则可提到90%以上。

以上。

2.辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。

辅助血液系统等疾病的诊断和鉴别诊断。

不同细胞化学染色，染色步骤不同，但不同细胞化学染色，染色步骤不同，但基基本步骤为固定、有色沉淀反应及复染。

本步骤为固定、有色沉淀反应及复染。

1.1.固定固定为了保持细胞结构及化学成分的不为了保持细胞结构及化学成分的不变，需对细胞进行固定。

根据染色的成分不变，需对细胞进行固定。

根据染色的成分不同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、同，选择合适的固定液，使细胞内的蛋白质、酶类、糖类等变成不溶性物质。

酶类、糖类等变成不溶性物质。

固定的方法固定的方法有物理法和化学法，有物理法和化学法，临床上常用的是化学法临床上常用的是化学法固定。

固定。

物理法包括干燥和火焰固定；物理法包括干燥和火焰固定；化学法化学法包括蒸汽固定和液体固定包括蒸汽固定和液体固定，如甲醛、乙醇、，如甲醛、乙醇、甲醇、丙酮等。

甲醇、丙酮等。

2.有色沉淀反应有色沉淀反应通过不同化学反应，使被检测的化学物质最终形通过不同化学反应，使被检测的化学物质最终形成稳定的有色沉淀。

列举以下三种化学反应：

成稳定的有色沉淀。

列举以下三种化学反应：

（1）偶氮偶联法：

）偶氮偶联法：

含萘酚的底物，在相应酶的作用含萘酚的底物，在相应酶的作用下释放出萘酚，萘酚与重氮盐（如坚牢蓝紫酱下释放出萘酚，萘酚与重氮盐（如坚牢蓝紫酱GBC、坚牢蓝坚牢蓝B、六偶氮付品红等）结合，偶氮偶联形成有、六偶氮付品红等）结合，偶氮偶联形成有色沉淀。

如色沉淀。

如NAP染色、特异性酯酶染色、非特异性酯染色、特异性酯酶染色、非特异性酯酶染色、酶染色、ACP染色等。

染色等。

（2）普鲁士蓝反应：

）普鲁士蓝反应：

铁与酸性亚铁氰化钾铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成如亚铁氰化铁蓝色沉淀，如铁染作用，形成如亚铁氰化铁蓝色沉淀，如铁染色。

色。

（3）雪夫反应）雪夫反应:

过碘酸氧化细胞内糖类中过碘酸氧化细胞内糖类中的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂的乙二醇基形成乙二醛基，醛基与雪夫试剂作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘作用，使无色品红形成红色沉淀物，如过碘酸酸雪夫反应。

雪夫反应。

3.复染目的目的在于使各种细胞能显示出来便于观察。

在于使各种细胞能显示出来便于观察。

选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显选择复染液的颜色应与有色沉淀的颜色有明显的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看的对比度，即能使细胞结构显示又能清楚地看出细胞化学染色结果。

如铁染色复染常用中性出细胞化学染色结果。

如铁染色复染常用中性红，过碘酸红，过碘酸雪夫反应常用甲基绿。

雪夫反应常用甲基绿。

对核着色对核着色效果较好效果较好的有中性红、甲基绿、苏木精、核固的有中性红、甲基绿、苏木精、核固红、沙黄等，红、沙黄等，使浆着色较好的有使浆着色较好的有伊红、刚果红、伊红、刚果红、光绿等。

光绿等。

一、过氧化物酶染色（一、过氧化物酶染色（POX）【原理原理】粒细胞和单核细胞的胞浆中含有粒细胞和单核细胞的胞浆中含有髓过氧化物酶（髓过氧化物酶（myeloperoxidase,MPO）,能将底物能将底物H2O2分解，产生新生态分解，产生新生态氧，它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺氧，它能够将四甲基联苯胺氧化为联苯胺蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化，则显棕色四蓝。

联苯胺蓝自我脱氢氧化，则显棕色四甲基苯醌二胺。

若加入亚硝基铁氰化钠与甲基苯醌二胺。

若加入亚硝基铁氰化钠与联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，联苯胺蓝结合，可形成稳定的蓝色颗粒，定位于细胞浆酶所在部位。

定位于细胞浆酶所在部位。

骨髓片POX染色骨髓片POX染色APL：

呈强阳性反应AML-M4：

部分呈阳性反应，部分成弱阳性反应AML-M5：

呈弱阳性ALL：

呈阴性，3%正常血细胞的染色反应过氧化物酶主要存在于粒细胞和单核细胞中。

原粒大多呈阴性反应，部分可出现少量阳性颗粒。

自早幼粒细胞起至成熟中性粒细胞均呈阳性反应，并随着细胞的发育成熟阳性反应程度逐渐递增，中性分叶核粒细胞呈强阳性反应。

淋巴细胞、幼红细胞、巨核等均呈阴性反应。

POX染色临床意义主要有助于急性白血病类型的鉴别主要有助于急性白血病类型的鉴别

（1）急急粒粒其其白白血血病病性性原原粒粒细细胞胞可可呈呈弱弱阳阳性性反反应应，颗颗粒粒粗粗大大，呈呈局局灶灶性性分分布布；急急淋淋其其原原淋淋细细胞胞和和幼幼淋淋均均呈呈阴阴性性反反应应；急急单单时时白白血血病病性性原原单单呈呈阴阴性性反反应应或或弱弱阳性反应，颗粒细小，呈弥散分布。

阳性反应，颗粒细小，呈弥散分布。

（2）急急单单与与恶恶性性组组织织细细胞胞白白血血病病鉴鉴别别：

异异常常组组织织细细胞胞POX染染色色呈呈阴阴性性反反应应，急急单单白白血血病病细细胞胞呈呈弱弱阳阳性反应。

性反应。

二、苏丹黑B染色【原理原理】苏丹黑苏丹黑B（SudanblackB，SBB）是一种脂溶性重氮染料，能溶解细）是一种脂溶性重氮染料，能溶解细胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖胞内的含脂结构（如中性脂肪、磷脂、糖脂和类固醇）中，而使脂类物质显示出来，脂和类固醇）中，而使脂类物质显示出来，呈棕黑色或深黑色。

脂类物质在粒细胞中呈棕黑色或深黑色。

脂类物质在粒细胞中丰富，单核细胞中也有少量。

丰富，单核细胞中也有少量。

【正常血细胞的染色反应】结果与POX染色基本一致。

【临床意义】本染色临床意义与POX染色基本相似。

【方法评价】过氧化物酶染色要求涂片新鲜，保持酶活性，才能得出正确结果，而苏丹黑B染色则无此要求。

虽然SB染色临床意义基本同POX染色，但其灵敏度及特异性两者有所不同。

SB染色的特异性低于POX染色，POX阳性见于髓系细胞，而SB阳性也可见于淋系细胞；但SB染色的敏感性高于POX染色，例如急性粒细胞白血病POX染色阴性的患者，其SB染色可阳性。

三、中性粒细胞三、中性粒细胞NAPNAP染色染色【原原理理】中中性性粒粒细细胞胞胞胞浆浆中中的的碱碱性性磷磷酸酸酶酶能能水水解解磷磷酸酸萘萘酚酚钠钠，释释放放出出萘萘酚酚，后后者者与与重重氮氮盐盐偶偶联联形形成成不不溶溶性的有色沉淀定位于酶活性处。

性的有色沉淀定位于酶活性处。

中性粒细胞碱性磷酸酶染色（NAP）NAP积积分分油油镜镜下下计计数数100个个中中性性杆杆状状核核、分分叶叶核核粒粒细细胞胞，分分别别记记录录其其分分级级情情况况，全全部部阳阳性性细细胞胞之之和和即即为为阳阳性性率率。

将将得得出出各各种种积分的百分率乘以该积分数，再相加即为积分值。

积分的百分率乘以该积分数，再相加即为积分值。

例：

例：

4分分占占204x20=80分分3分分占占403x40=120分分2分分占占182x18=36分分1分分占占101x10=10分分0分分占占120x12=0分分阳性率阳性率88积分积分=246分分NAP临床意义临床意义1.细菌与病毒性感染的鉴别：

前者增高，后者降低。

细菌与病毒性感染的鉴别：

前者增高，后者降低。

2.类白与慢粒的鉴别：

前者增高，后者降低。

类白与慢粒的鉴别：

前者增高，后者降低。

3.急急性性白白血血病病类类型型鉴鉴别别：

急急粒粒NAP积积分分值值减减低低，急急淋淋NAP积分值增高。

积分值增高。

4.PNH与再障鉴别：

前者减低，后者增高。

与再障鉴别：

前者减低，后者增高。

5.真真红红增增多多症症与与继继发发性性红红细细胞胞增增多多症症鉴鉴别别：

前前者者增增高高，后者无明显变化。

后者无明显变化。

6.白白血血病病前前期期与与增增生生性性再再障障的的鉴鉴别别：

前前者者NAP积积分分减减低，后者增高。

低，后者增高。

四、酸性磷酸酶染色四、酸性磷酸酶染色【原理原理】酸性磷酸酶（酸性磷酸酶（ACP）存在于细）存在于细胞的溶酶体颗粒中，有些细胞中的酸胞的溶酶体颗粒中，有些细胞中的酸性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性性磷酸酶耐酒石酸，故抗酒石酸酸性磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及磷酸酶染色有助于某些疾病的诊断及鉴别诊断。

染色方法有偶氮偶联法和鉴别诊断。

染色方法有偶氮偶联法和Gomori硫化铅法，以前者为常用。

硫化铅法，以前者为常用。

偶氮偶联法血细胞内的酸性磷酸酶在偶氮偶联法血细胞内的酸性磷酸酶在酸性（酸性（pH5.0）条件下水解基质液中的磷）条件下水解基质液中的磷酸萘酚酸萘酚ASBI，释放出萘酚，释放出萘酚ASBI，后者，后者与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的与基质液中的重氮盐偶联形成不溶性的有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部有色沉淀，定位于细胞质内酶所在的部位。

本试验常用的重氮盐为六偶氮付品位。

本试验常用的重氮盐为六偶氮付品红，形成红色的沉淀。

红，形成红色的沉淀。

抗抗酒酒石石酸酸酸酸性性磷磷酸酸酶酶染染色色用用相相同同方方法法制制备备两两份份基基质质液液，一一份份再再加加入入适适量量的的L酒酒石石酸酸（tartaricacid）,另另一一份份不不加加酒酒石石酸酸。

取取两两张张相相同同标标本本的的涂涂片片，分分别别用用这这两两种种不不同同的的基基质质液液做做酸酸性性磷磷酸酸酶酶染染色色。

如如果果血血细细胞胞内内的的酸酸性性磷磷酸酸酶酶耐耐L酒酒石石酸酸，两两张张均均呈呈阳阳性性；如如不不耐耐L酒酒石石酸酸，不不加加L酒酒石石酸酸呈呈阳阳性性反反应应，而而加加L酒石酸呈阴性反应。

酒石酸呈阴性反应。

阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆。

阳性反应为鲜红色或深红色颗粒，定位于胞浆。

所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性，但是单核细所有血细胞的酸性磷酸酶染色均为阳性，但是单核细胞、组织细胞、巨核细胞和毛细胞反应较强。

胞、组织细胞、巨核细胞和毛细胞反应较强。

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：

抗酒石酸酸性磷酸酶染色：

毛细胞白血病的毛细胞出毛细胞白血病的毛细胞出现强阳性反应。

除少数淋巴细胞表现弱阳性反应外，现强阳性反应。

除少数淋巴细胞表现弱阳性反应外，粒细胞、单核细胞和巨核细胞皆为阴性。

粒细胞、单核细胞和巨核细胞皆为阴性。

临床意义：

临床意义：

帮助诊断多毛细胞白血病：

帮助诊断多毛细胞白血病：

毛细胞呈阳性（常呈强毛细胞呈阳性（常呈强阳性），阳性反应不被阳性），阳性反应不被L酒石酸抑制。

慢性淋巴细酒石酸抑制。

慢性淋巴细胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞胞白血病的淋巴细胞和恶性淋巴瘤细胞ACP染色也染色也可呈阳性，但可被可呈阳性，但可被L酒石酸抑制。

但酒石酸抑制。

但ACP阴性者，阴性者，并不能排除多毛细胞白血病的可能性。

并不能排除多毛细胞白血病的可能性。

帮助鉴别帮助鉴别TT细胞与细胞与BB细胞：

细胞：

TLTL（+），），BLBL（-）帮助鉴别帮助鉴别GaucherGaucher病与病与NiemanmNiemanm-Pick-Pick病。

病。

单核、组织、网状、巨核细胞单核、组织、网状、巨核细胞ACPACP染色均呈阳性反应。

染色均呈阳性反应。

五、过碘酸雪夫反应五、过碘酸雪夫反应【原原理理】细细胞胞内内含含有有乙乙二二醇醇基基的的糖糖基基在在高高碘碘酸酸的的氧氧化化作作用用下下产产生生双双醛醛基基，后后者者与与雪雪夫夫（Schiff）染染料料作作用用，使使无无色色品品红红变变为为紫紫红红色色染染料料沉沉积积，定定位位于于含含有有多多糖糖成成分分的的部部位位。

根根据据胞胞质质中中糖糖原原含含量量多多少少，可可呈