病毒性脑炎的诊断及博尔纳病病毒p24基因片段的检测Word文件下载.docx

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4例BDVp24基因片段阳性患者主要以发热、头痛、颅内压增高症状为主。

结论脑脊液、MRI对病毒性脑炎的诊断价值优于EEG，部分病毒性脑炎的发生与BDV感染有关，主要以发热、头痛、颅内压增高为临床特征。

【关键词】病毒性脑炎；

脑脊液；

博尔纳病病毒；

荧光定量巢式逆转录聚合酶链反应病毒性脑炎（Virusencephalitis，VE）的诊断主要靠临床症状、体征和脑脊液（CSF）检查。

临床常出现发热、头痛、精神行为异常以及意识水平的改变，可伴有局灶性神经缺损和癫痫发作。

博尔纳病病毒（BDV）是一种中枢神经系统新发感染性病毒，研究表明其与人类某些神经精神疾病的发病有关［1］。

本文拟探讨CSF、脑电图（EEG）和MRI对VE的诊断价值，并检测BDVp24基因片段以探讨其与VE的关系。

1资料与方法1.1一般资料实验组50例（男27例，女23例），年龄15～78岁，平均34.336岁，均为宁夏医科大学附属医院神经内科2007年7月—2008年7月间的住院患者。

正常对照组60例（男33例，女27例），年龄18～75岁，平均53.662岁，均来自本院健康体检者。

实验组50例均符合《临床神经病学》病毒性脑炎的诊断标准：

①临床上有似病毒感染所致脑实质受损征象；

②脑脊液有或无炎症性改变，均查不到细菌（包括结核、霉菌等）感染的证据；

③脑电图呈弥漫性异常（有些可局灶化），脑扫描、造影、MRI等检查无占位性病变征象（单纯疱疹病毒脑炎和某些局灶性脑炎例外）；

④血清抗体滴度明显增高（特别是恢复期比急性期高4倍以上）。

并排除结核性脑膜炎、化脓性脑膜炎等颅内感染。

实验组和对照组一般情况差异无统计学意义。

1.2方法脑脊液采用英国Shandon公司Cytospin－2型细胞波片离心沉淀仪收集，应用迈—格—姬染色法染色。

细胞学诊断参照实用脑脊液细胞学彩色图谱［2］。

脑电图检测均采用日本光电32道数字化视觉脑电监测仪，评定参考刘晓燕《临床脑电图学》［3］标准。

颅脑MRI采用美国GE公司1.5TSignaInfinityTwinSpeed型MR机，层厚6mm，间隔2mm，横断面、矢状面及冠状面T1WI400ms/20ms，T2WI3640ms/89ms。

试剂和其它材料包括：

Ficoll-conray液，TrizolRNA提取抽提剂，BDVp24荧光定量PCR检测试剂盒（购自广州达辉生物技术有限公司）。

BDV重组质粒由重庆医科大学神经病学研究所提供。

BDVp24基因扩增产物及探针序列：

外引物P1:

5-TGACCCAAACCAGTAGACCA-3（19bp），P2：

5－GTCCCATTCATCCGTTGTC-3（19bp）；

内引物P1:

5-CCCTCCAAGTGGAAACCAT-3（19bp），P2：

5－CAGTATCTTGATGTTCTCGCCA-3（22bp）；

荧光探针：

5－FAM-TCAGCGGTGCGACCACTCCGATAGC-TAMRA-3（25bp）。

采集每例患者及对照者EDTA抗凝外周血液各5mL，分别用Ficoll-conray液密度梯度离心法分离外周血液单个核细胞（PBMC），采用Trizol一步法提取细胞总RNA，标本置－80℃保存备用。

然后进行

（1）RNA完整性检测：

采用1％琼脂糖凝胶（含溴化乙锭浓度为0.5％）电泳。

取RNA样品5μL加样，以3～4V/cm电压电泳1h，在凝胶扫描系统中观察结果并照相。

（2）BDV质粒标准曲线制作：

将重组质粒定量后作为阳性模板，稀释完全107、106、105、104、103拷贝/μL浓度梯度，在澳大利亚Rcorbett型扩增检测仪上进行PCR扩增，由电脑自动分析出定量结果，并给出PCR扩增的动力学曲线。

（3）FQ-nRT-PCR检测BDVp24基因片段：

首先进行逆转录反应，在含RNA的Ep管中加入逆转录体系反应液Ⅰ7μL，逆转录酶1μL，DEPC水7μL，总反应体积为20μL，于37℃持续1h．然后取逆转录产物5μL，加入反应液Ⅱ8μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水11μL，反应体积为25μL，进行PCR第一步扩增:

93℃4min预变性，94℃变性30s，54℃退火30s，72℃延伸1min，循环20个周期。

再取PCR第一步扩增产物5μL，加入反应液Ⅲ14μL，TaqDNA聚合酶1μL，去离子水30μL，反应体积为50μL，进行PCR第二步扩增：

93℃3min预变性，93℃变性45s，55℃延伸60s，共循环40个周期。

每次实验均设阴性对照。

（4）PCR扩增阳性产物的鉴定和序列分析：

将BDVp24基因片段阳性PCR第二步扩增产物5μL加样，以2％琼脂糖3～4V/cm电压电泳35min，在凝胶成像系统中扫描并照相。

可见与目的基因片段相同分子量大小86bp电泳条带。

将BDVp24基因片段阳性的标本经纯化、克隆后送上海英骏生物技术有限公司基因测序。

1.3统计学方法计数资料采用χ2检验。

BDVp24基因片段检测采用SPSS13.0进行Fisher精确概率检验。

2结果2.1CSF、MRI、EEG检查结果比较50例患者均于入院24h内行腰穿脑脊液检查，脑脊液常规外观48例为无色透明清亮，2例为微混浊淡血性；

其中压力正常者22例，压力增高者26例（＞200mmH20为颅压增高），介于200～330mmH20间22例，＞330mmH20有4例，脑压降低（＜70mmH20）2例；

脑脊液细胞学正常5例，细胞学异常45例（细胞数＞5×

106/L为脑脊液细胞学异常），阳性率为90％，细胞数10～49×

106/L11例，细胞数50～99×

106/L15例，细胞数100～499×

106/L16例，细胞数500～1000×

106/L3例；

脑脊液生化检查：

蛋白增高＞0.45g/L者33例，其中5例增高至1.0g/L以上；

糖、氯化物均正常；

脑脊液涂片均未查到细菌。

脑脊液病毒免疫学检查均阴性，详见表1。

表150例病毒性脑炎患者住院24hCSF检测结果2.2实验组患者PBMCs中BDVp24基因片段阳性率（8%），对照组均为阴性（0%），差异有统计学意义（P＜0.05）。

2.3PCR扩增阳性产物鉴定BDVp24基因片段阳性患者的总RNA逆转录产物cDNA经PCR扩增后，其终产物经电泳后在紫外线下观察，可见与目的片段大小一致的86bp电泳条带（见图1）。

测序后证实是BDV基因片段。

2.4BDVp24基因片段阳性患者的临床特征4例BDVp24基因片段阳性患者均有发热、头痛和CSF细胞学异常，4例有局灶体征和脑膜刺激征，脑CT或MRI异常3例，意识障碍2例。

发病前均无上感或腹泻史，以发热、头痛、颅高压为临床特征。

3讨论病毒性脑炎大多数急性或亚急性起病，以头痛、发热或行为异常为首发症状，其诊断标准主要依靠临床表现和脑脊液实验室检查结果。

本组50例患者均于入院24h内行脑脊液细胞学检查，细胞学异常者45例，阳性率为90％，细胞学主要表现为以淋巴细胞反应为主，这符合病毒性脑炎脑脊液细胞学的特点［4］。

本组资料脑脊液生化显示糖、氯化物均正常，蛋白升高33例，其中5例增高至1.0g/L以上。

50例患者均同时行脑脊液涂片检查和脑脊液病毒免疫学检查均为阴性。

虽从脑组织或脑脊液中分离出病毒是诊断病脑的金标准，但脑脊液病毒分离的阳性率很低（＜4％）且技术条件上不利于早期诊断和推广［4］，因此脑脊液检查仍是诊断病毒性脑炎的重要实验室依据，也是与细菌性脑炎、结核性脑炎进行鉴别诊断的主要依据。

且与EEG、MRI阳性率进行统计学比较均差异有统计学意义，表明CSF对于病毒性脑炎的诊断价值优于其他二项。

本组MRI平扫45例，阳性率68.89％。

这与MRI对自由水的变化极为敏感有关，脑组织中水分的轻微变化即可引起MRI信号强度的明显改变［5］。

在MRI异常的31例病例中，FLAIR序列异常28例，长T1WI14例，长T2WI18例，提示FLAIR序列的敏感性更强，这是因为FLAIR序列抑制了CSF信号，使CSF信号减弱为零，从而可避免CSF产生的部分容积效应及流动性伪影干扰病灶的显示［6］，在靠近CSF的区域形成了病变的高对比，弥补了T2WI的不足［5-6］。

EEG检查43例中异常21例，阳性率48.84％；

轻度异常为7例，中度异常为12例，重度异常为2例。

6例癫痫发作者表现为双侧散在性或阵发性棘波、尖波、棘慢复合波和尖慢复合波；

波幅变化主要表现为α、θ波和δ波波幅平坦或降低。

脑电图改变与病毒感染后临床症状和病情变化之间有良好的平行关系，临床症状愈重，脑电图频率愈慢，异常程度愈明显，并随着临床症状的缓解而逐步改善，且比临床症状和体征出现的早、恢复的晚［7-8］。

MRI检测阳性率高于EEG，提示在病毒性脑炎的诊断中MRI优于EEG。

BDV是一种中枢神经系统新发感染性病毒，能感染从啮齿类到灵长目几乎所有的温血动物。

现代研究表明其与人类某些神经精神疾病的发病有关［1］。

BDV是一种非细胞溶解和嗜神经性的单股负链RNA病毒［9］，基因组为8910bp，至少有6个可识别的开放读码框（Openreadingframe，ORF），其中以ORFⅡ最具有保守性，编码BDVP（p24），因此选择检测BDVp24基因片段来探讨BDV感染与病毒性脑炎的关系。

由于BDV具有高度嗜神经性，目前的研究认为磷蛋白通过干预星形胶质细胞对神经元的营养支持、HMGBI蛋白信号和神经营养蛋白信号等途径导致宿主神经元可塑性受损而出现脑功能障碍［10］。

我们通过FQ-nRT-PCR法检测我院50例病毒性脑炎患者的PBMCsBDVp24基因片段4例阳性，阳性率高于正常对照组。

阳性患者PBMCs的PCR扩增后终产物通过电泳验证，可见与目的片段大小一致的86bp电泳条带，且p24阳性PCR产物克隆后测序得到86bp核苷酸序列，证明是BDV基因片段。

由此可见不明原因的病毒性脑炎发病与BDV感染相关。

4例BDVp24基因片段阳性患者均有发热、头痛和CSF细胞学异常，4例均有局灶体征和脑膜刺激征，脑CT或MRI异常3例，意识障碍2例。

发病前均无上感或腹泻病史，以发热、头痛、颅内压增高的临床症状为主。

因此，本研究结果支持BDV是不明原因VE患者发病的一个重要生物因素，此结论与王振海［11］和徐平［12］等报道一致。

而BDV感染阳性率的报道各不相同，王振海［11］等检测52例VE患者PBMCs中BDVp24基因片段阳性率为9.6％；

徐平等检测52例VE患者PBMCs中BDVp24基因片段阳性率为13.46％［12］，本研究PBMCs中BDVp24基因片段阳性率为8%略低于以上报道，可能与分离PBMC方法、发病过程中检测时间和方法等有关，与受检人群的个体差异、地域差异及环境、污染因素等也可能相关［11］，尚待进一步探讨。

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