第二章 细胞生物学实验技术Word格式文档下载.docx

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1.515

1.66

　　制作光学镜头所用的玻璃折射率为1.65-1.78，所用介质的折射率越接近玻璃的越好。

镜口角总是要小于180?

，所以sinα/2的最大值必然小于1。

对于干燥物镜来说，介质为空气，镜口率一般为0.05-0.95；

油镜头用香柏油为介质，镜口率可接近1.5。

　　普通光线的波长为400-700nm，因此显微镜分辨力数值不会小于0.2μm，人眼的分辨力是0.2mm，所以一般显微镜设计的最大放大倍数通常为1000X。

（二）荧光显微镜

　　细胞中有些物质，如叶绿素等，受紫外线照射后可发荧光；

另有一些物质本身虽不能发荧光，但如果用荧光染料或荧光抗体染色后，经紫外线照射亦可发荧光，荧光显微镜可对这类物质进行定性和定量研究。

　　荧光显微镜和普通显微镜有以下的区别：

1.照明方式通常为落射式，即光源通过物镜投射于样品上；

2.光源为紫外光，波长较短，分辨力高于普通显微镜；

3.有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜和物镜之间的用于滤除紫外线，用以保护人目。

图2-2荧光显微镜的落射式照明

图2-3荧光显微镜照片（微管呈绿色、微丝红色、核蓝色）

图片来自http:

//www.itg.uiuc.edu

（三）激光共聚焦扫描显微境

　　激光共聚焦扫描显微镜（laserconfocalscanningmicroscope）用激光作扫描光源，逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。

由于激光束的波长较短，光束很细，所以共焦激光扫描显微镜有较高的分辨力，大约是普通光学显微镜的3倍。

系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内，调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机重新组合，就能显示细胞样品的立体结构，给出细胞内各部分之间的定量关系及各种结构线度。

　　激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的定量。

图2-4LCSM照片，蓝色为细胞核，绿色为微管

（四）暗视野显微镜

　　暗视野显微镜（darkfieldmicroscope）的聚光镜中央有当光片，使照明光线不直接进人物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。

利用这种显微镜能见到小至4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。

图2-5暗视野照明原理

（五）相差显微镜

　　相差显微镜（phasecontrastmicroscope）由P．Zernike于1932年发明，并因此获1953年诺贝尔物理奖。

这种显微镜最大的特点是可以观察未经染色的标本和活细胞。

　　相差显微镜的基本原理是，把透过标本的可见光的光程差变成振幅差，从而提高了各种结构间的对比度，使各种结构变得清晰可见。

光线透过标本后发生折射，偏离了原来的光路，同时被延迟了1/4λ（波长），如果再增加或减少1/4λ，则光程差变为1/2λ，两束光合轴后干涉加强，振幅增大或减下，提高反差。

在构造上，相差显微镜有不同于普通光学显微镜两个特殊之处：

　1.环形光阑（annulardiaphragm）位于光源与聚光器之间，作用是使透过聚光器的光线形成空心光锥，焦聚到标本上。

　2.相位板（annularphaseplate）在物镜中加了涂有氟化镁的相位板，可将直射光或衍射光的相位推迟1/4λ。

分为两种：

　　　√A+相板：

将直射光推迟1/4λ，两组光波合轴后光波相加，振幅加大，标本结构比周围介质更加变亮，形成亮反差（或称负反差）。

　　　√B+相板：

将衍射光推迟1/4λ，两组光线合轴后光波相减，振幅变小，形成暗反差（或称正反差），结构比周围介质更加变暗。

图2-6相差显微镜照明原理

图2-7一种介壳虫的染色体（PCM照片）

（六）偏光显微镜

　　偏光显微镜（polarizingmicroscope）用于检测具有双折射性的物质，如纤维丝、纺锤体、胶原、染色体等等，和普通显微镜不同的是：

其光源前有偏振片（起偏器），使进入显微镜的光线为偏振光，镜筒中有检偏器（实际也是一个偏振片），这种显微镜的载物台是可以旋转的，当载物台上放入单折射的物质时，无论如何旋转载物台，由于两个偏振片是垂直的，显微镜里看不到光线，而放入双折射性物质时，由于光线通过这类物质时发生偏转，因此旋转载物台便能检测到这种物体。

图2-8偏光显微镜下淀粉颗粒的形态

（七）微分干涉差显微镜

　　1952年，Nomarski在相差显微镜原理的基础上发明了微分干涉差显微镜（differentialinterferencecontrast（DIC）microscope）。

DIC显微镜又称Nomarski相差显微镜（Nomarkicontrastmicroscope），其优点是能显示结构的三维立体投影影像。

与相差显微镜相比，其标本可略厚一点，折射率差别更大，故影像的立体感更强。

　　DIC显微镜的物理原理完全不同于相差显微镜，技术设计要复杂得多。

首先DIC利用的是偏振光，有四个特殊的光学组件：

偏振器（polarizer）DIC棱镜、DIC滑行器和检偏器（analyzer）。

偏振器直接装在聚光系统的前面，使光线发生线性偏振。

在聚光器中则安装了石英Wollaston棱镜，即DIC棱镜，此棱镜可将一束光分解成偏振方向不同的两束光（x和y），二者成一小夹角。

聚光器将两束光调整成与显微镜光轴平行的方向。

最初两束光相位一致，在穿过标本相邻的区域后，由于标本的厚度和折射率不同，引起了两束光发生了光程差。

在物镜的后焦面处安装了第二个Wollaston棱镜，即DIC滑行器，它把两束光波合并成一束。

这时两束光的偏振面（x和y）仍然存在。

最后光束穿过第二个偏振装置，即检偏器。

在光束形成目镜DIC影像之前，检偏器与偏光器的方向成直角。

检偏器将两束垂直的光波组合成具有相同偏振面的两束光，从而使二者发生干涉。

x和y波的光程差决定着透光的多少。

光程差值为0时，没有光穿过检偏器；

光程差值等于波长一半时，穿过的光达到最大值。

于是在灰色的背景上，标本结构呈现出亮暗差。

为了使影像的反差达到最佳状态，可通过调节DIC滑行器的纵行微调来改变光程差，光程差可改变影像的亮度。

调节DIC滑行器可使标本的细微结构呈现出正或负的投影形象，通常是一侧亮，而另一侧暗，这便造成了标本的人为三维立体感，类似大理石上的浮雕。

　　DIC显微镜使细胞的细微结构，特别是一些较大的细胞器，如核、线粒体等，立体感特别强，适合于显微操作。

目前像基因注入、核移植、转基因动物等生物工程的显微操作常在这种显微镜下进行。

图2-9DIC显微镜下的硅藻形态

（八）倒置显微镜

　　组成和普通显微镜一样，只不过物镜与照明系统颠倒，前者在载物台之下，后者在载物台之上，用于观察培养的活细胞，通常具有相差物镜。

　　进入20世纪80年代以来，光学显微镜的设计和制作又有了很大的发展，其发展趋势主要表现在，注重实用性和多功能方面的改进。

在装配设计上趋于采用组合方式，集普通光镜加相差、荧光、暗视野、DIC、摄影装置于一体，从而操作灵活，使用方便。

图2-9尼康EclipseTE2000倒置显微镜

二、电子显微镜

（一）透射电子显微镜

1、基本原理

　　在光学显微镜下无法看清小于0.2μm的细微结构，这些结构称为亚显微结构（submicroscopicstructures）或超微结构（ultramicroscopicstructures；

uhrastructures）。

要想看清这些结构，就必须选择波长更短的光源，以提高显微镜的分辨率。

电子束的波长要比可见光和紫外光短得多，并且电子束的波长与发射电子束的电压平方根成反比，也就是说电压越高波长越短。

1932年Ruska发明了以电子束为光源的透射电子显微镜（transmissionelectronmicroscope，TEM），目前TEM的分辨力可达0.2nm。

　　电子显微镜与光学显微镜的成像原理基本一样，所不同的是前者用电子束作光源，用电磁场作透镜。

另外，由于电子束的穿透力很弱，因此用于电镜的标本须制成厚度仅有50nm的超薄切片。

这种切片需要用超薄切片机（ulra-microtome）制作。

电子显微镜的放大倍数最高可达近百万倍、由电子照明系统、电磁透镜成像系统、真空系统、记录系统、电源系统等5部分构成。

表2-2不同光源的波长

名称

可见光

紫外光

X射线

α射线

电子束

0.1Kv

10Kv

波长（nm）

390-760

13-390

0.05-13

0.005-1

0.123

0.0122

图2-10JEOL透射电子显微镜

2、制样技术

1）超薄切片

　　通常以锇酸和戊二醛固定样品，以环氧树脂包埋，以热膨胀或螺旋推进的方式推进样品切片，切片厚度20-50nm。

图2-11高尔基体的TEM照片

图片来自

2）负染技术

　　负染就是用重金属盐如磷钨酸或醋酸双氧铀对铺展在载网上的样品进行染色；

吸去染料，样品干燥后，样品凹陷处铺了一薄层重金属盐，而凸的出地方则没有染料沉积，从而出现负染效果，分辨力可达1.5nm左右。

图2-12肌动蛋白纤维的负染TEM照片

3）冰冻蚀刻

　　冰冻蚀刻（freeze-etching）亦称冰冻断裂（freeze-fracture）。

标本置于-100?

C的干冰或-196?

C的液氮中，进行冰冻。

然后用冷刀骤然将标本断开，升温后，冰在真空条件下迅即升华，暴露出了断裂面的结构。

冰升华暴露出标本内部结构的步骤称为蚀刻（etching）。

蚀刻后，再向断裂面上喷涂一层蒸汽碳和铂。

然后将组织溶掉，把碳和铂的膜剥下来，此膜即为复膜（replica）。

复膜显示出了标本蚀刻面的形态，可置于电镜下观察。

电镜下的影像即代表标本中细胞断裂面处的结构。

图2-13冰冻蚀刻与金属复型技术（图片来自CellandMolecularBiology,G.Karp2002）

图2-14酵母的冰冻断裂复型照片

（二）扫描电子显微镜

　　扫描电子显微镜（scanningelectronmicroscope，SEM）于20世纪60年代问世，用来观察标本的表面结构。

工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次级电子，次级电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次级电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电倍增管和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像。

图像为立体形象，反映了标本的表面结构。

为了使标本表面发射出次级电子，标本在固定、脱水后，要喷涂上一层重金属微粒，重金属在电子束的轰击下发出次级电子信号。

　　目前扫描电镜的分辨力为6-10nm，人眼能够区别荧光屏上两个相距0.2mm的光点，则扫描电镜的有效放大倍率为0.2mm/100nm=20000X。

图2-15扫描电子显微镜

图2-16光学显微镜、TEM、SEM成像原理比较

图2-17人类血细胞SEM照片

（三）扫描隧道显微镜

　　扫描隧道显微镜（scanningtunnelingmicroscope，STM）由Binnig等1981年发明，是根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。

当原子尺度的针尖在不到一个纳米的高度上扫描样品时，此处电子云重叠，外加一电压（2mV-2V），针尖与样品之间产生隧道效应而有电子逸出，形成隧道电流。

电流强度和针尖与样品间的距离有一指数关系，当探针沿物质表面按给定高度扫描时，因样品表面原子凹凸不平，使探针与物质表面间的距离不断发生改变，从而引起电流不断发生改变。

将电流的这种改变图像化即可显示出原子水平的凹凸形态。

扫描隧道显微镜的分辨率很高，横向为0.1-0.2nm，纵向可达0.001nm。

它的优点是三态（固态、液态和气态）物质均可进行观察，而普通电镜只能观察制作好的固体标本。

　　利用扫描隧道显微镜直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等的原子排列。

三、显微操作技术

　　显微操作技术（micromanipulationtechnique）是指在高倍复式显微镜下，利用显微操作器（micrcmanipulator）进行细胞或早期胚胎操作的一种方法。

显微操作器是用以控制显微注射针在显微镜视野内移动的机械装置。

　　显微操作技术包括细胞核移植、显微注射、嵌合体技术、胚胎移植以及显微切割等。

细胞核移植技术已有几十年的历史，Gordon等人（1962）对非洲爪蟾进行核移植获得成功。

我国著名学者童第周等在鱼类细胞核移植方面进行了许多工作，并取得了丰硕成果。

图2-18尼康NT-88NE显微操作/注射仪

　　现代细胞生物学发展是靠形态观察结合生物化学和分子生物学研究来推动的，没有这些相关学科的发展也就没有现代细胞生物学。

一、细胞化学技术

　　为了对某些细胞成分进行定性和定位研究，可依据化学反应原理，采用组织化学和细胞化学染色方法（histochem　icalandcytochemicalstainingmethod）加以显示。

细胞化学染色是利用染色剂可同细胞的某种成分发生反应而着色的原理，从而得以对某种成分进行研究和分析。

利用这种方法对细胞的各种成分几乎都能显示，包括有无机物、醛、蛋白质、糖类、脂类、核酸、酶等各种组织化学显示法。

（一）固定

　　目的是将细胞生前的结构和化学物质双重地保存下来，固定细胞的方法有：

1．物理固定：

血膜空气快速干燥、冷冻干燥。

2．化学固定：

如甲醇、乙醇、丙酮、甲醛、戊二醛和锇酸等试剂均能对细胞结构和其中的某些化学物质加以固定保存。

不同化学试剂所保存的化学成分、对酶活性的影响、保存结构的细腻度均不相同。

因此，要根据实验要求和组化反应，选择最佳的固定方法和固定剂。

如显示多糖常用乙醇固定，而显示酶类多用甲醛丙酮缓冲液固定。

（二）显示方法

　　1.金属沉淀法：

利用金属化合物在反应过程中生成有色沉淀，借以辨认所检查的物质或酶活性。

如磷酸酶分解磷酸酯底物后，反应产物最终生成CoS或PbS有色沉淀，而显示出酶活性。

　　2.偶氮偶联法：

酚类化合物与偶氮染料结合后可以形成耐晒染料。

　　3.Schiff反应：

细胞中的醛基可使Schiff试剂中的无色品红变为红色。

这种反应通常用于显示糖和脱氧核糖核酸（Feulgen反应）。

　　4.联苯胺反应：

过氧化酶分解H202。

产生新生氧，后者再将无色的联苯胺氧化成联苯胺蓝，进而变成棕色化合物。

　　5.普鲁士蓝反应：

三价铁与酸性亚铁氰化钾作用，形成普鲁士蓝。

　　6.Formazane反应：

显示脱氢酶。

　　7.“Nadi”反应：

显示细胞色素氧化酶。

　　8.脂溶染色法：

借苏丹染料溶于脂类而使脂类显色。

　　9.茚三酮反应：

显示蛋白质。

二、免疫细胞化学

　　免疫细胞化学（immunocytochemistry）是根据免疫学原理，利用抗体同特定抗原专一结合，对抗原进行定位测定的技术。

抗原主要为大分子或与大分子相结合的小分子；

抗体则是由浆细胞针对特定的抗原分泌的γ球蛋白。

如果将抗体结合上标记物，再与组织中的抗原发生反应，即可在光镜或电镜下显示出该抗原存在于组织中的部位。

常用的标记物有荧光素和酶。

标记荧光素的称为免疫荧光法（immunofluorescenttechnique）常用的萤光素有异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate）罗丹明（rhodamine）等。

酶标记的称为酶标免疫法（enzyme-labelledantibodymethod），常用的酶有辣根过氧化物酶（horseradishperoxidase），酶与底物发生反应后形成不透明的沉积物，从而显示出抗原存在的部位。

　　抗体与抗原的结合方法可分为直接法和间接法两种，直接法是将带有标记的抗体与抗原反应，显示出抗原存在的部位。

而间接法则是在抗体抗原初级反应的基础上，再用带标记的次级抗体同初级抗体反应，从而使初级反应得到放大，显示增强。

三、显微光谱分析技术

　　细胞中有一些成分具有特定的吸收光谱，核酸、蛋白质、细胞色素、维生素等都有自己特征性的吸收曲线。

例如，核酸的吸收波长为260nm，而蛋白质的则为280nm。

有的成分经组织化学染色后，对可见光有特定的吸收光谱。

根据细胞成分所具有的这种特性，可利用显微分光光度计对某些成分进行定位、定性，甚至定量测定。

四、放射自显影术

　　放射自显影术（radioautography；

autoradiography）用于研究标记化合物在机体、组织和细胞中的分布、定位、排出以及合成、更新、作用机理、作用部位等等，其原理是将放射性同位素（如14C和3H）标记的化合物导入生物体内，经过一段时间后，将标本制成切片或涂片，涂上卤化银乳胶，经一定时间的放射性曝光，组织中的放射性即可使乳胶感光。

然后经过显影、定影处理显示还原的黑色银颗粒，即可得知标本中标记物的准确位置和数量，放射自显影的切片还可再用染料染色，这样便可在显微镜下对标记上放射性的化合物进行定位或相对定量测定。

　　这种技术与电镜样品处理，则为电镜放射自显影。

　　由于有机大分子均含有碳、氢原子，故实验室一般常选用14C和3H标记。

14C和3H均为弱放射性同位素，半衰期长，14C为5730年，3H为12.5年。

一般常用3H胸腺嘧啶脱氧核苷（3H-TDR）来显示DNA，用3H尿嘧啶核苷（3H-UDR）显示RNA；

用3H氨基酸研究蛋白质，研究多糖则用3H甘露糖、3H岩藻糖等。

五、分子杂交技术

　　分子杂交技术（molecularhybridization）是在研究DNA分子复性变化基础上发展起来的一种技术。

其原理是，具有互补核苷酸序列的两条单链核苷酸分子片段，在适当条件下，通过氢键结合，形成DNA-DNA，DNA-RNA或RNA-RNA杂交的双链分子。

这种技术可用来测定单链分子核苷酸序列间是否具有互补关系。

（一）原位杂交（insituhybridization）。

　　这种方法既可检测染色体上的特殊DNA序列。

最初是使用带放射性的DNA探针，通过放射自显影来显示位置。

后来又发明了免疫探针法，将探针核苷酸的侧链加以改造，探针杂交后，其侧链可被带有荧光标记的抗体所识别，从而显示出位置。

图2-19人类染色体端粒DNA的荧光原位杂交照片（来自http:

//www.ornl.gov）

（二）Southern杂交

　　是体外分析特异DNA序列的方法，操作时先用限制性内切酶将核DNA或线粒体DNA切成DNA片段，经凝胶电泳分离后，转移到醋酸纤维薄膜上，再用探针杂交，通过放射自显影，及可辨认出与探针互补的特殊核苷序列。

六、PCR技术

　　聚合酶链式反应（polymerasechainreaction，PCR）用于将微量的目标DNA大量扩增，以便进行分析。

其过程是：

①合成一对寡核苷酸链（约18—20个核苷酸长）为引物（primer），用于扩增夹在双引物与模板DNA互补区的区域；

②将DNA片段样品溶解于反应缓冲液中，加入4种dNTP和一种耐高温的DNA聚合酶；

③将反应液置于PCR仪中，提高温度（约94℃）使DNA的两股链解离，立即下降温度至37℃，使之以解离的单链为模板，在引物的引导下合成模板单链的互补链，从而形成了DNA双链片段；

④再次上升温度至70-75℃，再次降温，重复前一步骤的变化。

如此反复升降温若干次，每一次解链和合成互补链为一个循环。

为了使DNA片段扩增到所需的量，大约要进行20—30次循环。

　　用于PCR反映的DNA聚合酶是从一种嗜热水生菌（Thermusaquaticus）中分离出来的，命名为TagDNA聚合酶。

此酶最适作用温度为75~80℃，但短时间在95℃下仍能不失活。

图2-20PCR原理

一、离心技术

　　离心是研究如细胞核、线粒体、高尔基体、溶酶体和微体，以及各种大分子基本手段。

一般认为，转速为10000-25000r/min的离心机称为高速离心机；

转速超过25000r/min，离心力大于89Kｇ者称为超速离心机。

目前超速离心机的最高转速可达80000r/min，离心力超过500Kg。

（一）差速离心（Differencialcentrifugation）

　　在密度均一的介质中由低速到高速逐级离心，用于分离不同大小的细胞和细胞器。

在差速离心中细胞器沉降的顺序依次为：

核、线粒体、溶酶体与过氧化物酶体、内质网与高基体、最后为核蛋白体。

由于各种细胞器在大小和密度上相互重叠，而且某些慢沉降颗粒常常被快沉降颗粒裹到沉淀块中，一般重复2～3次效果会好一些。

　　差速离心只用于分离大小悬殊的细胞，更多用于分离细胞器。

通过差速离心可将细胞初步分离，常需进一步通过密度梯离心再行分离纯化。

图2-21速度逐渐提高，样品按大小先后沉淀

（二）密度梯度离心

　　用一定的介质在离心管内形成一连续或不连续的密度梯度，将细胞混悬液或匀浆置于介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离。

这类分离又可分为速度沉降和等密度沉降平衡两种。

密度梯度离心常用的介质为氯化铯，蔗糖和多聚蔗糖。

分离活细胞的介质要求：

1）能产生密度梯度，且密度高时，粘度不高；

2）PH中性或易调为中性；

3）浓度大而渗透压不大；

4）对细胞无毒。

1、速度沉降

　　速度沉降（velocitysedimentation）主要用于分离密度相近而大小不等的细胞或细胞器。

生物颗粒（细胞或细器）在十分平缓的密度梯度介质中按各自的沉降系数以不同的速度沉降而达到分离。

这种降方法所采用的介质密度较低，介质的最