苹果果皮中总黄酮的提取方法优化研究Word文档格式.docx
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（2）了解了黄铜的结构和化学性质，学会了如何鉴定黄酮类化合物和学习植物中黄酮化合物的提取的一般方法，同时也了解了黄酮类化合物的药性功效。
（3）掌握标准曲线法测定原料药含量的方法及锻炼自己的实验操作技能。
2材料的选择
研究表明，苹果果实中含有丰富的黄酮类物质，主要集中在果皮部分，果肉和果心中的含量远远小于果皮的黄酮含量。
但是由于农药的残留、空气污染等诸多不利因素，人们在食用苹果时多将果皮弃去，却没有认识到在去除果皮的同时却丢弃了苹果最有营养价值的部分。
而且，黄酮化合物是广泛存在于水果和蔬菜中的一类次生代谢类物质,近来研究发现,它们具有很强的清除自由基能力,是苹果中的重要抗氧化物质来源。
苹果果实中含有丰富的黄酮类物质,且主要集中在果皮部分,果肉和果心中的黄酮含量远远小于果皮，苹果皮中的总多酚含量达307mg/100g，总黄酮为184mg/100g，原花青素为105mg/100g，这些数据是果肉所望尘莫及的。
所以在本次实验中我们挑选皮果皮来做实验原料。
若存在一种科学有效的提取方法将苹果皮中的总黄酮等抗氧化物质提取分离，加以充分利用，为食品加工业、化妆品工业以及医药业提供天然抗氧化剂资源，将为苹果的加工业开辟新的出路。
目前提取分离苹果中黄酮类物质还没有一个完善的方法，本研究旨在找到一个苹果果皮中总黄酮提取的最佳方法，为苹果的营养鉴定提供一个确切的黄酮含量测定标准，并为苹果的开发利用提供一个科学有效的理论依据。
3实验原理
3.1结构
黄酮类化合物（Flavonoids），又称物黄酮（Bioflavonoids）或植物黄酮。
黄酮类化合物泛指拥有15个碳原子的多元酚化合物，其中两个芳环（A环、B环）之间以一个三碳链相连，其骨架可用C6-C3-C6表示[1]。
基本结构如图1-1。
A
B
图1-1
黄酮（A）和异黄酮（B）的分子结构
根据中央三碳链的氧化程度、B环连接的位置（2-位或3-位）以及三碳链是否构成环等特点，可将黄酮类化合物进行不同分类。
3.2性质
游离的黄酮类化合物一般难溶或不溶于水，可溶于乙醇、乙酸乙脂、甲醇、乙醚等有机溶剂或稀碱中。
其中黄酮醇、黄酮、查耳酮等，因为分子中存在交叉共扼体系，所以是一类平面型化合物，平面型分子堆砌得比较紧密，分子间引力较大，故很难溶于水。
黄酮类化合物分子中有多个酚羟基，显酸性，可溶于乙醇.碱水溶液、吡啶、甲酰胺及二甲基甲酰胺中。
3.3分光光度
当一束强度为I0的单色光垂直照射某物质的溶液后,由于一部分光被体系吸收,因此透射光的强度降至I,则溶液的透光率T为:
根据朗伯（Lambert）-比尔（Beer）定律:
A=abc
式中A为吸光度，b为溶液层厚度（cm），c为溶液的浓度（g/dm^3），
a为吸光系数。
其中吸光系数
与溶液的本性、温度以及波长等因素有关。
溶液中其他组分（如溶剂等）对光的吸收可用空白液扣除。
由上式可知，当固定溶液层厚度l和吸光系数
时，吸光度A与溶液的浓度成线性关系。
在定量分析时，首先需要测定溶液对不同波长光的吸收情况（吸收光谱），从中确定最大吸收波长
，然后以此波长
的光为光源，测定一系列已知浓度c溶液的吸光度A，作出A~c工作曲线。
在分析未知溶液时，根据测量的吸光度A，查工作曲线即可确定出相应的浓度。
3.4显色反应
在中性或弱碱性及亚硝酸钠存在条件下，黄酮类化合物与铝盐生成螯和物，加入氢氧化钠溶液后显红橙色，在510nm波长处有吸收峰且符合定量分析的比尔定律，一般以芦丁标准品定量。
先用亚硝酸钠还原黄酮，
然后加入硝酸铝络合，最后加氢氧化钠溶液使黄酮类化合物开环，生成
2'
'
羟基查耳酮而显色。
显色原理发生在黄酮醇类成分邻位无取代的邻二酚羟基部位，不具有邻位无取代邻二酚羟基的黄酮醇类成分加入上述试剂时不显色
4实验材料
实验所用苹果样品为甘肃天水花牛苹果生产基地
4.1仪器
仪器
型号
数量
分光光度计
JH-722
1
水浴锅
HH-2
气流烘干器
KQ-B
电热干燥箱
HG202-2
比色皿
9
容量瓶
15
移液管
5
分析天平
烧杯
量筒
洗耳球
2
漏斗
3
滤纸
54
4.2药品：
药品
芦丁标准样品
硝酸铝
亚硝酸钠
无水
乙醇
氢氧化钠
用量
20mg
10g
5g
1L
8g
实验中所有的化学试剂均为分析纯。
5实验步骤
5.1溶液配制
（1）5%NaNO2溶液：
准确称取5g
NaNO2放置于烧杯中溶解，移至100mL容量瓶中并定容至刻线。
（2）10%
Al（NO3）3溶液：
准确称取10g
Al（NO3）3放置于烧杯中溶解，移至100mL容量瓶中并定容至刻线。
（3）4%NaOH溶液：
准确称取4gNaOH放置于烧杯中溶解，移至100mL容量瓶中并定容至刻线。
（4）55%乙醇：
称取无水乙醇150g，加入水122.7g，配制成55%的乙醇
（5）65%乙醇：
称取无水乙醇150g，加入水80.77g，配制成65%的乙醇
（6）75%乙醇：
称取无水乙醇150g，加入水80.77g，配制成75%的乙醇
5.2标准曲线的制作
本研究以芦丁作为苹果总黄酮含量测定的标准品。
（1）波长的选择取样品液适量，在0.5
mL
5%亚硝酸钠溶液存在的碱性条件下，经硝酸铝显色后，以试剂为空白参比液在450～550
nm波长范围测定络合物的吸光度,并找出最大吸收波长。
（2）准确称取芦丁标准品20mg，用95%的乙醇溶解，定容到100mL的容量瓶中，再精确从中量取25mL至50mL的容量瓶中，用95%的乙醇稀释定容，得到浓度为100μg/mL的芦丁标准溶液。
准确吸取该溶液0.0，1.0，2.0，3.0，4.0mL，分别置于25mL试管中，加入5%的NaNO2溶液0.5mL，混匀后放置6min，然后加入0.5mL的10%的Al（NO3）３溶液，摇匀后放置6min。
最后加入4%的NaOH溶液4mL，用95%乙醇定容至25mL,摇匀，放置15～20min，以上述8种溶液为标准品溶液，在510nm测定不同浓度的标准品的吸光值。
5.3条件实验
（1）温度对总黄酮提取的影响：
设定温度为：
55℃、65℃、75℃
乙醇浓度为：
65%；
提取时间为：
2h
（2）乙醇浓度对总黄酮提取的影响：
设定乙醇浓度为：
55%、65%、75%
温度为：
65℃；
（3）提取时间对总黄酮提取的影响：
设定提取时间为：
1h、2h、3h
65℃；
乙醇浓度为：
65%
（4）pH对总黄酮提取的影响：
设定pH为8、9、10、11
温度为65℃、乙醇浓度65%、时间2h
取出样品进行过滤，过滤完后，再进行一次过滤，收集滤液试管中，移取2.5ml于50ml的容量瓶中并定容至50ml,摇匀，用移液管移取5mL于试管中，加入5%的NaNO2溶液0.5ml，混匀后放置4-6min，然后加入0.5mL的10%的Al（NO3）３溶液，摇匀后放置4-6min。
最后加入4%的NaOH溶液4mL，摇匀，放置15～20min，测其吸光度。
按上述标准的显色方法测定总黄酮含量，按下式计算总黄酮得率。
总黄酮得率%=【量取液浓度（mg/mL）*体积（mL）*稀释倍数】/[称去样品干重（g）*1000]
6实验结果
表一：
不同波长对吸光度的影响结果
波波长nm
4460
4470
4480
4490
5500
5510
5520
550
5540
5550
吸光度A
00.104
00.111
00.113
00.116
00.119
0.124
00.112
00.101
00.092
00.087
表二：
不同波长对吸光度的影响曲线
表三：
溶液分光光度测量结果
标准品溶液浓度ug/ml
10
20
30
40
0.023
0.272
0.342
0.415
表四：
芦丁标准曲线的绘制
由表一数据，根据标准曲线的制作方法，以浓度（c，ug/ml）为横坐标，吸光值（A722）为横坐标，进行线性回归，得到回归方程：
y=0.01002x+0.0348r2=0.9898
表五：
温度对黄酮提取量的影响（乙醇浓度设为65%2h）
温度℃
55
65
75
黄酮含量%
0.637
1.272
1.166
表六：
乙醇浓度对黄酮提取量的影响（温度设为65℃时间h）
乙醇浓度%
55%
75%
0.846
0.833
表七：
提取时间对黄酮提取量的影响（温度设为65℃乙醇浓度65%）
时间h
0.933
0.999
提取时间对黄酮提取量的影响（温度设为65℃乙醇浓度65%时间2h）
pH
8
11
1.013
1.151
1.115
7实验讨论
（1）由所得数据得到络合物于510
nm波长处有最大吸收，故测定时选用此波长。
（2）用最小二乘法做线性回归，得到芦丁标准溶液吸光度A与浓度C的关系曲线的回归方程
为：
Y=0.01002X+0.0348r2=0.9898
比色溶液显色后，在5小时内的吸光度的变化小于5%，黄酮类物质与铝盐生成的络合物显色稳定，说明分光光度法以芦丁为标准样品测定总黄酮含量稳定可靠，且简单易行。
（3）由图表知浴温度对总黄酮得率的影响：
黄酮提取量先随温度升高而升高，当达到65℃以后又开始降低，所以低温和较高温度都不利于总黄酮的提取。
温度过低降低了黄酮的溶解度低，而不能充分地把果皮中总黄酮完全提取，而温度较高时，黄酮类化合物的稳定性差，易发生氧化作用而失效，造成总黄酮得率降低。
（3）由图表知乙醇浓度对总黄酮提取的影响：
黄酮提取量先随乙醇浓度升高而升高，当达到65%以后又开始降低，乙醇的浓度较大和较低时，总黄酮的得率都比较低，表明苹果中的黄酮类化合物具有一定的水溶性。
65%的乙醇兼有极性、非极性和中等极性的特点，适合提取混合物成分。
另外，与甲醇相比，用乙醇作溶剂具有无毒、无异味、无残留、安全性好等优点。
（4）由图表知提取时间对总黄酮提取的影响：
黄酮提取量先随时间升高而升高，当达到2h以后又开始降低，所以并非时间越久越好，提取2个小时与提取3个小时差异不是很明显，而且时间较久时提取量还有下降的趋势，原因可能是因为黄酮的稳定性较差，时间较长时易发生氧化反应，在高温提取过程中分解变性，致使黄酮的率降低。
（5）由图表知pH对总黄酮提取的影响：
黄铜提取量先随着pH升高而升高，pH当达到10时，黄铜提取量又开始降低，可能原因是pH较高时含有的NaOH溶质较多，而造成分析结果出现干扰，因此pH=10时提取效果最好。
（6）本体是一个单因素实验，按全面实验要求，须进行3^3=27种组合的实验，且尚未考虑每一组合的重复数。
全面试验的最大优点是所获得的信息量很多,可以准确地估计各实验因素的主效应的大小,还可估计因素之间各级交互作用效应的大小;
其最大缺点是所需要的实验次数最多,因此耗费的人力、物力和时间也较多,当所考察的实验因素和水平较多时,研究者很难承受。
8注意事项
（1）苹果皮的烘干度要一致，最好就一次性把整个实验所需的材料烘干好。
（2）选择合适的溶剂，所选的溶剂要对所提取的成分的溶解性大，对杂质的溶解度小，而且毒性要小。
（3）注意加入适量的溶剂，在水浴的过程中有必要的隔一段时间摇匀混合物。
（4）关闭水嘴后要先加水到水位线，再接通电源，但水浴锅的水位不能加得过高，以防止水溢出造成安全事故的发生，水浴锅不使用或进行修理时，应切断电源，以保证安全。
（5）要从小到大依次稀释提取液的倍数，使待测液的吸光度能在标准曲线的范围内。
（6）采用NaNO2-Al（NO3）3比色测定时，每加入亚硝酸钠，硝酸铝或氢氧化钠是都要摇匀后静止，且要保证每次测定都要使摇匀时间保持一致。
（7）比色皿使用完毕后要立即用蒸馏水冲洗干净，并用吸水纸吸干比色皿中的水以防止表面光洁度被破坏，影响比色皿的透光率，同时取拿比色皿时，手指只能捏住比色皿的毛玻璃面，而不能碰比色皿的光学表面。
（8）为防止光电管疲劳，不测定时必须将试样室盖打开，使光路切断，以延长光电管的使用寿命。
参考文献
1许任生，天然产物化学导论，---北京：
科学出版社，2006
2杨世林，杨学东，刘云主编，天然产物化学研究，---北京：
科学出版社，2009
3李炳奇，廉宜君主编，天然产物化学实验技术，---北京：
化学工业出版社，2012.1
4唐浩国，黄酮化合物的研究[M]，---北京：
化学工业出版社，2009
5武汉大学主编，分析化学实验，---北京：
高等教育出版社，2012.3
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