兔子免疫程序.docx

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兔子免疫程序

小鼠免疫程序

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一、抗原的准备

1、收到抗原时，首先要了解抗原的种类、性质和浓度，以便采取不同的处理方法。

2、多肽抗原，一般分多肽—偶联KLH和多肽—偶联BSA（或GGG）或裸多肽三种。

多肽—偶联KLH一般用于免疫，而多肽—偶联BSA或裸肽一般用于检测，在免疫时注意区分使用。

3、分装

（1）收到抗原后，应及时按免疫需要分装，避免反复冻融。

（2）如抗原是大肠杆菌重组蛋白，可能存在不溶性沉淀，分装前，应用超声粉碎仪粉碎，要注意，在冰浴中进行，超声强度应以溶液不产生泡沫的水平为准，超声强度过大，易产生泡沫导致蛋白变性，超声强度太低效果不佳，每次2-3秒，重复3-4次，超声完毕立即分装。

（3）分装管应用不粘附蛋白的样品管，要用二种不同颜色的标签明确区分免疫用抗原和检测用抗原，并写明分装日期，抗原名，浓度和剂量。

A免疫用抗原：

一般50ug/每只小鼠×5只=250ug/1个分装管，备做首次免疫用。

另分装2个100ug/1管，备做融合前加强免疫用，再分装25ug/只/×5=125ug/1个分装管，共分装4-5管，备加强免疫用。

B检测用抗原：

100ug/每管，分装共3管。

C分装好的抗原除马上免疫用管外，其余均装入小塑料袋中，写好抗原名标签，马上存入-700C。

剩余抗原交保管员存-700C，并填好交接班表格。

二、免疫程序

1、多肽类抗原（包括MAP型多肽），第一次用福氏完全佐剂，每只50-100ug,腹腔注射，总剂量0.5ml/只，第二次起用福氏不完全佐剂，剂量为25-50ug/0.5ml/只，间隔3周，第三次注射后10天测血（ELISA法），如滴度未达到1:

104,OD1.0以上，则继续免疫，如ELISA已达滴度，则可取血清送WB或ICC检测。

2、蛋白类抗原：

所用抗原的剂量等与多肽类相同，但进程有差异，首次免疫21天后，第二次免疫后，每次间隔为10天。

三、抗原的乳化

抗原乳化前，应检查抗原管有否颗粒状沉淀，如有沉淀，应超声粉碎后，立即溶解在0.01MPH7.2PBS中（PBS应为无菌液），每只小鼠腹腔注射总量0.5ml，用2-5ml注射器，取1.25ml含抗原的PBS，另一支注射器取（等体积）福氏完全佐剂或不完全佐剂，用不锈钢连接接头连接，反复推拉混合约10-30分钟，平放静置30分钟，如水乳相不再分离，即可注射小鼠。

1.将抗原蛋白溶于生理盐水中（可以溶解为0.2mg/mL的抗原溶液）；

2.与等体积的弗氏完全佐剂双推法混匀（此时抗原浓度约0.1mg/mL）；

3.经腹部皮下多点注射免疫BALB/C小鼠（注射约0.25mL）；

4.2周后用等量抗原与不完全弗氏佐剂同上法混匀后免疫；

5.再过1周后连续每周用以上4.的方法加强免疫1次（抗原可减半），共3次；

6.最后一次免疫3d后，可通过断尾取血测血清效价，若达到预期目的，即可放血收集抗血清。

这是一般常用程序，最佳程序与你所用的抗原类型、免疫方法、佐剂类型等有关，需要通过实验确定

多抗制备动物免疫

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449发布时间：

2012-3-19

制备好抗原后，就要进行动物免疫了，免疫这一步除了动物自身的因素外，实验者也要有良好的计划才能得到更好的免疫效果。

这里就几个常见的问题作一下简单的讨论。

动物的选择。

常见的可以用来制备抗体的动物有：

小鼠（Mouse）、大鼠（Rat）、豚鼠（Guineapig）、仓鼠（Hamster）、兔（Rabbit）、绵羊（Sheep）、山羊（Goat）、马（Horse）、驴（Donkey）、奶牛（Cow），还有的还用鸡或者鸭的。

选择动物无非就是考虑两个问题，第一个问题是能否具有较好的免疫效果。

特别是对于抗原是蛋白质的情况，为了保证免疫成功，就要求宿主动物与抗原来源物种之间需要有较远的亲缘关系，如果不太确定亲缘关系的远近，可以把抗原的序列与被免疫的动物相应的蛋白的序列进行一个对比，优先选择同源性较低的物种进行免疫。

选择动物的第二个问题是抗血清产量的问题，其实很多情况下需要的血清量就很大程度上限制了选择余地。

根据实验目的不同，抗血清的用量也有所不同。

比如说只想做几次WesternBlot只需要一点点血清就够了，此时就可以选用小鼠这样的小动物，而如果想生产二抗作为商业使用，则可选用羊、驴、马这样的大型动物，大型动物还可以进行多次放血，以提高动物的利用率。

这里列几种常见的物种以及它们的血清产量：

物种

抗血清产量（含血液中其它成份）

小鼠

每次可采0.1-0.2ml，每月可采两次。

也可以一次放血，产量约为1-1.5ml。

豚鼠

每次可采1-2ml，每月可采两次。

也可以一次放血，产量约为10-15ml。

兔

每次可采20ml，每月可采两次。

也可以一次放血，产量约为100ml。

山羊

每次可采血800ml，每月可采两至三次。

马

每次可采血3L，每月可采两次。

一年可以采10L以上。

如果是制备单克隆抗体，那选择的余地就更小了，目前主流做单抗的动物主要有小鼠、兔、大鼠。

而且除了Epitomics公司外，其它单位是不可以制备兔单抗的（已申请专利）。

另外需要指出的是，实验动物都有相应的法律法规，在进行实验之前需要参考相应的规定，只有获得了相关的资质才可以进行实验。

实验动物也由相应的机构繁殖和保种，选择动物应该使用特定的动物品系，以保证实验的稳定性。

免疫佐剂（Adjuvant）。

免疫佐剂主要有两个作用：

一是刺激机体引起免疫反应，另一个作用是将抗原包起来延缓释放，起到相当于多次刺激的效果。

可以用来制备抗体的免疫佐剂主要有这么几类：

铝盐、油乳、脂质体、CpG、细胞因子、经过处理的微生物或其代谢物。

关于它们各自的特性我这里就不作详细的介绍了，有兴趣的可以看看这篇文献：

《我国免疫佐剂的研究进展》（刘悦竹，2008）。

目前应用得比较广泛的商品化佐剂主要有三种：

弗氏佐剂（Freund'sAdjuvant）、RibiAdjuvant、Titermax。

弗氏佐剂是应用最多的佐剂，分为弗氏完全佐剂（Freund'sCompletAdjuvant,FCA）和弗氏不完佐剂（Freund'sIncompleteAdjuvant,FIA），弗氏完全佐剂由石蜡油和羊毛脂以及结核分枝杆菌的细胞壁成分组成，它是细胞免疫的刺激剂。

弗氏不完全佐剂不含分枝杆菌，其它同弗氏完全佐剂。

弗氏不完全佐剂仅能刺激体液免疫。

通常在免疫动物时，先使用弗氏完全佐剂进行首次免疫，后用弗氏不完全佐剂作为加强免疫，二者使用前都需要与抗原进行完全乳化。

弗氏佐剂会引起动物局部肉芽肿或者无菌性脓肿，人体接触可能导致风湿病，误入眼睛可能造成失明，因此在操作时需要注意防护。

Ribi佐剂则采用可被代谢的角鲨烯代替矿物油，同时它也含有分枝杆菌的成份，与弗氏佐剂相比，它毒性小，可以减小动物的局部接种反应，但是同样可以产生高亲和力的抗体（抗原为蛋白质）。

Titermax不像弗氏佐剂和Ribi那样是油包水的结构，而是由角鲨烯和非离子型嵌段聚合物组成，此聚合物是由疏水性的聚氧丙烯和亲水性的聚氧乙烯形成的异分子多聚体组成的。

由于同时存在亲水部分和疏水部分，故可以和抗原形成稳定的乳浊液。

Titermax毒性低，但是价格贵，而且对于弱免疫原性的抗原能否引起机体的免疫反应尚存在争议。

另外向大家推荐一款国产的佐剂，由北京康碧泉公司研制，商品名叫Quickantibody，此佐剂不含蛋白质成分，而且免疫方式简单，无需乳化抗原（只需要简单混合即可免疫），同时免疫周期短，抗原用量少，推荐大家使用。

佐剂和抗原的乳化 大部分佐剂在使用前都需要乳化，很多网友问起过乳化方法的问题，在这里我简单地向大家介绍几种我个人觉得比较好的方法吧。

先来了解一下怎么样才算乳化好了。

对于弗氏佐剂这类油包水结构的佐剂来说，乳化完成后，可以取一滴乳化过的液滴滴在一杯清水里，看看此液滴是否分散，如果不分散则表明乳化完全，否则还要接着乳化。

关于乳化的方法，比较好用的有三种：

第一种比较费时间，就是将抗原和佐剂放在EP管里，然后用枪反复吹打，然后放在涡旋仪上反复涡旋。

第二种方法就是将抗原和佐剂用枪混合后放在超声破碎仪下超声，这个方法比较快速，但是需要一个配有小探头的超声破碎仪。

第三种方法也就最简单最常用的方法了：

准备好两个玻璃注射器和一个鲁尔接头，将抗原和佐剂用枪在EP管内混合好，然后吸入一个注射器内，再用鲁尔接头将另一个注射器与它接上，把抗原和佐剂来回在两个注射器内推动，两分钟左右就可以完成乳化工作。

如果没有鲁尔接头，也可以用一小截一次性输液管将两个注射器连接，不过有网友反映这个不是很好用。

免疫方案

（1）免疫部位：

常见的免疫部位有皮下、肌肉、腹腔、脚垫、静脉、脾脏。

大型动物多为皮下或肌肉免疫，小型动物可采用后面的免疫部位。

制备多抗时，整个流程可采用同一种免疫部位，也可以多种部位联合使用，但是初次免疫都建议在皮下进行。

在制备单抗时，甚至还可以将脾脏取出进行体外免疫，脾脏免疫最大的优势就是可以大大减小免疫剂量并缩短周期，而且还可以解决高同源性蛋白无法免疫成功的问题。

但体外免疫不能形成完整的免疫应答反应，抗体无法成熟，所产生的抗体全部为IgM，不能产生其它类型的抗体。

对体外免疫感兴趣的朋友可以看看这篇文献：

《体外免疫法制备单克隆抗体的研究》（陆芹章，1994）。

（2）免疫形式。

抗原通常需要与佐剂混合充分后才进行免疫，也有改进不用佐剂的方法，比如可以将抗原跑SDS-PAGE胶，然后将胶进行磨碎充分即可进行免疫，这样可以将抗原（蛋白质类抗原）纯化，而且还可以延缓抗原的释放。

也有人将抗原从SDS-PAGE胶上转移到NC膜上或者PVDF膜上然后将其磨碎进行免疫，还有人将抗原连接到琼脂颗粒等固相载体上，这样可以增加抗原的颗粒化程度，也可以增大抗原与机体免疫应答系统的接触。

（3）免疫剂量。

免疫剂量根据被免疫的动物、免疫部位以及抗原的本身的特性相差很远。

如果用兔制备多抗，首次免疫（皮下）一般在200-1000ug之间，对于大鼠，首次免疫（皮下）为100-500ug，对于小鼠，首次免疫（皮下）一般在10-100ug之间，加强免疫一般为首次免疫剂量的20%-50%。

尾静脉或脾内方式加强则可减至几微克至十微克。

对于体型比较大的动物可酌量增加（不能按照体重比增加），具体的用量请大家参考文献。

（4）免疫周期。

首次免疫后，一般在10-15d左右抗体的产量会达到一个峰值，但是此时抗体亲和力不够，大部分都是IGM，因此需要进行加强免疫，加强免疫一般在首次免疫后三至四周进行。

第二次、第三次加强免疫间隔可以缩短至2-3周。

这个时间不太能长也不能太短，太短起不到加强的效果，而且还容易引起免疫耐受，如果相隔太久，则前面的免疫将失去初步刺激的效果。

如果是采用脾内免疫，则可以在一定程序上缩短免疫周期。

实验一  免疫血清的制备

一、实验目的

  熟悉免疫血清的制备过程；

  了解动物实验的基本知识。

二、实验原理

  将抗原物质经适当途径，按照预先制定的免疫方案免疫动物，经过一定时间，可刺激机体产生特异抗体并释放入血液，当血中抗体达到一定效价时采血，分离血清，即为特异性免疫血清（又称为抗血清）。

因抗原具有多种表位，可激活多个克隆的B细胞活化产生抗体，因此，这种免疫血清又称为多克隆抗体。

  本实验以绵羊红细胞（SRBC）作为免疫原，以家兔为免疫动物，制备兔抗养红细胞免疫血清（也称为溶血素）

三、器材和材料

1.动物  健康成年家兔，雄性，体重2-3kg；健康成年绵羊。

2.试剂  生理盐水、碘酒、75%酒精。

3.器材  剪刀、镊子、无菌注射器、量筒、无菌毛细滴管、无菌试管、离心管、三角烧瓶（200ml）、动物固定架、手术器械一套、塑料放血管等。

四、    实验步骤

1.抗原制备 

（1）用碘酒和75%消毒绵羊皮肤，抽取颈静脉血液，注入含有等量阿氏液的三角烧瓶内，混匀