实验室啤酒发酵实验讲义.docx

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实验室啤酒发酵实验讲义

实验室啤酒发酵实验

一、实验目的：

熟悉静止培养操作，观察啤酒发酵过程，掌握发酵过程中一些指标的分析操作技能。

二、实验原理：

啤酒酵母将麦芽汁发酵，产生酒精等发酵产物（啤酒）。

三、实验器材：

⑴.50升发酵罐。

⑵.0~10OBX糖度表。

（3）.10℃-30℃可调生化培养箱。

培养基：

1.麦芽汁发酵培养基10Plato,50升，糖化制取。

2.麦芽汁琼脂培养基：

麦芽汁加2％琼脂，自然pH。

3.麦芽汁液体培养基：

酵母扩大培养用。

菌种：

啤酒生产用酵母菌株。

四、实验步骤：

（1）麦汁制备

（2）酵母菌种分离纯化与质量鉴定

（3）菌种扩大培养

（4）啤酒主发酵：

麦汁50升，10OBX，11℃→接种量1.5×107个细胞/mL→主发酵，11℃，5~7天→至4.0OBX时结束（嫩啤酒）。

在主发酵过程中，每天测定下列项目：

糖度、细胞浓度、出芽率、染色率、酸度、α-氨基氮、还原糖、酒精度、pH、双乙酰。

然后以时间为横坐标，这些指标为纵坐标，叠画于方格纸上。

（5）后发酵

五、作业要求

（1）.画出发酵周期中上述上述指标的曲线图，并解释它们的变化。

（2）.记下操作体会与注意点。

实验一协定法糖化试验

一、实验目的：

协定法糖化试验是欧洲啤酒酿造协会（EBC）推荐的评价麦芽质量的标准方法，我们用该法进行小量麦芽汁制备，并借此评价所用麦芽的质量。

二、实验原理：

利用麦芽所含的各种酶类将麦芽中的淀粉分解为可发酵性糖类，蛋白质分解为氨基酸（具体参见理论部分第二节）。

三、实验器材和试剂：

1实验室糖化器：

由水浴和500~600mL的烧杯组成糖化仪器，杯内用玻棒搅拌或用100℃温度计作搅拌器（此时搅拌应十分小心，以免敲碎水银头）。

实验时杯内液面应始终低于水浴液面。

最好采用专用糖化器：

该仪器有一水浴，水浴本身有电热器加热和机械搅拌装置。

水浴上有4~8个孔，每个孔内可放一糖化杯，糖化杯由紫铜或不锈钢制成，每一杯内都带有搅拌器，转速为80~100转/分，搅拌器的螺旋桨直径几乎与糖化杯同，但又不碰杯壁，它离杯底距离只有1~2mm。

2白色滴板或瓷板，玻棒或温度计。

3滤纸，漏斗，电炉。

4碘溶液，0.02N：

2.5克碘和5克碘化钾溶于水中，稀释到1000毫升。

四、实验步骤

1.协定法糖化麦汁的制备

（1）取50g麦芽，用植物粉碎机将其粉碎。

（2）在已知重量的糖化杯（500~600mL烧杯或专用金属杯）中，放入50g麦芽粉，加200mL46~47℃的水，于不断搅拌下在45℃水浴中保温30分钟。

（3）使醪液以每分钟升温1℃的速度，升温加热水浴，在25分钟内升至70℃。

此时于杯内加入100mL70℃的水。

（4）70℃保温1小时后，在10~15分钟内急速冷却到室温。

（5）冲洗搅拌器。

擦干糖化杯外壁，加水使其内容物准确称量为450g。

（6）用玻棒搅动糖化醪，并注于干漏斗中进行过滤，漏斗内装有直径20厘米的折叠滤纸，滤纸的边沿不得超出漏斗的上沿。

（7）收集约100mL滤液后，将滤液返回重滤。

过30分钟后，为加速过滤可用一玻棒稍稍搅碎麦槽层。

将整个滤液收集于一干烧杯中。

在进行各项试验前，需将滤液搅匀。

2.糖化时间的测定

⑴在协定法糖化过程中，糖化醪温度达70℃时记录时间，5分钟后用玻棒或温度计取麦芽汁1滴，置于白滴板（或瓷板）上，再加碘液1滴，混合，观察颜色变化。

⑵每隔5分钟重复上述操作，直至碘液呈黄色（不变色）为止，记录此时间。

由糖化醪温度达到70℃开始至糖化完全无淀粉反应时止，所需时间为糖化时间。

报告以每5分钟计算：

如<10分钟

10~15分钟

15~20分钟等

正常范围值

浅色麦芽：

15分钟内

深色麦芽：

35分钟内

3.过滤速度的测定

以从麦汁返回重滤开始至全部麦芽汁滤完为止所需的时间来计算，以快、正常和慢等来表示，1小时内完成过滤的规定为“正常”，过滤时间超过1小时的报告为“慢”。

4.气味的检查

糖化过程中注意糖化醪的气味。

具有相应麦芽类型的气味规定为“正常’,因此对深色麦芽若有芳香味，应报以“正常”；若样品缺乏此味，则以“不正常”表示，其它异味亦应注明。

5.透明度的检查

麦汁的透明度用透明、微雾、雾状和混浊表示。

6.蛋白质凝固情况检查

强烈煮沸麦芽汁5分钟，观察蛋白质凝固情况。

在透亮麦芽汁中凝结有大块絮状蛋白质沉淀，记录为“好”；若蛋白质凝结细粒状，但麦汁仍透明清亮，则记录为“细小”；若虽有沉淀形成，但麦芽汁不清，可表示为“不完全”；若没有蛋白质凝固，则记录为“无”。

五、注意事项：

粉碎最好用EBC粉碎机，若用1号筛粉碎，细粉约占90%，用2号筛粉碎细粉约占25%。

对溶解度好的麦芽，建议用2号筛。

因为细粉太多影响过滤速度。

一般要求粗粒与细粒（包括细粉）的比例达1：

2.5以上。

麦皮在麦汁过滤时形成自然过滤层，因而要求破而不碎。

如果麦皮粉碎过细，不但会造成麦汁过滤困难，而且麦皮中的多酚、色素等溶出量增加，会影响啤酒的色泽和口味。

但麦皮粉碎过粗，难以形成致密的过滤层，会影响麦汁浊度和得率。

麦芽胚乳是浸出物的主要部分，应粉碎得细些。

为了使麦皮破而不碎，最好稍加回潮后进行粉碎。

六、思考题：

糖化过程中麦芽中各种酶的作用。

实验二啤酒酵母纯种分离

一、实验目的：

学习酵母菌种的纯种分离技术

二、实验原理：

关于纯种分离，在基础微生物学实验中已学过稀释分离法和划线分离法，这里不再重复。

这两种方法虽然简单，但并不能保证分离所得种的纯度。

而单细胞分离法因可用显微镜直接检查，其纯度能得到充分保证。

林德奈单细胞分离法，即小滴培养法，是将酵母菌液充分稀释至每一小滴差不多含一个酵母细胞，然后在显微镜下确证只含一个细胞的小滴，经适当培养后，扩大保存。

盖玻片上小滴点样示意图凹载片上湿室小滴培养适宜图

三、实验器材与试剂：

显微镜，凹载玻片，计数板，盖玻片等。

四、实验步骤：

1.取2块盖玻片，用分析天平称重（精确至0.1mg）后，在一块盖玻片（最好用血球计数板的盖玻片）上用毛细滴管滴上9滴酵母培养基，合上另一玻片，再称重，计算每滴培养基的体积。

2.用计数板计数酵母菌，用培养基对其进行高倍稀释，稀释至每滴培养基中大致含一个酵母菌。

3.在已灭菌的盖玻片上滴上酵母稀释液（每张玻片可滴9滴），放于已灭菌的凹载玻片上，显微镜下观察，找到只含一个酵母菌的小滴，做上记号。

4.30℃培养一定时间后（应放于湿室中），用无菌滤纸片吸走标记的酵母菌，进行扩大培养和菌种保藏。

五、注意事项：

因小滴易干，操作时动作要快，培养时要用湿室。

六、思考题：

称重时为什么要用两块盖玻片？

是否可以用微量移液器（如1微升）来代替称重？

实验三啤酒酵母的计数

一、实验目的：

学习用血球计数板计数酵母数量的方法，

二、实验原理：

啤酒发酵时，必须接入一定数量的酵母细胞；在发酵过程中，为了跟踪发酵的进程，判断发酵是否正常，也有必要测定悬浮酵母细胞的浓度。

酵母菌的计数常用血球计数板方法。

血球计数板是一块长方形的玻璃板，被四条凹槽分隔成三个部分，中间部分又被一横槽隔成上下两半，每一半上各刻有一个方格网，方格网的边长为3mm,分为9个正方形大格，每一大格为1mm2,其中中间那个大格被横向和纵向的双线分成25（或16）个中格，每个中格又被单线分成16（或25）个小格，因此一个大格中共有25×16=400个小格。

这样的一个大格就是一个计数室。

由于计数室比板表面要低0.1mm,因此盖上盖玻片后，整个计数室的容积就是0.1mm3,相当于0.0001mL。

计数时，先让计数室中充满待检溶液，然后计数400个小格中的细胞总数，就可换算出1mL发酵液中的总菌数。

三、实验器材：

显微镜，血球计数板，盖玻片等。

四、实验步骤：

1.取清洁的血球计数板一块，平放于桌面上，在计数室上方加盖专用盖玻片；

2.取酵母菌液（发酵液）一小滴，滴至盖玻片的边缘，让菌液渗入计数室内，注意计数室内不能留有气泡。

3.静置5分钟，让酵母细胞稳定附着于计数室内；

4.将计数板置于显微镜的载物台上，先用低倍镜找到计数板的方格网，并移至视野中间（寻找时可通过缩小光圈，降低聚光镜，开低电源电压等方式减少进光量，使视野稍偏暗）；

5.找到计数室位置（中间一个大方格），并看清由双线包围的中方格（16或25格）及由单线包围的小方格（共400格）；

6.计数大格内的酵母细胞总数，必要时可在高倍镜下观察。

若酵母细胞过多，可采取

（1）：

稀释后再计数；

（2）：

有代表性地选择左上，左下，右上，右下，中间五个中方格，计数其内的菌数，求得每个中格的平均值，然后乘以中方格数（25或16），即得每个大格内的细胞总数；

（3）：

在上述5个中方格中选择处于顶角的4个小方格，计数，计算20个小方格中的总菌数，再乘以20，即得大格内的细胞总数。

7.计算：

酵母细胞数/mL=大格中的细胞总数×10000×稀释倍数

8.血球计数板的清洗：

将血球计数板立即用流水冲洗干净，若菌液变干，酵母细胞被固定在计数板上，则很难用流水冲洗干净，必须用优质脱脂棉湿润后轻轻擦洗，再用流水冲洗干净，凉干

五、注意事项：

1.血球计数板的计数室内刻度非常精细，清洗时切勿用试管刷或其它粗糙物品擦拭。

2.加样前，应先放好盖玻片，让菌液自然吸入。

如果先加菌液，则由于盖玻片较轻，可能会浮在菌液上，这样，计数室内的容积就不再使0.0001mL了。

因此，为了使结果更加准确，最好不要用普通的盖玻片来替代。

3.计数时，为避免重复或遗漏，对压在方格线上的细胞，应遵循数上不数下，数左不数右的原则（即凡压在上部或左面线上的细胞，都应计数入内，凡压在下部或右面线上的菌体，都应忽略不计）。

对出芽细胞，如果子细胞大于母细胞的一半，则应算作两个细胞。

六、思考题：

计数时，发现计数板不干净，怎样快速地清洗计数板？

实验三啤酒酵母的质量检查

一、实验目的：

学习酵母菌种的质量鉴定方法，

二、实验原理：

酵母的质量直接关系到啤酒的好坏。

酵母活力强，发酵就旺盛；若酵母被污染或发生变异，酿制的啤酒就会变味。

因此，不论在酵母扩大培养过程中，还是在发酵过程中，必须对酵母质量进行跟踪调查，以防产生不正常的发酵现象，必要时对酵母进行纯种分离，对分离到的单菌落进行发酵性能的检查。

三、实验器材与试剂：

显微镜，恒温水浴，温箱，高压蒸汽灭菌锅，带刻度的锥形离心管等

1.025%美兰（又称次甲基兰，Methyleneblue）水溶液：

0.025g美兰溶于100mL水中；

pH4.5的醋酸缓冲液：

0.51g硫酸钙，0.68g硫酸钠，0.405g冰醋酸溶于100mL水中；

醋酸钾（钠）培养基：

葡萄糖0.06%，蛋白胨0.25%，醋酸钾（钠）0.5%，琼脂2%，pH7.0。

四、实验步骤：

2.显微形态检查

载玻片上放一小滴蒸馏水，挑酵母培养物少许，盖上盖玻片，在高倍镜下观察。

优良健壮的酵母菌，应形态整齐均匀，表面平滑，细胞质透明均一。

年幼健壮的酵母细胞内部充满细胞质；老熟的细胞出现液泡，呈灰色，折光性较强；衰老的细胞中液泡多，颗粒性贮藏物多，折光性强。

2.死亡率检查

方法同上，可用水浸片法，也可用血球计数板法。

酵母细胞用0.025%美兰水溶液染色后，由于活细胞具有脱氢酶活力，可将兰色的美兰还原成无色的美白，因此染不上颜色，而死细胞则被染上兰色。

一般新培养酵母的死亡率应在1%以下，生产上使用的酵母死亡率在3%以下。

3.出芽率检查

指出芽的酵母细胞占总酵母细胞数的比例。

随机选择5个视野，观察出芽酵母细胞所占的比例，取平均值。

一般生长健壮的酵母在对数生长阶段出芽率可达60%以上。

4.凝集性试验