化学发光免疫法检测AFP的空白限检出限和定量检测限的建立与精文档格式.docx

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实验室在验证仪仪器说明书声明的灵敏度性能，

器声明的LoB时，应同时建立检测系统的LoD和LoQ，以便为临床提供更为可靠的检验结果。

两种评价方案均具有实用性，国内实验室可视具体情况选择不同的评价方案。

关键词：

甲胎蛋白；

方法学评价；

分析灵敏度中图分类号：

R446

文献标识码：

A

［1］

根据《医疗机构临床实验室管理办法》和医

时取不同浓度的低浓度样品各1支，待溶解混匀后与常规标本同等条件下进行测定。

1．5

常规方法

4-5］参照文献［确定AFP的LLD、

BLD和FS。

空白样品作10次批内重复测定，低浓度样品作日间重复测定，共10d，记录光强度值（RLUs）。

1．6

EP17-A方法

A文件［3］确定AFP参照EP17-LoD和LoQ。

空白样品进行60次测定，的LoB、每日1批，每批重复检测12次，共5d，记录浓度值。

6个浓度的低浓度样品作日间重复测定，每日2批，每批共5d，记录浓度值。

相隔时间＞2h，1．7

统计方法

LLD、BLD和FS的统计方法参照文献空白限（LoB）

按国际标准化组织（ISO）的

1．7．1［4-5］。

1．7．2

建议，设定Ⅰ类错误和Ⅱ类错误水平均为5%（α=β=5%），若空白值呈正态分布，按下式计算空白限：

LoB=μB+1．645σB（式中μB和σB分别为空白样品检测值的均值和标准差）。

若空白值呈非正态分布，则用非参数方法估计第95百分位数（PctB）的NB（ρ/100）+0．5］即：

LoB=PctB100-α，即：

LoB=在［值，

0．95ˑNB+0．5］位置的结果。

位置的结果=在［

注：

式中NB是重复检测的次数，ρ是百分位数。

1．7．3

检出限（LoD）

若低浓度样品检测结果呈

学实验室认可的要求

［2］

，临床实验室必须对检测系

统的主要分析性能进行验证确认或分析评价，证实其能够满足预期的质量要求后才能用于常规检测。

分析灵敏度是检测系统的主要性能指标之一，本文参考美国临床和实验室标准化协会（CLSI）发布的《检出限和定量检测限的确定方案》，建立化学发光免疫法检测AFP的空白限（LoB）、检出限（LoD）和定量检测限（LoQ），并与传统方法比较，现报道如下。

11．1

材料与方法检测系统

BayerCentaur240化学发光免疫

［4-5］

［3］

建立的检测低

限（LLD）、生物检测限（BLD）和功能灵敏度（FS）进行

分析仪及原装试剂、校准品（批号为CD54L、CD54H）和质控品（批号为9827301和9827302）。

1．21．3

空白样品低浓度样品

用Bayer原装配套AFP稀释液作用Bayer原装配套AFP稀释液

为空白样品。

对AFP浓度为5．50ng/ml的新鲜血清作系列稀释，配制成一系列低浓度的AFP样品，其理论浓度（ng/ml）分别为0（空白）、1．10、1．65、2．20、3．30、4．40、5．50，介于预期检测限浓度14倍。

1．4

样品保存

将配制好的系列低浓度样品分装

于带盖一次性试管内于－20ħ冰箱保存，每次测定

*

基金项目：

广东省医学科研基金项目（2009A2009763），中山市科技计划项目（20091A038）。

1976年生，作者简介：

温冬梅，女，副主任技师，学士，主要从事临床生物化学检验和实验室管理工作。

E-mail：

zxm0760@163．com。

通讯作者：

张秀明，主任技师，硕士研究生导师，

470·

正态分布，计算多个低浓度样品的综合标准差（SDs）：

SDs=

1SD1+n2SD2+n3SD3+……+nmSDmn1+n2+n3+……+nm

和第58个观察值的均数。

将60个空白检测值由小第57和第58位置均为0．8到大排序（见表2），ng/ml，故LoB=0．8ng/ml。

表2

秩号

5152535455

n2……nm代表不同低浓度样品的自由度。

式中n1，

LoD=LoB+CβSDS［Cβ是标准正态分布第95百分Cβ=1．645/（1－1/4f），f是SDs位数值的校正因子，。

的自由度］

若低浓度样品检测结果不呈正态分布，或不能按非参数方法估计LoD，计算公式转化为正态分布，

如下：

LoD=LoB+DS，β（DS，β是低浓度样品测定中位数和第5个百分位数值的间距）。

1．7．4

定量检测限（LoQ）

依据临床要求和室间

质量评价的允许误差，设定本实验室AFP的总误差在不考虑分析偏差的条件下，总误差目标为20%，

=2CV，如果低浓度样品的CV≤1/2总误差，则LoQ=LoD。

22．1

检测低限（LLD）

批次

12345678910

60个空白值中最高的10个值（ng/ml）

空白值0．50．60．60．60．8

秩号5657585960

空白值0．80．80．80．81．0

2．5检出限（LoD）低浓度样品测定结果见表3。

60个低浓度样品检测结果呈非正态分布，使用非参DS，数程序估计LoD，即：

LoD=LoB+DS，β，β是低浓度样品测定值中位数和低浓度样品的第5个百分位数值的间距，低浓度样品中位数=3．20，第5百分位数的值=（60ˑ0．05+0．5）=第3．5秩号的值=1．40，DS，故LoD=LoB+β=3．20－1．40=1．80，DS，β=0．80+1．80=2．60ng/ml。

表3

1．101．601．701．302．102．302．501．401．202．601．50

低浓度AFP样品测定结果（ng/ml）

1．651．802．101．602．801．801．902．901．402．201．90

2．202．703．002．502．803．202．902．501．802．503．30

3．303．503．904．103．904．403．903．203．203．703．70

4．904．205．104．804．604．904．604．304．305．204．90

5．506．205．505．505．705．905．805．205．905．905．50

空白样品10次重复测定光

A空白为1997．9，强度值（RLUs）的均值珔标准差（s）为

126，按99．7%的可信限，空白样品RLUs的3s为378，5．50ng/ml检测限样本的RLUs为2088，RLUs为378时相当于：

LLD=（378/2088）ˑ5．50=1．00ng/ml，所以本法的LLD为1．00ng/ml。

2．2

生物检测限（BLD）

2．20ng/ml实验样品的

RLUs减3s后RLUs为384，刚大于378，故本法的生物检测限为2．20ng/ml。

结果见表1。

表1

低浓度样品AFP（ng/ml）测定的RLUs结果及生物检测限

1．10

RLUs

ʃXA空白sCV（%）x－3s珋

58820534．9－27

1．6569917825．5165

2．2090917519．3384

3．30133214911．2885

4．4017431347．71342

5．5020881115．31754

2．6定量检测限（LoQ）本实验室依据临床需求

及权威机构规定的分析质量要求设定化学发光免疫法检测AFP的总误差目标为20%，在不考虑分析偏允许总误差（TEa）=2CV，即CV=1/差的情况下，

2TEa。

AFP浓度在3．30ng/ml时检测的日间CV为9．56%，刚好小于10%，符合质量目标要求，因此LoQ=3．30ng/ml，结果见表4。

表4

化学发光法测定低浓度AFP样品（ng/ml）的日间CV

x（ng/ml）珋

s（ng/ml）CV（%）

1．820．4926．78

1．652．040．4622．48

2．202．720．4115．05

3．303．750．369．56

4．904．670．306．50

5．505．710．274．79

2．3功能灵敏度（FS）以日间CV为20%时对应

2．20ng/ml浓度低浓度样品具有的平均浓度为FS，

的实验样品日间CV为19．3%，最接近20%，故FS为2．20ng/ml。

2．4

空白限（LoB）

空白样品的检测结果呈非正

态分布，故用非参数程序估计LoB，即估计第95百LoB=［NB（ρ/100）+0．5］=分位数（PctB）的值，

［60ˑ（95/100）+0．5］=57．5位置的结果，即第57

松柏

3讨论

Petersen、GregoriCasals、国内外相关报道中，郑

［4-8］

等分别对化学发光免疫检测系统检测不同

471·

BLD和FS进行确定或验证，项目的LLD、本实验以AFP为例对LLD、BLD和FS的研究结果与文献［4-5］报道的结果基本一致，证实了厂商声明的性能。

A方案建立的LoB本实验结果显示，用EP17-为0．8ng/ml，低于仪器说明书声明的灵敏度1．3ng/ml，LoD为2．60ng/ml，LoQ为3．30ng/ml。

即该检测系统在符合质量要求下能可靠地检出AFP的最低实际浓度为3．30ng/ml。

本实验室用该检测系统检测AFP结果报告时，若AFP结果低于0．8“分析物未检出，；

ng/ml，则报告浓度小于0．8ng/ml”若AFP检测结果高于0．8ng/ml小于2．60ng/ml，“有分析物检出，则报告但不能准确定量，浓度小于2．60ng/ml”；

若AFP检测结果高于3．30ng/ml，则直接报告检测结果。

临床医生可放心使用浓度高于3．30ng/ml的AFP结果。

两种灵敏度评价方法主要有以下区别

［9］

能符合临床的质量需求。

（5）目前所有的试剂厂商在试剂说明书中只提供了按常规方法检测得出的检测低限，没有提供必须满足实验室质量要求的定量检测限以及在接近定量检测限处的不确定度，厂商A文件对检测系统所有检验项目的检若参照EP17-实验数据的收集和测低限和定量检测限进行确定，

统计学处理科学严谨，可以方便临床实验室通过简单的程序对其建立的检测限值及不确定度进行验证和确认。

A文件建立LoD和LoQ是综上所述，用EP17-评价化学发光免疫检测系统灵敏度性能的标准方法，可更好地为临床提供准确可靠的AFP低浓度结果，为临床诊断、治疗监测提供重要信息，但成本较高。

常规方法操作简便、成本较低，若数据呈正态分布，也具有较高的应用价值。

国内实验室可视具体情况选择不同的评价方案。

4

参考文献

：

（1）

常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP的LLD、BLD和FS的空白样品检测数为10次，低浓度A方案要求确定LoD的样品检测数为10次。

EP17-最小检测数为60次，样品重复检测的次数多，估计的LoD不确定度较小，结果更可靠。

（2）参照常规方法确定化学发光免疫检测系统检测AFP的LLD、BLD、FS均使用光强度值（RLUs）来计算，但目前实验室部份仪器存在局限性，即只能报告分析物的浓度，而没有原始的分析信号。

所以常规方法不适用于实验室对所有仪器的灵敏度进行评价。

参照EP17-A文件进行化学发光免疫分析系统检测AFPLoD和LoQ，的LoB、直接使用检测出的分析物浓度进行计算，符合实验室的实际情况，统计分析输入检测数据时简便易行。

（3）常规方法对灵敏度性能评价均假设实验数据呈正态分布，使用参数的程序进行估计，但实际中大部份实验数据均呈非正态分布，EP17-A方案可以弥补常规方法的不足，可根据实验LoD。

数据分布选择参数或以非参数程序确定LoB、（4）常规方法确定生物检测限只是考虑了样品单次检测的信号有95%或99%的可能性，这样的低值结A方案考虑果有很大误差，影响了临床应用；

EP17-了分析物在低水平处的偏倚与不精密度，以检验的充分保证了低浓度检测结果允许误差来估计LoQ，

［1］．2006-02-07．中国卫生部．医疗机构临床实验室管理办法［Z］［2］ISO/DIS15189．2-2007．医学实验室———质量和能力的要求［S］．

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［9］杨有业，．北京：

人民卫生出版张秀明．临床检验方法学评价［M］

2008：

161-191．社，

（02-08，06-06）收稿日期：

2010-修回日期：

2010-

（本文编辑：

陈维忠）