水稻遗传转化体系ProtocolWord文档格式.docx
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三、继代
掐芽后7天左右，进行第一次继代，用镊子将新长出的愈伤夹成小块（17），
转入新的NB培养基中，每皿20粒，在27度恒温箱中暗培养15天后进行第二次继代，培养15天后，就可以长出颜色鲜黄，表面光滑，直径大小为2-3mm的胚性愈伤组织颗粒。
大小合适的愈伤可以进行预培养，小的就进行第三次继代。
四、农杆菌介导的水稻遗传转化
共培养（整个操作过程需8天）
第一天：
选取自然分散，颜色鲜黄，直径约为2-3mm的颗粒愈伤，置于27度暗培养4天。
第三天：
农杆菌划线28°
培养，两天后农杆菌长满即可洗脱（18），用于转化。
第五天：
悬浮农杆菌，悬浮于添加有100uM乙酰丁香酮（AS）（19）20ML的AMM液体培养基（20）中，剧烈震荡1min后，静置1h，让农杆菌形成悬浮液，取菌液于三角瓶中加入经预培养的愈伤，略微摇动静置30min，于无菌纸上晾干愈伤后置于添加有100uM的乙酰丁香酮的NB培养基（AS培养基（21）上27度暗培养3天。
第八天：
等农杆菌生长至可见的愈伤下的菌斑，但未长满愈伤时，挑取愈伤于无菌培养瓶中，用无菌水冲洗，直至无可见菌丝为止，最后用含300mg/l的羧苄无菌水静置1h，置于无均滤纸上晾干后，转移至筛选培养基上。
五、抗性愈伤的继代筛选
当抗性愈伤在朝霉素30培养基（22）上生长15天后（23），将愈伤换到新的朝霉素30培养基上，15天后可观察到一些褐化愈伤开始长出的新的愈伤，继续培养，等新愈伤长出很多时转移至朝霉素50培养基（24）上，筛选3-7天。
六、分化
从朝霉素50培养基中将继续增生分裂的抗性愈伤转入分化培养基（25）上再生，成团而不是分散放置（26），一周后愈伤开始转绿，三周后开始长出幼芽，随后根也长出，当芽长至2-3cm时，就可移至1/2MS培养基（生根培养基）上（27）。
分化间进行，25°
（28），光14小时，暗10小时。
七、生根
超净工作台内进行，每个培养瓶中只放一个抗性愈伤诱导出来的苗（29），在生根培养基上生长10天。
（30）分化间进行，25°
，光14小时，暗10小时。
八、炼苗
生根十天后开盖，加已晾两天或晒过的水，泡过培养基即可（28），2天后
28）用水洗掉生根培养基，加晾两天或晒过的水浸过根，3-7天后待生长状态好了后移栽大田。
（期间每天要加水，确保根都泡在水中）。
分化间进行，25°
，光14小时，暗10小时。
九、移栽大田
土、水提前晒上两天，移栽盆装4/5体积的土，用水浸透即可，不能太多水，刚好浸过土面最好。
移栽：
在盆上标记好，盆宽移栽两株，长四株；
移栽时不能插深，植株能站住即可。
10天后可以施一点肥，不能太多。
20天后可以每10天施肥一次，同样不能太多，太多会烧苗（如烧苗，施肥3天后可以观察到，应马上将水换掉）。
要保证白天29°
（30），晚上23°
；
光14小时，暗10小时。
（31）
Notes
（1）不用一粒一粒用手拨皮，在桌上垫一些白纸，用书压。
力道要掌握好，太用力把种子压碎了，用力不够只能去个别的种皮，效率低。
注意：
接触种子的纸必须是全白色的，不能有印刷有子的，否则用力压时，墨就着黑色上种子。
（2）不正常的种子，一律丢弃。
因为后期若是一粒种子长菌的话就污染了整盘。
（3）a.20ml2%的NaClO的配制：
实验室买的是有效浓9%的NaCIO,所以取4.5ml9%的NaCIO力卩16ml蒸馏水即配成2%的NaClO
b.2%的NaClO现用现配，因为NaClO见光分解，所以配了就要赶紧用。
（4）20粒共三圈，外圈12粒，中圈7粒，里一粒。
（5）NB培养基的配置（800ml）：
实验准备：
所有玻璃仪器必须洗净再用双蒸水润洗步骤：
取一升二角瓶f加24g蔗糖
依次加入80mlN6max（10X）⑹
16ml铁盐（50X）⑺
8ml肌醇（100X）（8）
4mlB5miin（200X）（9）
加多点（勿超500）三蒸水摇使其溶解，倒入1升量筒中，再加三蒸水定容至
780ml
J此时PH应为4.2-4.3
PH调至5.8（用pH计，KOH调）
加2.1g植物凝胶（10）
高压灭菌（121°
20min）
J灭完前30min，拿出16ml有机，化为液态
加1.6ml2.4-D（1mg/ml）（11）至16ml有机（12）中
待培养基稍烫手抽滤（13），倒培养基（14）
⑹N6max（10X）的配制（配1L）：
①KNO328.3g
4.0g
4.63g
1.85g
1.66g或Cacl21.25g
②KH2PO4
@（NH4）2SO4
4MgSO47H2O
5Cacl22H2O
注：
a•①②③④一起溶解混匀成A,
b•⑤单独溶解，再与A交替混匀，以免长期存放产生沉淀;
c.4C冰箱保存；
（7）铁盐（50X）的配制（配500mL）:
1FeSO47H2O0.695gg
2NA2EDTA2H2O0.9325g
a.①②分别溶解，再交替混匀，边加边摇匀；
b•棕色瓶装；
（8）肌醇（100X）的配制（配1L）:
10g肌醇（InositoI）用双蒸水定容至1L；
4C冰箱保存;
（9）B5miin（200X）的配制（
配500mL）：
①MnSO4.H2O
0.758g
②H3BO3
0.3g
③ZnS047H2O
0.2g
④CuSO45H2O
0.0025g
⑤CoCI26H2O
⑥KI
0.075g
⑦NaMoO42H2O
0.025g
a.一起溶解，二蒸水疋容至
500mL；
c.4C冰箱保存；
（10）非琼脂粉。
（11）2,4-D（1mg/mI）配1100mI）：
加1ml无水乙醇用枪吸吹，可溶解。
再用纯水定容至100ml；
4C冰箱保存；
（12）有机（50X）的配制（配1L）:
①盐酸硫胺素（VB1）
0.5g
②盐酸吡哆醇（VB6）
0.05g
③尼克酸（烟酸）
④水解酪蛋白
15g
⑤谷氨酰胺
12.5g
⑥脯氨酸
25g
⑦甘氨酸
0.1g
a.以上药品均要求Sigma的，一起溶解，三蒸水定容至1L；
b•再分装，每个16mL；
c.用滤纸、漏斗过滤分装；
d.-20°
冰箱保存；
e.用时提前拿出来；
（13）抽滤：
在超净台中把有机倒入一培养皿中，抽滤（先要试下过滤膜有没有装好：
注射器抽一些有机并抽入些空气，打出有机，若弹起，才可以进行抽滤。
所以通常过滤的应多准备几个；
若使用一次性过滤器则直接抽滤即可；
过滤膜为0.2um）,摇荡三角瓶（混匀），酒精灯烧瓶口再倒培养基。
（14）倒培养基：
a.六皿培养皿一摞，从下至上倒培养基
b．每皿倒一半稍多厚（水稻组培要厚点）,800ml倒22皿左右
C.快停时右手使三角瓶前倾点（可防倒到皿壁上）
d•移动培养皿摞时小心，慢点。
倒培养基后处理：
a.—升三角瓶、有机瓶子：
即刻冲洗。
b.过滤器：
过滤膜扔掉，冲洗过滤器（特别是过滤孔），打开晾干；
若是一次
性过滤器则不必；
c.注射器：
抽开晾干。
每次要用培养基提前2天倒好（保证无菌）；
（15）要做到每天观察，一但发现有污染的要及时处理：
长真菌的话整盘丢弃，但长细菌的可以将未污染的转移到新的培养基上。
16）左手镊子轻夹愈伤，右手镊子掐芽，为掐而非拔。
17）发黑的愈伤不要，黏糊的不要，要的是偏硬的愈伤。
18）经验：
一般晚上划线，第三天上午做侵染。
（例：
1.1晚上划线，1.3号上午做侵染，所以1号、2号用来做实验准备，高压滤纸培养皿，100ml三角瓶、枪头等。
）
（19）AS的配制：
9.81mgAS用ImIDMSO溶解即可；
一般称98.1mg,用lOmIDMSO溶解,用1.5ml离心管分装，每管装1ml；
-20°
保存；
（20）AMM液体培养基的配制
（21）AS培养基（共培养培养基）的配制（8OOmI）：
（22）筛选培养基I（Hyg30）的配制（800ml）：
780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+480ul
50mg/mlHyg
a．100mg/mlCb母液配制：
1gCB用10ml双蒸水溶解（应为略黄色、澄清、
有刺激性味液体），4C保存
b．50mg/mlHyg：
默克牌的买来就应该是这个浓度，即1g/20ml
c.Hyg30:
是指潮霉素浓度为30mg/ml（即：
480ulX1g/20mg-800ul）。
d.有机、2,4-D、Cb、Hyg混匀，抽滤。
（23）可以看到愈伤一天一天开始慢慢褐化，就像死了一样；
（24）筛选培养基II（Hyg50）的配制（800ml）：
780mlNB+16ml有机+1.6ml2mgL-12,4-D+2ml100mg/mlCb+900ul
方法同上（略）
（25）分化培养基的配制（800ml）：
780mlNB+16ml有机+320ul（1mg/ml）NAA+8mgKT;
pH5.8-5.9。
说明：
a.1mg/mlNAA母液的配制：
配50ml
称50mgNAA加1MKOH直至溶解（一般加1ml就可以溶解），再加
双蒸水定容至50ml。
不用高压，4°
C保存。
b.分开抽滤：
16ml有机和320ul（1mg/ml）NAA混匀一起抽滤;
8mgKT用1ml1MKOH溶解,再加9ml双蒸水，混匀，抽滤；
（因为KT和有机、NAA会形成结晶，所以要分开抽滤）。
注：
8mgKT务必要称精确，用新的电子天平，勿用一楼的电子天平。
或者称24mgKT，加3ml1MKOH溶解,再加27ml双蒸水混匀，抽滤10ml即可。
c．800ml倒18个100ml三角瓶（每瓶约45ml）。
（26）经验发现团放比分散放置出苗率高。
（27）生根培养基：
1/2MS培养基；
pH5.8-5.9。
（28）25°
要恒温，不能一会28°
一会25°
，那样分化瓶壁上会出现很多水，影响苗的生长。
（29）生根培养基的配制
（30）操作很重要，严格执行，一大意就很容易污染。
操作时务必用长镊子，不能用手弄，用涂过酒精的手弄后期绝大部分会长真菌。
（31）这10天要常观察，一发现有污染的情况，即刻转移；
一般2天后就可发现根往瓶底部长，4天后发现苗明显转绿，茎变粗壮；
7天后发现有明显侧须根长出；
根很多；
（32）一定要浸过培养基，没的话容易长菌；
（33）若长菌则换水。
（34）水稻高温下长势很好（大于28°
（35）注意防虫，必要时15-30天打一次农药。
被带毒的虫子吃了的话，一但传上毒，实验就前功尽弃！
所以，在防虫方面，务必认真对待。
附录•转基因培养基的配方
1.NB培养基配方（基本培养基）
N6大量
工作浓度（mg/l）—
—母液：
10x,1L（g）—
KNO3
2830
28.3
（NH4）2SO4
463
4.63
KH2PO4
400
4
MgSO47H2O
185
1.85
CaCb2H2O
166
B5微量工作浓度（mg/l）母液：
100x,1L（g）
H3B0430.3
MnSO4H2O7.580.758
ZnSO47H2O20.2
KI0.750.075
Na2MoO42H2O0.250.025
CuSO45H2O0.0250.025
C0CI26H2O00250.0025
铁盐
工作浓度（mg/l）
母液：
100x
1L
（g）
jy<
ittIa
FeSO47H2O
N/EDTA
27.8
373
2.78
373
肌醇
丿J丿U|-|J
肌醇Myo-inositol
100
10
11—
iy丿
）4jui—ijiviyoiiiodiloi
有机成分
1\J\J
工作浓度（mg/l）
1
母液:
：
50X,
4L-
—
盐酸硫盐酸吡尼克酸Niacin水解酪蛋白
2.
AAM培养基配方
3.
MS培养基配方
100x1L（g）
TAFTTL
FeSO4.7H2O
Na2EDTA
1\入・1w丿、，II—vy/
3.73
278
有机成分
―母液：
50X,1L（g）——
CuSO4.5H20
0.0025
5
甘氨酸
0.1
盐酸吡哆醇（VB6）
尼克酸
0.5
05
0.025
0025
蔗糖
20000
琼脂
9-95
PH
58
羧卞青霉素（cb）
250mg/l
100mg/ml
潮霉素（hyg）
30-50mg/l
50mg/ml
利福平（rif）
50mg/l
20mg/ml
卡钠霉素（kana）
四环素（tet）
4mg/l
10mg/ml
氨卞青霉素
NAA奈乙酸
400ug/l
1mg/ml
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