作业浅谈植物DNA提取方法的研究进展文档格式.docx

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DNA；

提取方法；

进展；

1引言

植物DNA的制备是分子生物学对各类植物进行深入一步研究的基础，所制备的DNA质量的好坏直接关系到后期分子生物学研究实验的成败。

因此对所提取出的植物DNA在纯度浓度等方面提出了较高的要求。

然而，由于植物组织细胞中含有大量复杂的次生物质，如提取液中常含有如多糖类（植物自身的多糖类极易黏合成粘稠状的叫状物质，而为DNA的分离加大了难度）、多酚类（多酚极容易氧化，与DNA双链产生不可逆的结合而影响到DNA的溶解）、RNA、蛋白质、单宁和色素等物质，容易对DNA进行污染，直接影响到所制备的DNA纯度，使得DNA的提取达不到预期的提取效果。

如果不及时清楚去，很可能还会对后期实验的继续进行存在着重大的影响。

因此，要想从植物中分离提取出高质量的DNA还是存在着比较大的困难。

目前研究发现的DNA提取方法有很多，其中被应用最为广泛的DNA提取方法有传统的十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法和SDS法。

但是由于不同植物的材料组分各异，而植物其自身所含的多糖、蛋白质、酚类物质也各有不同，相同的物质浓度也会出现偏差，就使这些模式植物的DNA提取方法对不同植物DNA的提取并没有达到预期效果。

相同的提取方法并不适合所有的植物，不同的植物最适合的提取方法也不同。

许多的学者一直都在不断地探索着不同的DNA提取方法，研究新的方法，并针对不同的植物，在传统的提取方法上进行着一些新的改良。

2十六烷基三乙基溴化铵（CTAB）法

在众多的DNA提取方法中，CTAB法是目前应用最为广泛的一种方法。

它既可以裂解细胞，又可以有效地去除多酚类和多糖类物质的沉淀，因而最为经常被学者使用于植物DNA的提取工作中。

2.1原理及方法

CTAB（十六烷基三乙基溴化铵）是一种阳离子去污剂,可溶解细胞膜。

同时它能与核酸形成复合物,这些复合物在高盐溶液中（0.7mol/LNaCl）是可解离的,从而使DNA和多糖分开。

当降低溶液盐浓度到一定程度（0.3mol/LNaCl）时,这些复合物将会从溶液中形成沉淀。

再通过离心就可将CTAB-核酸的复合物与蛋白类、多糖类物质分开。

而对富含多酚、多糖植物组织则通过增加提取缓冲液中β-巯基乙醇用量,便能够有效地控制酚类物质的氧化褐变及DNA的降解。

在除蛋白质的步骤中,只需适当的增加氯仿/异戊醇的量和使用次数,便能够很好的使得蛋白质的去除更加完全,从而提高产物的纯度。

最后再用乙醇沉淀DNA，以除去CTAB。

2.2适用范围及一些改良

CTAB法由于能有效地去除多糖及酚类物质的沉淀，因而适用于含酚类及糖类物质较高植物材料的总DNA提取。

於朝广,殷云龙

在对落羽杉属树木基因组总DNA的提取中发现，CTAB是提取效果最好的方法，而且试验中所有材料的DNA都是一次性的提取成功，并且获得的量较大。

胡薇,陈宇,林来水等人

在黑木相思基因组DNA的快速提取中发现，黑木相思基因组DNA用CTAB法效果最好，速度快，纯度和得率都很高。

李树华,何军,杨淑琴等人

在对野生稻、野燕麦、枸杞DNA的提取方法研究中也发现CTAB法比较适合野生稻和野燕麦的DNA提取。

梁雪莲,郑奕雄,陈晓玲等人

在对花生DNA提取方法比较中发现，CTAB法操作较简单,所得产物杂质较少,降解程度轻,并可提取到高质量的DNA,对于花生DNA的提取为最有效果的。

尽管传统的CTAB提取法对于植物DNA的提取比较常用，但是由于它本身过程相对复杂，对于不同植物的DNA提取效果会有所偏差，因而众多学者在原有的基础上针对不同的植物特点，对一些提取步骤进行了改进，从而获得高质量理想的DNA。

便于以后分子生物学的深入研究。

李先进,彭正松,张正英等

在对四种药用蕨类DNA提取的比较研究中发现，用CTAB法获得的效果最好,获得的DNA纯度较高、产量较大。

但是因为酚类物质极为易被氧化,所以可以在最开始研磨材料的时侯加入4%PVP,从而防止在研磨中细胞组织破裂后酚的氧化，从而获得更理想的DNA。

在植物总DNA的提取方法的改进研究中，黄永莲,刘媛,黄真池等人

在传统CTAB法的基础上作了一些新的改进，用改良的CTAB法提取菠菜和榕树叶片DNA，能获得了良好的效果。

首先将材料在4℃的冰箱中静静放置1~2d,以便于其叶片中的多糖类物质的降解；

然后在用CTAB处理的同时加入蛋白酶K,因为蛋白酶K能分解部分与DNA结合的蛋白质，提高提取缓冲液中β-巯基乙醇用量,增加氯仿/异戊醇的量和使用次数,以及缩短异丙醇沉淀DNA的时间，从而提高了提取的效果。

袁燕,王德斌，郭丽红等

用改良CTAB法对蒜头果基因组进行DNA提纯的研究中发现，EDTA的浓度在20~30mmol/L时,提取DNA的效果较好,而加入含PVP的缓冲液后,多糖、多酚类物质去除效果好,可以大大地提高DNA的纯度。

同时在提取过程中在研钵中加入少量PVP和VitC固体与蒜头果种仁共同研磨,并对样品先进行预处理的方法,不仅能阻止多糖、多酚氧化物等与DNA的结合和反应,还能除去大部分油脂和杂质,可以大大提高蒜头果基因组DNA的纯度。

陈颖等

比较了纤维素酶法、改进的CTAB法和超声波裂解法提取的DNA的质量和产量后，发现他们改进的CTAB法是一种简单、快速和高效的适合于小球藻的DNA提取方法。

唐玉海,郭春芳,张木清等人

用改良的CTAB法也很好的提取出茶树基因组的DNA。

3十二烷基磺酸钠SDS法

SDS法与CTAB法一样，为常用的DNA提取方法，但它由于过程复杂，耗时大等种种原因，很多时候使得对于植物DNA的提取在效果和纯度上不如CTAB，同时容易造成DNA的损伤。

但是在DNA的提取过程中，有机溶剂的抽提效果及裂解液的裂解效果都是影响有机物质的去除的先决条件。

不同的有机溶剂和裂解液对于不同种类的植物DNA提取作用也有所差异。

有很多植物适合SDS法进行DNA的提取。

3.1原理及方法

SDS（十二烷基磺酸钠，sodiumdodecylsulfonate）是一种阴离子去污剂，它能够裂解细胞。

在此方法的试验中，用氯仿等有机溶剂去抽提蛋白质和糖类，并且用乙醇或异丙醇来沉淀DNA。

和CTAB法一样，植物DNA提取一般须经历破碎细胞壁、裂解细胞膜、除去多糖和多酚等次生物质、变性分离蛋白质、沉淀核酸、去除RNA和浓缩DNA等几个步骤。

3.2适用范围及一些改良

在对老芒麦的基因组DNA分离的研究试验中,李景环,云锦凤,邰丽华等[10]发现,SDS法是一种快速、简便、有效的基因组DNA小量提取法,它完全能够满足一些DNA样品需求量较小的实验要求。

另外，在一些研究中还发现，SDS法能替代操作过程较烦琐的大量法提取基因组DNA,从而给研究工作带来便利。

毛白杨成熟叶片基因组DNA提取的研究中李继东，梁启伟，吴文娟等人[11]通过比较发现，SDS法是提取出质量高纯度高的DNA的最佳方法，同时发现，如果将PVP添加到裂解液中，可以大大减少了实验的操作步骤，但得到的提取效果却同样很高。

另外研究发现[12]SDS（十二烷基硫酸钠）高盐介质法又较常规SDS法省去了添加液氮研磨和水浴加热抽提等操作,可使得实验的操作变得简便快速。

4高盐低PH法

高盐低PH法为比较普遍的植物DNA提取方法之一，他所用的试剂仅有无机盐和异丙醇。

因为低PH下的醋酸钾能够很好的使蛋白质发生沉淀，因而成为很有效果的沉淀剂，所以醋酸钾是常用的无机盐试剂。

因为高盐低PH法没有反复抽提的过程，所用所用的实验材料较少，比较适合用于濒临灭绝的濒危物种植物的DNA提取。

郝朝运,刘鹏,郭卫东,徐根娣[13]在对忍冬科部分植物DNA提取方法的研究中发现，用高盐低PH法能有效地防止组织破碎及沉淀时的电离化作用和酚类化合物的进一步氧化,避免了采用酚、氯仿等有毒试剂。

同时低pH的醋酸钾溶液是有效的蛋白质沉淀剂,比氯仿-异戊醇分层反复抽提去除蛋白质操作更方便,省时省力.在高盐提取缓冲液中加入一定量的β-巯基乙醇可有效去除木本植物中含量较多的酚类物质,提高提取DNA的质量。

所以该方法以一年生或两年生枝条为材料提取的植物总DNA不但纯度高、产量大,而且所用试剂无毒、操作简便,最重要的是所用植物材料（枝条）不受季节限制,容易获得和保存,具有较高的实际操作意义。

5植物DNA的其他提取法

尽管前人通过实验研究出各种DNA提取方法，但这些方法在实际操作过程中均有许多不便之处,费时、耗资大、操作程序复杂或操作处理要求的温度苛刻或存在大量杂质是它们的共同特点之一。

通过了大量工作者不断地努力摸索、尝试、研究和改进，又出现了很多能够很好的提取出所需要的植物DNA的新方法。

5.1其它提取植物DNA的方法

5.1.1一种快速简单高效提取植物DNA的方法

汤文开,谭新,张辉[14]以多种植物的子叶、叶片以及愈伤组织为材料研究出的快速简单高效提取法，采用此方法进行抽提纯化,得到的DNA质量好、得率高,且提取过程简单,适合于大批量快速提取植物DNA。

同时，在此方法中所用到的试剂常见且便宜,对仪器设备的要求也不高。

5.1.2改良尿素法

曹文波,郑璐璐,谢文海[15]研究出改良尿素法，并从玉米和水稻叶片中提取高质量基因组DNA。

此种方法的产率高、快速且省时、可在常温下进行操作且成本耗用低。

因为采用这种在原尿素法基础上在裂解液中添加β-ME、用预冷的无水乙醇取代异丙醇沉淀核酸、采用水平离心和快速倒出用于洗涤的乙醇等操作，所以用改良的方法能获得的纯度高、浓度大基因组DNA。

5.1.3一种优化的植物总DNA提取方法

黄萱,高丽美,张永彦[16]改进了Clark利用CTAB提取植物基因组DNA的方法，在试验过程中发现,通过在研磨材料时加入液氮、用剪去端部的吸头转移含有DNA的溶液,并且将加入RNaseA消化RNA的步骤改在最后进行等一系列改进,以获得高质量的DNA。

5.1.4一种改良的棉花总DNA提取方法

郭红媛,佘茂云[17]对CTAB法与SDS法进行了总结，研究出了一种适于棉花总DNA的提取方法，此方法提取的DNA纯度较高，实验具有可重复性，结果比较的稳定。

同时此方法得到的DNA满足分子生物学的进一步研究的需要，效果显著。

5.2主要提取方法的比较

表1-1几种常用植物DNA提取方法的比较

CTAB法

SDS法

高盐低PH法

DNA提取

以CTAB为去污剂，并加提取缓冲液中β-巯基来控制酚类物质的氧化褐变及DNA的降解。

增加氯仿/异戊醇除蛋白质，最后用乙醇沉淀DNA，以除去CTAB。

使用SDS作为去污剂，并且用氯仿等有机溶剂去抽提蛋白质和糖类，最后用乙醇或异丙醇来沉淀DNA。

以无机盐和异丙醇为所用试剂。

在高盐提取缓冲液中加入一定量的β-巯基乙醇可有效去除木本植物中含量较多的酚类物质,提高提取DNA的质量。

适用范围

适用范围广，适合绝大多数植物DNA的提取。

尤其适用于含酚类及糖类物质较高植物材料。

是目前最为常用的提取方法

适用的范围较为广泛，适合小量植物DNA的提取，为较为常用的植物DNA提取方法。

适合用于濒临灭绝的濒危物种植物的DNA提取，同时研究发现该方法尤其适合一年生或两年生枝条为材料的植物总DNA提取。

方法评价

提取出的DNA含杂质较低，纯度高，含量大。

但是实验步骤较为繁琐，费时，实验试剂较为昂贵，且多为有毒的有机试剂，对操作人员健康有危害影响。

与传统的方法相比快速、简便、有效等优点，提取的量较少。

但无法充分地除去多糖物质，且提取过程中对DNA的损伤较大。

所需材料较少，试剂无毒、操作简便，省时省力，但适用的范围较为狭窄，普遍程度不高。

结语

关于植物DNA的提取方法虽然前人已经做了大量的研究[18]，也总结出很多如CTAB法、SDS法、PVP40法、氯仿-异戊醇法以及β-巯基乙醇法等方法，但基于现在分子生物学的不断深入研究，DNA作为分子生物学研究的基础，所以对各种植物DNA的提取又提出了很多新的要求。

同时依据不同植物的特点，最适合不同植物的DNA提取方法也还在不断地探究中。

随着生物科学技术的不断发展，信息知识的不断更新，对于植物DNA的提取方法仍有待于进一步研究。