实验常用培养基及基本特性Word格式.docx
《实验常用培养基及基本特性Word格式.docx》由会员分享,可在线阅读,更多相关《实验常用培养基及基本特性Word格式.docx(5页珍藏版)》请在冰豆网上搜索。
F12培养基成分复杂,含有多种微量元素,和DMEM以1:
1结合,称为DMEM/F12培养基(DME/F12medium),作为开发无血清配方的基础,以利用F12含有较丰富的成分和DMEM含有较高浓度的营养成分为优点。
该培养基适用于血清含量较低条件下哺乳动物细胞培养。
为了增强该培养基的缓冲能力,改良之一是在DMEM/F12(1:
1)中加入15mMHEPES缓冲液。
6、McCoy’s5A
McCoy’s5AMedium主要为肉瘤细胞的培养所设计,可支持多种(如骨髓、皮肤、肺和脾脏等)的原代移植物的生长,除适于一般的原代细胞培养外,主要用于作组织活检培养、一些淋巴细胞培养以及一些难培养细胞的生长支持。
例如Jensen大鼠肉瘤成纤维细胞、人淋巴细胞、HT-29、BHL-100等上皮细胞。
7、Iscove’sModifiedDulbeccoMedium(IMDM)
Guilber和Iscove将Dulbecco’Medium改良为Iscove’sMedium,用于培养红细胞和巨噬细胞前体。
此种培养液含有硒、额外的氨基酸和维生素、丙酮酸钠和HEPES。
并用硝酸钾取代了硝酸铁。
IMDM还能够促进小鼠B淋巴细胞,LPS刺激的B细胞,骨髓造血细胞,T细胞和淋巴瘤细胞的生长。
IMDM为营养非常丰富的培养液,因此可以用于高密度细胞的快速增殖培养。
8、M-199Medium
1950年,Morgan成功研制出具有确定化学成分的细胞培养液,即M-199,主要用于鸡胚成纤维细胞培养。
此培养液必须辅以血清才能支持长期培养。
M-199可用于培养多种种属来源的细胞,并能培养转染的细胞。
9、LeibovitzMedium(L-15)
L-15培养液适用于快速增殖瘤细胞的培养,用于在CO2缺乏的情况下培养肿瘤细胞株。
此培养液采用磷酸盐缓冲体系,氨基酸组成进一步改良,并由半乳糖替代了葡萄糖。
10、Ham’sF-10培养基:
适应小鼠细胞、人类二倍体的培养。
11、Ham’sF-12培养基:
可以在加入很少血清的情况下应用,特别适合单细胞培养和克隆化培养,是无血清培养中常用的基础培养液。
12、William’sMediumE:
用于大鼠肝上皮细胞的长期细胞培养。
13、MCDB131培养液:
用于培养内皮细胞。
14、Opti-MEMIReducedSerumMedia:
用于培养造血细胞。
15、植物血凝素(PHA):
增加细胞转化和DNA合成。
如何正确选择细胞培养基
细胞培养是实验室里最常见和最基本的实验了,但却不是最简单的。
别小看细胞培养,这里可蕴含着大学问。
有时候细胞状态不好,转染、药筛这些实验根本就没办法做。
影响细胞培养的因素很多,让我们先从培养基和血清说起。
经典的培养基有很多种,Invitrogen(GIBCO)、thermofisher(HyClone)、Sigma等公司都可以提供。
其中DMEM、RPMI1640、MEM、DMEM/F12都是应用最广泛的培养基。
其他如M199、IMDM、L15培养基等也用于某些细胞的培养。
◆MEM是由Eagle’s基础培养基(BME)发展而来的,其中增加了组分的范围及浓度。
◆Dulbecco改良的BEM(DMEM)培养基是为小鼠成纤维细胞设计的,现在常用于贴壁细胞的培养。
DMEM的氨基酸浓度是MEM的两倍,维生素浓度是MEM的4倍,采用双倍的HCO3-和CO2浓度起到更好的缓冲作用。
最初的配方中葡萄糖含量为1000mg/L,后来为了某些细胞的生长需要,将葡萄糖含量又调整为4500mg/L,这就是大家常说的低糖和高糖了。
◆aMEM含有附加的氨基酸、维生素以及核苷和脂肪酸,它可广泛应用于各种细胞类型,包括对营养成分要求苛刻的细胞。
◆Ham’sF12是为在低血清浓度下克隆CHO细胞而设计的,现在也广泛应用于克隆形成率的分析及原代培养。
F12还可以与DMEM等体积混合使用,得到一种高浓度与成分多样化相结合的产物,这种培养基已应用于许多原代培养及更难养的细胞系的培养。
◆RPMI1640培养基是专为淋巴细胞培养而设计的,现在已广泛应用于悬浮细胞的培养。
以前经常听到有人问,这种细胞该用哪一种培养基呢?
其实这个问题的答案可以很简单,也可以好复杂。
此话怎讲?
如果这种细胞是购自ATCC或其他的细胞库,那很简单,问供应商就行了。
或者找到相关的文献,作为参考。
Invitrogen网站上有一个CellLineDatabase的工具,也很好用。
选择你感兴趣的细胞类型,它就会弹出推荐的培养基、血清和转染试剂等,有时还有优化好的转染步骤,很方便。
Sigma网站上也有一个MediaExpert,包括了培养基所有成分的功能描述、使用推介和参考文献等,它还是一个解决问题能手,对于细胞培养中的常见问题,如细胞贴壁不好、培养基变色等,它都会列出可能的原因,并提供补救办法。
这个Expert果然不简单!
但如果你是着手建立一种全新细胞的培养体系,根本找不到任何参考,那你就得花点时间自己试验了。
万事开头难嘛。
因为没有一个标准答案。
在MEM中培养的细胞,很可能在DMEM或M199中同样很容易生长。
总之,首选MEM做贴壁细胞培养、RPMI1640做悬浮细胞培养会是一个好的开始。
你也可以购买几种培养基来,然后花大约两周的时间做一个简单的细胞生长实验,来选择其中最适合的。
有时候你会惊讶地发现你的最佳培养条件与文献报道的不同,就算是同一种培养条件,细胞的生长状态也时好时坏,这是很正常的。
因为试剂、水、不同批号的血清之间都存在着差异。
要提高培养基的稳定性,可以从培养基和血清两方面入手。
以前大部分实验室都是用干粉培养基,但配制过程就较为繁琐,要溶解、调pH值,过滤,过程中可能会产生一些浓度误差,而且有些实验室的水质并不理想,所以培养的效果会有差异。
如果使用液体培养基,这种人为的误差会减少,因为毕竟是大批量工业化生产的,批间差会很小。
大家是不是感觉液体培养基会贵很多,以前是这样,但现在非也。
HyClone和Invitrogen都在国内建立了液体培养基的生产基地,生产和运输成本大幅降低,所以现在的价格也只是50-60元/500ml,比干粉培养基贵不了多少,而且还帮你省了过滤器和时间。
血清含有生长因子可促进细胞的繁殖,含有附着因子可促进细胞的贴壁,同时还具有抗胰酶活性。
血清同时也是矿物质、脂类及激素的来源。
最常用的血清有小牛血清、新生牛血清、胎牛血清和马血清等。
牛血清是按照采血时间的早晚来分类的。
采血时间越早,营养物质越丰富,所含抗体也越少,因而胎牛血清适合要求高的细胞系和克隆化培养。
由于疯牛病的原因,到目前为止,我国政府仍然禁止从北美洲、欧洲和日本等地区进口牛血清,因此市面上的牛血清大多来自澳洲、南美洲,或是国产的。
而血清批次间的差别就是不可避免的,这种差异来源于不同的制备方法和除菌方法、动物的年龄差别及血清的储存条件等,而且与取血动物的来源关系密切。
不同的牧场、不同的气候天气及其他环境因素都可能影响血清的质量。
因此选好了一种血清就要尽可能长期使用它。
在需要更换时,也要尽量保持与原有的一批血清相似。
现在很多公司都提供血清预留,你一旦选定了某个批次的血清,最好备足一年的量,这样可以避免很多麻烦。
血清固然是细胞培养中不可或缺的成分,但正如上文所说,血清的批间差异大,更换血清时需要做大量的测试以取保替换的血清与原来的相似。
而血清的供应也是必须要考虑的因素。
由于气候或疯牛病的影响,说不定哪天血清就突然没得卖了,那对实验的影响可非同小可。
另外,血清的价格也很昂贵,虽说现在也有便宜的国产血清,但是高品质的澳洲血清价格仍旧高企。
因此,也有一些实验室开始换用无血清培养基。
无血清培养基(Serum-FreeMedia),通常以SFM表示,顾名思义,就是在细胞培养中不需要添加血清,但是在某些应用中可能要添加生长因子或细胞因子。
无血清培养基中添加了血清的主要成分:
粘附因子、生长因子、必需的营养物质和激素等,能减少上述血清带来的不利因素,使细胞培养的条件更稳定。
但它也不是完美的,从有血清培养过渡到无血清培养的条件并不像想象中那么直截了当。
处于发育的不同分化阶段的细胞(例如干细胞与定向前体细胞相比)需要不同的配方,对生长因子和细胞因子的选择尤为重要。
而且在去除血清的同时,也去除了一些血清蛋白具有的保护、解毒作用,因此对试剂、水的纯度和仪器清洁度的要求更高。
另外,它的价格也比普通的培养基贵很多。
现在有很多厂家生产无血清培养基。
GIBCO这个细胞培养的金字招牌当然少不了,它也是最早研制无血清培养基的。
目前已经开发了ES细胞、杂交瘤、CHO、293、昆虫细胞、神经细胞、淋巴细胞、角质细胞、内皮细胞等多种细胞的无血清培养基。
上个月还推出了首个间充质干细胞的无血清培养基,能使MSC维持未分化状态超过9代。
HyClone公司也有CHO、293、杂交瘤细胞、昆虫细胞、病毒疫苗细胞的多种无血清培养基。
Sigma则刚刚收购了澳大利亚JRH公司,有了JRH的EX-CELL系列,无血清培养基的选择也更多了。
这么多种,要选择起来也是个头疼的事情。
除了部分培养基是公开配方的,如用于培养内皮细胞的MCDB131(Sigma),大部分液体培养基都是专利配方的,也就是说其中的成分是保密的。
那么你只能是检索文献、让供应商推荐,然后用自己的细胞做几次传代培养来选出最合适的培养基。
毕竟实践出真知嘛。
P.S.附上一些细胞培养中的小Tip,可能会对您有所启发。
(部分摘自Invitrogen的中文Focus)
•切记,细胞培养基的储存条件是2-8摄氏度。
如果细胞培养基不小心被冻,您应该融化培养基并观察是否有沉淀产生。
如果没有沉淀产生,培养基可以正常使用,如果出现沉淀,只能丢弃这些培养基。
•贮存在冰箱中的瓶口已开的培养基,可能在放置几天后颜色变紫。
这主要是由于在暴露到周围的CO2水平时,碳酸氢纳导致了pH值的上升。
您可以在使用前松开瓶口,在CO2培养箱孵育培养基10-15分钟,来校正溶液的pH值(确定松开瓶口以保证气体交换)。
•当在无血清培养基中添加抗生素时,降低至少在有血清培养基中所使用浓度的50%。
血清蛋白会结合和灭活一些抗生素。
在无血清培养条件下,抗生素不被灭活,可能对于细胞达到毒性水平。
•一旦您在新鲜培养基中添加了血清和抗生素时,您应该在两到三周内使用它。
因为一些抗生素和血清中的基本成分在解冻后就开始降解。
•总之,大部分添加物和试剂最多可以冻融3次,如果次数更多都会在包含蛋白的溶液引起一定水平的降解和沉淀,将会影响它的性能。
•血清的热灭活在免疫分析时可以灭活补体系统。
在免疫学研究,培养ES细胞,昆虫细胞和平滑肌细胞时,推荐使用热灭活血清。
热灭活是以往公认的操作步骤,并没有确凿的证据说明这样做是有益的。
相反,对大部分细胞而言,GIBCO和HyClone都不推荐热灭活血清。
因为加热可能使血清中的沉淀增加,使您误以为污染。
•如何避免血清中沉淀物的产生?
1.解冻血清时,请按照所建议的逐步解冻法(-20℃至4℃至室温),若血清解冻时改变的温度太大(如-20℃至37℃),实验显示非常容易产生沉淀物。
并随时将之摇晃均匀,使温度及成分均一,减少沉淀的发生。
2.请勿将血清置于37℃太久。
若在37℃放置太久,血清会变得混浊,同时血清中许多较不稳定的成分也会因此受到损害,而影响血清的质量。
3.血清的热灭活非常容易造成沉淀物的增多,若非必要,可以无须做此步骤。
4.若必须做血清的热灭活,请遵守56℃,30分钟的原则,并且随时摇晃均匀。
温度过高,时间过久或摇晃不均匀,都会造成沉淀物的增多。
•在进行传代培养时,我们强烈推荐进行台盼兰活性记数。
研究者常常通过一个简单的稀释(1∶4或1∶2)进行传代,不进行活性检测,您可能接种比你认为的低的多的浓度的细胞,这常常可能导致生长缓慢或培养物根本不生长。
•贮存在4℃冰箱中的液体胰蛋白酶溶液只能使用一周。
胰蛋白酶在4℃就可能开始降解,如果在室温下放置超过30分钟,就会变得不稳定。
•在订购的细胞到达后,应立即复苏,如果培养基还没有准备好,可将其放入液氮中,尽快复苏。
千万不能放置在-20或-80℃的冰箱内。
•细胞复苏往往是比较容易出问题的步骤。
请在订购细胞时就向供应商索取详细的复苏步骤,并仔细阅读。
有些供应商就不推荐在复苏时离心,对此类细节,应特别留意。
Gibco无血清培养基分研究级和治疗级
注:
人血清白蛋白(HumanSerumAlbumin,简称HSA)
因此,淋巴细胞可用的培养基包括:
RPMI-1640Medium、DMEM-高糖、McCoy’s5A、Iscove’sModifiedDulbeccoMedium(IMDM)、GIBCOAIMVMedium,liquid、