灭菌无菌工艺验证指导原则Word下载.docx
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5）除菌过滤。
按工艺的不同分为最终灭菌工艺（sterilizing
process）和无菌生产工艺（asepticprocessing）。
其中最终灭菌工艺系指将完
成最终密封的产品进行适当灭菌的工艺，由此生产的无菌制剂称为最终灭菌无菌
药品，湿热灭菌和辐射灭菌均属于此范畴。
无菌生产工艺系指在无菌环境条件下，
通过无菌操作来生产无菌药品的方法，除菌过滤和无菌生产均属于无菌生产工
艺。
部分或全部工序采用无菌生产工艺的药品称为非最终灭菌无菌药品。
基于无
菌药品灭菌/除菌生产工艺的现状，本指导原则主要对在注射剂与无菌原料药的
生产中比较常用的湿热灭菌与无菌生产工艺进行讨论。
本指导原则中的湿热灭菌
工艺验证主要包括灭菌条件的筛选和研究，湿热灭菌的物理确认，生物指示剂确
认等内容；
无菌生产工艺验证主要包括无菌分装、除菌过滤、培养基模拟灌装、
过滤系统的验证等验证内容。
最终灭菌工艺和无菌生产工艺实现产品无菌的方法有本质上的差异，从而
决定了由这两类工艺生产的产品应该达到的最低无菌保证水平的巨大差异。
最终
灭菌无菌产品的无菌保证水平为残存微生物污染概率≤10-6，非最终灭菌无菌产
品的无菌保证水平至少应达到95%置信限下的污染概率<
0.1%。
由此可见，非最终
灭菌无菌产品存在微生物污染的概率远远高于最终灭菌无菌产品，为尽量减少非
最终灭菌无菌产品污染微生物的概率，鼓励企业在生产中采用隔离舱等先进技术
设备。
基于质量源于设计的药品研发与质量控制的理念，为保证无菌药品的无菌
保证水平符合要求，研发者在产品的研发过程中应根据药品的特性选择合适的灭
菌方式，并系统地评估生产的各环节及各种因素对无菌保证水平的影响，根据风
险的高低与风险发生的可能性等来针对性地验证灭菌工艺的可靠性，验证的内
容、范围与批数等取决于工艺与产品的复杂性以及生产企业对类似工艺的经验多
少等因素。
只有在研发中经过系统而深入的研究与验证，获得可靠的灭菌工艺，
并在日常的生产过程中严格执行该工艺，才能真正保证每批药品的无菌保证水平
符合预期的要求。
当然，在药品的整个生命周期内，随着对所生产的药品的特性
和生产工艺等的了解越来越全面和深入，灭菌工艺也在不断的完善，此时就会涉
及到对变更后的工艺如何进行验证的问题，本指导原则也适用于此种情况。
由于灭菌/除菌工艺验证的工作在我国开展的时间不长，基础还不牢靠，因
此必然在实际工作中会遇到很多难以预料的问题，故本指导原则只是一个一般性
原则，药物研发者应从药物研发的客观规律出发，具体问题具体分析，必要时根
据实际情况采用其他有效的方法和手段。
同时，本指导原则作为阶段性产物，必
将随着药物研究者与评价者对灭菌工艺研究与验证的认知加深，而不断进行修订
与完善。
2制剂湿热灭菌工艺
2.1湿热灭菌工艺的研究
2.1.1湿热灭菌工艺的确定依据
灭菌工艺的选择一般按照灭菌工艺的决策树（详见附件1）进行，湿热灭菌
工艺是决策树中首先考虑的灭菌工艺。
湿热灭菌法是利用高压饱和蒸汽、过热水
喷淋等手段使微生物菌体中的蛋白质、核酸发生变性而杀灭微生物的方法。
高温
在杀灭微生物的同时，可能对药品的质量也有所影响。
如果产品不能耐受湿热灭
菌，则需要考虑采用无菌生产工艺。
所以，对于药品的灭菌工艺的考察和确定，
首先是考察其能否采用湿热灭菌工艺，能否耐受湿热灭菌的高温。
目前湿热灭菌方法主要有两种：
过度杀灭法（F0≥12）和残存概率法（8≤
F0<
12）。
用其它F0值小于8的终端灭菌条件的工艺，则应该按照无菌生产工艺
要求。
以上两种湿热灭菌方法都可以在实际生产中使用，具体选择哪种灭菌方法，
在很大程度上取决于被灭菌产品的热稳定性。
药物是否能耐受湿热灭菌工艺的高
温，除了与药物活性成分的化学性质相关外，还与活性成分存在的环境密切相关，
所以在初期的工艺设计过程中需要通过对药物热稳定性进行综合分析，以确定能
否采用湿热灭菌工艺。
2.1.1.1活性成分的化学结构特点与稳定性
通过对活性成分的化学结构进行分析，可以初步判断活性成分的稳定性，如
果活性成分结构中含有一些对热不稳定的结构基团，则提示主成分的热稳定性可
能较差。
在此基础之上，还应该通过设计一系列的强制降解试验对活性成分的稳
定性做进一步研究确认，了解活性成分在各种条件下可能发生的降解反应，以便
在处方工艺的研究中采取针对性的措施，保障产品能够采用湿热灭菌工艺。
2.1.1.2处方工艺的研究
在对活性成分的结构特点与稳定性进行研究的基础上，可以有针对性的进行
处方工艺的优化研究。
如活性成分易发生氧化反应，则需要考虑是否需要在工艺
中去除氧并采取充氮的生产工艺，或在处方中加入适宜的抗氧剂；
如活性成分的
稳定性与pH值相关，则需要通过研究寻找最利于主成分稳定性的pH值，当然此
时需要关注该pH值在临床治疗时能否接受；
如果主成分是因为某些杂质的存在
影响了稳定性，则需要通过适宜的手段去除相关的杂质；
如果是主成分在某种溶
剂系统中稳定性较差，则需要考虑更换溶剂系统，此时同样需要考虑所选用的溶
剂系统在临床应用时能否被接受；
湿热灭菌的不同灭菌温度和灭菌时间的组合对
产品的稳定性的要求有所不同，可以在保证提供所需的SAL的基础上，通过灭菌
时间和灭菌温度的调整来确定药物可以耐受的湿热灭菌工艺。
总之，需要通过各个方面的研究，使药物尽可能的可以采用湿热灭菌工艺。
只有在理论和实践均证明即使采用了各种可行的技术方法之后，活性成分依然无
法耐受湿热灭菌的工艺时，才能选择无菌保证水平较低的无菌生产工艺。
2.1.1.32.1.3稳定性研究
无论使用何种设计方法，都需要进行最终灭菌产品的稳定性研究。
考察最终
灭菌程序对产品性质稳定性影响的试验可包括产品的降解、含量、pH值、颜色、
缓冲能力以及产品的其它质量特性。
灭菌时，杀灭微生物的效果和活性成分的降解都随着时间和温度而累积。
这
意味着加热和冷却的变化将影响产品的稳定性，同时影响杀灭效果。
因此，稳定
性研究用样品最好选取处于最苛刻的灭菌条件的产品，如：
可采用在热穿透试验
中F0最大的位置上灭菌的产品进行稳定性考察，以确保灭菌产品的质量仍能符合
2.1.2过度杀灭法的工艺研究
通常来说，与残存概率法相比，过度灭杀法所需的被灭菌品开始生产阶段和
日常监控阶段生物负荷的信息较少，但是过度杀灭要求的热能比较大，其后果是
被灭菌品降解的可能性增大。
过度杀灭法的目标是确保达到一定程度的无菌保证水平，而不管被灭菌产品
初始菌的数量及其耐热性如何。
过度杀灭法假设的生物负荷和耐热性都高于实际
数，而大多数微生物的耐热性都比较低，很少发现自然生成的微生物的D121℃值
大于0.5分钟。
因此，过度杀灭的灭菌程序理论上能完全杀灭微生物，从而能提
供很高的无菌保证值。
由于该方法已经对生物负荷及耐热性作了最坏的假设，从
技术角度看，对被灭菌品进行初始菌监控就没有多大必要了。
但这并不意味着生产过程中对污染可以完全不加控制。
仅从控制热原的角
度，也应当遵循工艺卫生规范，控制产品的微生物污染。
如果实际生产中能够严
格遵循GMP的要求，这一点是可以实现的。
2.1.3残存概率法的工艺研究
与过度杀灭法相比，残存概率法方法所需的信息量要大得多，包括被灭菌品
生产开始阶段及常规生产阶段的信息、指示菌（对灭菌程序呈现强耐热性的试验
菌）以及生物负荷的信息。
只有积累了这类有价值的信息后，才能制定比过度杀
灭法F0值低的热力灭菌程序，同时产品的无菌保证水平不会降低。
使用热力较低
灭菌程序更有利于药品的稳定性，使产品的有效期延长。
正是因为这个原因，残
存概率法更适合那些处方耐热性较差的最终灭菌产品。
通常说来，不耐热药品的灭菌可能不能使用过度杀灭法，需要设计一个灭菌
程序能够恰当地杀灭生物负荷，同时不导致产品不可接受的降解。
这种情况下，
灭菌程序的确认就需研究产品的生物负荷和耐热性。
根据以下公式可以比较清楚
的说明这一点：
无菌保证值=F0/D-lgN0
其中，无菌保证值是SAL的负对数，N0为灭菌开始时产品中的污染微生物总
数，D为污染微生物的耐热参数。
所以，菌工艺的无菌保证值与F0、N0、D密切
相关。
2.1.3.1灭菌前生物负荷的控制
采用残存概率法进行终端灭菌的产品，除了需要关注灭菌过程本身，还需要
在生产过程中采用一些适当的手段来监测和控制药品灭菌前的生物负荷。
具体的
措施通常包括灭菌前微生物数量与耐热性的监测、药液过滤、工艺参数的控制等
灭菌前微生物污染水平的监测将在下面的章节详细阐述。
产品过滤在终端灭
菌的产品中仅仅作为辅助的控制手段，但是在工艺确定的过程中，也应该对滤膜
的孔径、材质、滤器的使用周期进行必要的筛选。
在工艺参数控制方面，由于微
生物的特性，通常在药液放置期间也会逐渐繁殖，尤其一些营养型的注射液，如
葡萄糖注射液、复方氨基酸注射液等，其环境更有利于微生物的生长和繁殖，因
此应通过工艺筛选和验证来确定溶液配制至过滤前、以及过滤后至灭菌前能够放
置的最长时限，并相应确定产品的批量、生产周期等关键工艺参数。
2.1.3.2灭菌前微生物污染的监测
灭菌前微生物污染水平的监测应在正常生产过程中取样并覆盖整个生产过
程，取样设计应选取生产过程中污染最大，最有代表性的样品，且要充分考虑到
产品从灌封到灭菌前的放置时间。
一般而言，如果灌装持续一段时间，可从每批
产品灌装开始、中间及结束时分别取样。
污染水平检查可以采用如下的方法：
先
用灭菌的5%吐温充分湿润0.45um的滤膜，然后定量过滤药液，将此滤膜移至营
养琼脂平板上，在30~35℃下培养3~7天，计数。
分离获得的污染菌需要进行耐热性的检查。
污染菌的耐热性检查可以采用以
下的测定方法：
先用灭菌的5%吐温充分润湿0.45um的滤膜，然后过滤污染水平
监测所取的药液样品，再将此膜移至装有无菌的待监测产品的试管中，在沸水浴
上煮沸约30分钟，然后在30-35℃下在硫乙醇酸盐肉汤中培养，观察是否有耐
热菌生长。
当耐热性检查发现药液存在耐热污染菌污染时，可采用定时煮沸法将它和已
知的生物指示剂的耐热性加以比较，必要时，可再测试耐热污染菌的D值（D值
的具体检测方法详见附件2），然后根据灭菌的F0值及污染菌的数量与耐热性对
产品的无菌做出评价。
当产品微生物污染水平超标准时，应对污染菌进行鉴别、
调查污染菌的来源并采用相应的纠正措施。
2.2湿热灭菌工艺的验证
湿热灭菌工艺的验证一般分为物理验证和生物学验证两部分，物理验证包括
热分布、热穿透试验，生物学验证主要是微生物挑战试验。
物理验证是证实灭菌
效果的间接方式，而微生物挑战试验则直接反映灭菌的效果，两者不能相互替代。
2.2.1物理确认
2.2.1.1空载热分布试验
空载热分布的目的是主要是了解整个灭菌设备的运行情况，确认灭菌室内的
温度均匀性，测定灭菌腔内不同位置的温差状况，确定可能存在的冷点。
空载热
分布试验通常采用足够数量的热电偶或热电阻作温度探头，进行编号后将它们固
定在灭菌柜腔室的不同位置。
温度探头的安放位置需要根据设备类型和不同位置
下的灭菌风险评估而定，应包括可能的高温点、低温点，灭菌柜温度控制探头处、
靠近温度记录探头处，其他的探头可以均匀地分布于灭菌柜腔室内，以使温度的
检测具有较好的代表性。
温度探头在试验前后至少需要两个温度点进行校正。
温
度探头安放结束后，即可以按照设定的灭菌程序进行灭菌。
2.2.1.2装载热分布试验
装载热分布试验的目的是了解设备在装载条件下内部的温度分布状况，包括
高温点、低温点的位置，为后续的评估和验证打下基础。
装载热分布一般在空载
热分布的基础上进行。
温度探头的个数和安放的位置一般同空载热分布试验，注
意一定要在空载热分布试验确定的冷点安放温度探头。
温度探头安放在待灭菌的
容器的周围，注意不能介入待灭菌的容器。
装载热分布试验需要考虑最大、最小和生产过程中典型装载量情况，进行试
验时，应尽可能使用待灭菌产品，如果采用类似物，应结合产品的热力学性质等
进行适当的风险评估。
待灭菌产品的装载方式和灭菌工艺的各项参数的设定应与
正常生产时一致，应采用图表的方式说明产品的装载情况，并评估探头放置是否
合理。
如果待灭菌产品存在不同包装规格或浓度规格，应评估验证所采用的样品
和装载方式是否能充分反映所有样品的实际装载情况。
每一装载量的热分布试验
需要至少进行三次。
温度探头在试验前后同样均需要进行校正。
2.2.1.3热穿透试验
热穿透试验是考察灭菌柜和灭菌程序对待灭菌产品适用性的一项试验。
热穿
透试验的目的是确认产品内部也能达到预定的灭菌温度。
对于药物而言，灭菌程
序既要赋予产品一定的F0值，以保障产品的SAL≤10－6。
同时灭菌程序又不应
使产品受热过度而造成药物部分降解，以致同一灭菌批次的产品出现质量不均
一。
热穿透试验所用的温度探头的个数和安放位置需要根据热分布试验的结果
确定。
一般可以采用足够数量的温度探头。
应将热穿透温度探头置于液体容器中
的冷点，即整个包装中最难灭菌的位置。
如果有数据支持或有证据表明将探头放
在产品包装之外也能够反映出产品的热穿透情况，风险能够充分得到控制，也可
以考虑将探头放在容器之外。
插有温度探头的产品的安放位置包括热分布试验确
定的冷点和高温点、其他可能的高温点、灭菌柜温度探头附近、温度记录探头处。
热穿透试验的步骤及要求与装载的热分布试验基本相同，每一装载方式的热
穿透试验也需要至少进行三次。
通过热穿透试验可以确定在设定的灭菌程序下，
灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够到达设定的温度。
结合灭菌前微生物污
染的检测，可以确定灭菌柜内各个位置的待灭菌产品是否能够获得设定的F0值。
对于F0值最大点位置的样品，由于其受热情况最为强烈，因此应评估该位置
下产品的稳定性情况，以进一步确认灭菌对于产品的稳定性没有影响。
2.2.1.4热分布和热穿透试验数据的分析处理
在物理确认试验中，应确认关键和重要的操作参数并有相应的文件和记录。
通常需要关注的主要参数包括
-每个探头所测得温度的变化范围
-不同探头之间测得的温度变化范围
-探头测得的温度与设定温度之间的差值
-探头测得超过设定温度的最短及最长时间
-F0的下限及上限
-灭菌阶段结束时的最低F0值
-灭菌阶段的最低和最高压力
-饱和蒸汽温度和压力之间的关系
-灭菌阶段腔室的最低和最高温度
-热穿透温度探头之间的最大温差或F0的变化范围
-热分布试验中温度探头间的最大温差
-最长平衡时间
-最少正常运行的探头数
合格标准应结合灭菌条件、灭菌设备的特点以及产品的实际情况制定。
通常
情况下，灭菌柜腔室最冷、最热点和平均温度之间的温差应不超过2.5℃。
保温
时间内温度波动应在±
1.0℃之内，如果温度差别过大，提示灭菌柜的性能不符
合要求，需要寻找原因并进行改进，重新进行验证。
另外对于热敏感的药物，还
应该控制灭菌柜的升温和降温时间，以保证热能的输入控制在合理的范围以内，
不会对产品的热稳定性造成影响。
2.2.2生物学确认
湿热灭菌工艺的微生物挑战试验是指将一定量已知D值的耐热孢子（生物指
示剂）在设定的湿热灭菌条件下灭菌，以验证设定的灭菌工艺是否确实能达到产
品所需的标准灭菌时间和F0。
此项验证工作能够如实反映灭菌工艺条件对微生物
的杀灭效果，从而证明该灭菌工艺所赋予相关产品的无菌保证水平是否符合要
求。
2.2.2.1生物指示剂选用的一般原则
一般情况下，生物指示剂选择的原则性要求是：
孢子稳定、非致病菌、易于
培养、有效期长、保存及使用方便、安全性好。
针对具体的灭菌工艺和具体的产
品，还应注意所用的生物指示剂的耐热性应强于待灭菌产品中的污染菌。
湿热灭菌工艺常用的生物指示剂有以下几种，嗜热脂肪芽孢杆菌，枯草芽孢
杆菌，凝结芽孢杆菌，梭状芽孢杆菌等。
对于采用过度杀灭法的灭菌程序，生物
指示剂系统主要是嗜热脂肪芽孢杆菌的孢子。
残存概率法由于其热输入量比较
低，因此在验证中使用的生物指示剂的耐热性可以小于嗜热脂肪芽孢杆菌的孢
子。
2.2.2.2生物指示剂的使用和放置
实际验证过程中可以直接采用市售的生物指示剂成品或将生物指示剂接种
在待灭菌产品上。
采用市售品时，只要供应商具有相应的质量体系认证资质，在
测试中其提供的生物指示剂的D值就可以被接受。
采用将生物指示剂接种到待灭
菌产品的方法，由于生物指示剂在不同介质或环境中的耐热性会有所不同，首先
应考虑产品对生物指示剂耐热性的影响。
所以对于具体的品种而言，如果需要将
生物指示剂接种至产品之中，应测定生物指示剂在该产品中的耐热性，即D值。
如果生物指示剂与产品不相容，可以用与产品相似的溶液来代替产品。
生物指示剂的用量需要根据生物指示剂在待灭菌样品中的耐热性来确定，其
用量应符合挑战性试验的要求。
生物指示剂的用量可以采用阴性分数法或者残存
曲线法计算，可以根据实际情况（如污染菌的耐热性，拟用的生物指示剂的D
值等）选择合适的计算方法，具体检测方法见附件3。
应结合产品特点和热分布、热穿透的实际结果来确定生物指示剂的放置位
置。
装有生物指示剂的容器应紧挨于装有测温探头的容器，在灭菌设备的冷点处
必需放置生物指示剂。
灭菌柜的其他部位应装载产品或者类似物，以尽可能的模
仿实际生产时的状况。
2.2.2.3灭菌
生物指示剂的验证应该按照产品设定的灭菌工艺进行灭菌。
2.2.2.4检查和培养
可以根据生物指示剂的生长特性以及验证时的包装方式，采用适当的方法进
行检查和培养。
将指示剂放入培养基中进行培养。
需要注意不同的生物指示剂所
需要的培养条件也各不相同，针对使用的生物指示剂确定培养条件，同时应放置
阴性和阳性对照样品。
2.2.3.5试验结果的评价
根据生物指示剂的D值和接种量推算产品在灭菌过程中实际达到的SAL值。
验证新的灭菌工艺时，每个产品的每个规格的每一灭菌程序，至少需要连续进行
三次生物指示剂验证试验。
如果试验的重现性好，所有试验的结果均提示SAL≤
10-6，则验证结果提示该灭菌工艺为验证合格的灭菌工艺。
如果各次验证的结果
不一致，需要分析原因，采取相应的改进措施后重新进行验证工作。
3制剂无菌生产工艺
3.1无菌生产工艺的研究
无菌药品应首选采用终端灭菌工艺。
如不能耐受终端灭菌工艺条件，应尽量
优化处方工艺，以改善其耐热性。
如确实无法耐受终端灭菌工艺，则可采用无菌
生产工艺。
无菌生产工艺通常包括无菌分装生产工艺和除菌过滤生产工艺。
3.1.1无菌分装生产工艺的研究
无菌分装生产工艺是将采用经验证的灭菌/除菌工艺过程处理后的原料药或
者原料药和辅料，用无菌生产的方法分装到采用经验证的灭菌工艺处理的容器
中，密封得到的。
无菌分装生产工艺的工艺研究和生产过程控制的重点是影响无
菌保证水平的工艺步骤，主要包括物料（包括原料药、辅料、内包装材料等）的
质量控制、原材料暴露于环境中可能再污染的操作步骤等。
关于物料的质量控制，采用无菌分装生产工艺的制剂所涉及的各种物料，都
必须采用适当的灭菌/除菌工艺处理后方可使用。
各种物料的灭菌/除菌工艺，都
应是经过验证的、控制良好的工艺。
同时需要对各种物料的无菌性、细菌内毒素
水平等进行严格控制，通过研究确定相应的质控标准。
无菌分装的生产工艺是将原料药或者原料药和辅料经分装设备分装至内包
装材料中后密封得到。
分装步骤是影响产品质量和无菌保证水平的关键生产步
骤，应结合生产设备和产品特点进行工艺参数的研究，包括分装速度和分装时间
等。
无菌分装生产工艺能否达到设定的无菌保证水平，与整个生产过程的控制密
切相关，应按照GM要求及产品具体生产工艺情况进行生产环境和生产过程的控P
制。
在进行无菌生产工艺验证时，应采用最差条件进行验证，在实际生产过程中，
对生产过程和工艺参数的控制均不能超过经验证的最差条件的控制范围。
3.1.2过滤除菌生产工艺的研究
过滤除菌的无菌生产工艺是通过除菌过滤器，将药液中的微生物除去得到无
菌滤液。
采用过滤除菌工艺时，同样需要对影响无菌保证水平的工艺步骤及工艺
参数进行详细的研究，主要包括物料的质量控制、除菌过滤器的选择及除菌过滤工艺参数的研究、除菌过滤生产过程的控制等。
对于采用过滤除菌生产工艺的制剂，需注意对配制药液使用的原料药、辅料
（包括注射用水）等原材料的微生物种类及数量进行检查，掌握潜在的污染微生
物的总体特性情况，通过研究确定相应的质控标准。
采用过滤除菌生产工艺的制剂所使用的内包装材料，必须采用适当的经验证的灭菌工艺处理后方可使用。
除菌过滤生产工艺所使用的除菌过滤器，通常为标称孔径0.2微米或更小的
除菌级的过滤器。
除菌过滤器的过滤效能是评价除菌过滤工艺的重要参数，需要
对除菌过滤器的过滤效能进行验证。
通常，影响除菌过滤器的除菌过滤效能的因
素包括：
①药液的性质，如药液的粘度、表面张力、pH值、渗透压等；
②过滤
步骤的工艺参数，如过滤的压力、流速、时
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