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淫羊藿提取方法

淫羊藿苷提取工艺研究

作者：

佚名    科研信息来源：

本站原创    点击数：

532    更新时间：

2005-8-15

[关键词]：

淫羊藿苷

健康网讯：

    淫羊霍来源于小檗科Beberidaceae淫羊藿属Epimedium多种植物，为常用补肾壮阳中药，其主要成分为异戊烯取代的黄酮类化合物。

对淫羊藿及其制剂的质量评价，大多以所含淫羊藿苷或总黄酮为指标。

本文通过探讨不同提取溶媒、煎煮时间、浓缩时间及温度、药材粉碎度对淫羊藿苷含量的影响，为合理提取淫羊藿的活性成分提供参考。

    1　仪器与试药

    美国HP1100型高效液相色谱仪。

淫羊藿苷对照品（批号：

9508，中国药品生物制品检定所，供含量测定用）。

淫羊藿药材由健心医药有限公司提供，经广州市药检所谢培山主任药师鉴定为巫山淫羊藿EpimediumwushanenseT.S.Yingo甲醇、乙腈为色谱纯，其余试剂均为分析纯。

    2　方法与结果

    2.1　淫羊藿苷的含量测定

    2.1.1　色谱条件　色谱柱：

HPSpherisorbODS2（250×4mm，5μm），流动相：

乙腈-水（30:

70），检测波长270nm，柱温25℃，流速1mL/min。

    2.1.2　线性范围　分别精密吸取淫羊藿苷对照品溶液（0.206mg/mL）0.5，2.5，5.0，7.5，10μL，按上述色谱条件进样测定，以对照品进样量为横坐标，峰面积积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程：

Y=2131.02921X-8.16197，r＝0.9999，淫羊藿苷在0.10～2.06μg范围内与峰面积呈良好的线性关系。

    2.2　不同提取溶媒对淫羊藿苷提取率的影响取淫羊藿药材粉末（50目）约0.2g共6份，精密称重，其中5份置60mL圆底烧瓶中，分别以30％乙醇、50％乙醇、70％乙醇、无水乙醇、水各20mL为提取溶媒，回流提取1h;另1份置100mL三角烧瓶中，加水20mL加热提取1h。

待提取液冷却至室温，用50％乙醇定容至25mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，高效液相色谱法测定样品中淫羊藿苷的含量。

结果见表1。

表1　不同提取溶媒对淫羊藿苷提取率的影响

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提取溶媒30%乙醇50%乙醇70%乙醇无水乙醇水（回流）水（加热）

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淫羊藿苷

含量/%0.510.510.500.410.320.43

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    采用不同的提取溶媒，淫羊藿苷的提取率有较大差异，以纯水和无水乙醇为提取溶媒，淫羊藿苷含量均较低，而采用一定浓度的乙醇提取，淫羊藿苷含量明显增高，提示在实际生产中，对含淫羊藿药材的处方，可考虑以低浓度的乙醇提取，不仅有利于提高指标成分的含量，而且可降低生产成本。

    2.3不同煎煮时间及提取溶媒用量对淫羊藿苷提取率的影响取淫羊藿药材粉末（50目）约0.2g共14份，置100mL三角烧瓶中，精密称重，分别以水10mL、20mL提取0.5，1，1.5，2，3，4，5h，待提取液冷却至室温，50%乙醇定容至25mL，摇匀，0.45μm微孔滤膜过滤，取续滤液作为供试品溶液，高效液相色谱法测定样品中淫羊藿苷的含量。

结果见表2。

表2　不同煎煮时间及提取溶媒用量对

淫羊藿苷提取率的影响（%）

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煎煮时间/h

溶媒及用量———————————————————

0.511.52345

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水10mL0.390.380.440.440.480.510.42

水20mL0.420.450.470.480.510.580.48

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    随着煎煮时间和提取溶媒量的增加，淫羊藿苷的溶出量呈递增趋势，但煎煮时间过长会导致淫羊藿苷的破坏。

实验结果表明，当煎煮时间超过4h，淫羊藿苷的含量明显下降，说明持续的高温加热会引起淫羊藿苷的成分变化，提示在含淫羊藿的制剂工艺设计中，应尽量避免长时间煎提。

    2.4加热浓缩对淫羊藿苷提取率的影响取淫羊藿药材粉末（50目）1.6g,精密称重，以水160mL加热提取2h，待提取液冷却至室温，定容至200mL，摇匀，过滤，精密吸取续滤液20mL，共6份，分置于不同敞口容器中，按以下条件浓缩：

①100℃直火加热1h;②100℃直火蒸干药液后继续加热0.5h（总受热时间为1.5h）；③水浴浓缩1h;④75℃直火浓缩1.5h；⑤50℃直火浓缩3.5h;⑥75℃直火蒸干药液（总受热时间为5.5h）。

将按上述方法分别处理后的浓缩药液或残渣放冷，分别以适量50%乙醇稀释或溶解，并分次转移至25mL量瓶中，定容，0.45μm微孔滤膜过滤后进样分析，高效液相色谱法测定样品中淫羊藿苷的含量。

结果见表3。

表3　加热浓缩对对淫羊藿苷提取率的影响

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浓缩条件100℃,1h100℃,1.5h水浴,1h75℃,1.5h50℃,3.5h75℃,5.5h

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淫羊藿苷含

量/%0.5000.460.470.470.46

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    结果表明，在均匀受热状态下，高温短时间（1h）受热和较低温度下（75℃以下）长时间受热（超过5h）均不会使淫羊藿药材中的淫羊藿苷遭到破坏。

但直火加热lh和1.5h，淫羊藿苷含量有显著差异，加热1.5小时后，采用高效液相色谱法检测不到淫羊藿苷的存在，说明蒸干后继续高温加热可能会引起浸膏的不均匀受热或炭化，导致淫羊藿苷损失殆尽。

在工业大生产中，由于生产量大，药液加热浓缩的时间必然很长，长时间的加热使粘稠的药液极易因搅拌不及而导致受热不均，浸膏在浓缩的过程中炭化，药材中的活性成分如淫羊藿苷等均会遭致严重破坏。

在生产中若能采用旋转薄膜蒸发等方法，使药液在相对较低的温度下进行浓缩，对确保制剂产品的质量将大有裨益。

    2.5　不同粉碎度对淫羊藿苷提取率的影响　取未经粉碎的淫羊藿叶片、淫羊霍叶片粉末（粉碎度分别为20目和50目）各约0.29,精密称定重量，置100mL三角烧瓶中，加水20mL，加热提取2h，其余操作同上，重复操作2次，取平均值。

结果见表4。

表4　不同粉碎度对淫羊霍苷提取率的影响

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粉碎度　未经粉碎　20目　50目

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淫羊霍苷含量/%0.510.520.54

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    结果表明，粉碎度对淫羊藿苷的浸出影响不大，这可能与叶片类药材的质地较疏松有关。

提示在叶片类药材，即使是革质类叶片的提取过程中，只要有足够的溶媒使药材完全浸润，就能保证药材得到较完全的提取。

    3　讨论

研究结果表明，在含淫羊霍药材制剂的大规模生产中，简单的水提醇沉、去酒浓缩工艺已不能满足制剂工艺合理化的需要，如果不对提取工艺中的诸多参数进行综合考察，了解提取、浓缩等过程中活性成分或总提取物等的含量变化情况，不仅与传统的中医药理论背道而驰，还会导致产品质量的不可控，临床疗效势必大打折扣。

在工业大生产中，如何实现药材活性成分的合理化提取，值得药学工作者进行深入地探讨和研究。

淫羊藿黄酮类化合物提取研究进展时间:

2010-06-0314:

13来源:

作者:

张华峰,杨晓华

淫羊藿黄酮类化合物提取研究进展

摘要　黄酮类化合物是淫羊藿的主要有效成分,具有广泛而重要的药理活性,在医药、食品等领域具有良好的应用前景。

本文介绍了淫羊藿黄酮类化合物提取研究的现状,分析了提取研究中存在的问题,在此基础上提出了提取研究的思路与对策。

关键词　淫羊藿;提取;黄酮类化合物

植物提取物是重要的药物来源,中国、法国、瑞士、波兰、英国、比利时、荷兰、匈牙利、罗马尼亚、意大利、德国等国家或地区的药典均收录了大量植物提取物〔1〕;此外,植物提取物在食品、化妆品等领域也具有重要用途〔2〕。

植物提取物是我国中药出口创汇的主要商品类型。

据中国医药保健品进出口商会统计,2006年我国植物提取物出口累计4177亿美元,占中药出口总额的43174%〔3〕;2007年出口累计4180亿美元,占中药出口总额的40168%〔4〕。

植物提取物的制备技术以及生物活性成分的提取工艺研究,是生物分离工程研究领域的重要课题,对医药、食品、化妆品工业的进步具有巨大的推动作用。

淫羊藿是著名的中药材,具有治疗骨质疏松症、调节雄性发育等药理活性。

淫羊藿在日本、韩国、东南亚地区和地中海地区等也被作为药用植物〔5〕。

药理学研究表明,淫羊藿的主要有效成分为黄酮类化合物〔6〕。

截止2005年,已经从淫羊藿中分离鉴定了60多种黄酮类化合物。

其中,82异戊烯基黄酮醇及其苷类具有调节神经和内分泌系统、调节免疫、壮阳、防治骨质疏松症、防治肥胖症、抗炎、抗抑郁等功效,朝藿定（epimedin）A、朝藿定C等还在癌症、心血管疾病等重大疾病防治方面具有重要的应用前景〔5,7211〕。

研究淫羊藿黄酮类化合物的提取工艺或制备技术,对于淫羊藿药材质量控制方法的完善、药效物质基础的揭示以及新型植物药和食品配料或添加剂的研究与开发皆具有重要意义。

1　黄酮类化合物分离纯化研究进展

1.1　传统提取方法　淫羊藿总黄酮和淫羊藿苷（icariin）具有多种生物活性,是中国药典规定的淫羊藿药材质量评价指标。

有关淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷提取的报道很多。

加热回流法是最常见的淫羊藿黄酮类化合物提取技术〔12〕。

陶君彦等〔13〕优选的乙醇回流工艺是:

采用10倍量70%乙醇溶液提取2次,每次115h,总黄酮、淫羊藿苷的提取率分别达到93134%、85187%。

除加热回流法外,淫羊藿黄酮类化合物的传统提取方法还包括水煎法、渗漉法、醇提水沉法等。

王欣等〔14〕比较了乙醇回流法、水煎法和乙醇渗漉法对巫山淫羊藿（Epimediumwushanense）中淫羊藿苷的提取量,发现乙醇渗漉法提取效率高、溶剂用量少、能耗低。

苏玉春等〔15〕建立了淫羊藿的水提醇沉提取工艺,淫羊藿苷提取率约8190%。

李玉山等〔16〕比较了水提醇沉法和醇提水沉法对淫羊藿苷的提取效果,发现后者的得率和纯度较高。

申庆亮等〔17〕比较了水提醇沉法、乙醇回流法和碱提醇沉法对总黄酮的提取率,表明乙醇回流法提取效果最好。

1.2　超临界流体萃取方法　Liu等〔18〕优化得到了朝鲜淫羊藿（E1koreanum）中总黄酮的CO2超临界流体萃取工艺:

采用70%乙醇溶液为助剂（modifi2er）,萃取压力30MPa,萃取温度60℃,先静止提取30min,后动态提取120min（流速6mL/min）。

该超临界流体萃取法比乙醇回流法效率更高、污染更小。

由于CO2超临界流体萃取法所使用的提取溶剂（超临界CO2）安全无毒、不易燃易爆、成本低廉、在提取结束后容易去除,因此该方法十分适用于中药材中非极性生物活性成分的提取。

然而,淫羊藿苷等黄酮醇糖苷系极性化合物,这就限制了该方法在淫羊藿黄酮类化合物提取中的应用。

目前主要采用添加极性夹带剂〔18〕,使超临界CO2形成反向微团或乳状液（reversemicellormicroemulsion）等方法解决此问题。

夹带剂可以改变提取溶剂对目标化合物的选择性和溶解性,但是某些夹带剂（如甲醇）却可能带来溶剂残留问题。

总体上看,国内外有关淫羊藿黄酮类化合物的CO2超临界流体萃取研究开展得很少,相关研究尚待加强。

1.3　外场辅助提取方法　杨帆等〔19〕比较了乙醇回流法与超声波提取法对淫羊藿中淫羊藿苷的提取效果,证明前者优于后者。

但是郭孝武〔20〕却发现超声波辅助提取30min后的淫羊藿叶肉部分多数被破坏,细胞壁破裂,细胞严重损伤,说明超声波处理有利于淫羊藿苷的提取。

欧少英等〔21〕利用正交试验法优化得到了淫羊藿苷的超声波辅助提取工艺:

使用8倍量80%乙醇溶液超声波提取2次,每次90min。

胡筱等〔22〕优选的淫羊藿总黄酮提取工艺为:

以80%乙醇溶液为提取溶剂,超声波频率40kHz,提取1次,提取时间30min,提取温度室温。

笔者建立了心叶淫羊藿（E1brevicornu）中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的超声波辅助提取工艺:

以50%乙醇溶液为溶剂,在液固比30∶1（mL/g）、提取温度50℃条件下超声波提取3次（30min/次）。

同常规的加热提取法和索氏提取法相比,笔者优选的超声波提取工艺提取时间较短、提取温度较低、溶剂消耗量较少〔5〕。

为了揭示超声波辅助提取的机理,笔者运用电子显微镜技术观察了超声波处理对淫羊藿叶片干粉的效应,发现超声波可以降低样品粒度,并使样品表面产生损伤。

降低样品粒度能够促进样品与溶剂的接触,增加直接暴露在超声波场中的样品细胞数目,从而提高提取效率;样品表面的损伤可能使细胞表面孔洞增大或者孔洞数目增加,有利于溶剂进入细胞内部并使细胞中的目标黄酮类化合物溶出〔5〕。

陈燕芬等〔23〕比较了微波提取法与加热提取法对淫羊藿中淫羊藿苷的提取效果,发现10min的微波处理即可接近30min加热提取的效果。

黄瑞华等〔24〕也优选了淫羊藿苷的微波辅助提取工艺,该方法与常规方法相比能大大节省提取时间、提高提取率。

Chen等〔25〕以淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和总黄酮为提取指标,建立了一种动态微波辅助提取工艺,该方法的提取量高于加热回流法和索氏提取法,提取时间也较短。

1.4　精制、纯化方法　大孔吸附树脂常被用来分离、纯化淫羊藿黄酮类化合物。

李秀男等〔26〕考察了8种大孔吸附树脂对淫羊藿苷的吸附分离性能,优选的树脂经一步层析即可将淫羊藿苷的纯度提高近十倍。

李玉山等〔16〕先用大孔吸附树脂从巫山淫羊藿提取液中分离到总苷,再用硅胶柱层析方法纯化出淫羊藿苷,得率约为119%,纯度超过98%。

赵小妹等〔27〕比较了大孔吸附树脂法、醇沉法、超滤法和吸附澄清法对淫羊藿水提液中淫羊藿苷的精制效果,发现醇沉法所得浸膏中淫羊藿苷含量最高。

Liu等〔28〕采用制备型高速逆流色谱方法（preparativehigh2speedcounter2currentchromatographymethod）从朝鲜淫羊藿中分离、纯化到了淫羊藿苷、淫羊藿次苷Ⅱ（icarisideⅡ）和epimedokoreanosideⅠ。

王超展等〔29〕采用半制备型反相高效液相色谱从箭叶淫羊藿（E1sagittatum）中分离得到了温哥华苷F（hexan2drasideF）、朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C和淫羊藿苷,其中温哥华苷F首次从淫羊藿属（EpimediumL1）植物中分离得到。

李步海等〔30〕考察了Tween802（NH4）2SO4液2固萃取体系对淫羊藿粗提液的分离纯化效果,发现淫羊藿苷的一次萃取率可达9512%。

战佩英等〔31〕发现以乙酸乙酯为萃取剂所得淫羊藿总黄酮的纯度高于以正丁醇为萃取剂。

马慧萍等〔32〕证明,酸碱沉淀法对总黄酮的分离效果优于乙酸乙酯萃取法和铅盐沉淀法;采用甲醇作为纯化溶剂时,总黄酮收率优于乙醇、正丁醇和乙酸乙酯。

江永南等〔33〕优化了淫羊藿总黄酮的乙醇回流提取工艺,并用聚酰胺柱进行了分离纯化,最后制得了淫羊藿总黄酮磷脂复合物。

2　黄酮类化合物提取研究存在的问题

近年来,淫羊藿黄酮类化合物的提取研究取得了重大进展,淫羊藿提取物已经成为重要的出口创汇产品,淫羊藿苷也被开发成针剂。

但是,目前淫羊藿黄酮类化合物提取研究依然存在一些问题,主要表现在:

1）提取的目标化合物主要限于总黄酮或淫羊藿苷,有关朝藿定C等重要生物活性成分的提取研究报道十分鲜见。

在淫羊藿中,82异戊烯基黄酮醇及其苷类具有药理活性,某些黄酮类色素则没有显著的药理活性〔34〕。

因而,仅以总黄酮作为提取指标不能完全反映淫羊藿药理活性成分的提取效果。

大量研究表明,朝藿定A、朝藿定B、朝藿定C同淫羊藿苷一样皆广泛分布于淫羊藿属植物中,具有重要的药理活性〔5,34〕。

研究朝藿定C等重要黄酮类化合物的提取,具有一定的潜在应用价值。

2）淫羊藿黄酮类化合物的外场辅助提取研究取得了很大的进步,但是超声波、微波技术至今仍未应用于生产实践,提取工艺依然有待优化和完善,提取设备也有待改进和创新,提取机理亦有待深入探讨和揭示。

3）淫羊藿中黄酮类化合物的含量受到遗传因素和环境因素的影响,但是不同因素对黄酮类化合物水平的效应尚未完全揭示,最佳品种、最适生境都不够明确,这些问题制约了淫羊藿黄酮类化合物的工业化提取进程。

4）在淫羊藿黄酮类化合物的精制过程中,杂质的种类、含量尚不明确,不利于有的放矢地去除杂质。

3　黄酮类化合物提取研究展望

3.1　广泛研究淫羊藿多种重要黄酮类化合物的提取　除了继续开展淫羊藿总黄酮、淫羊藿苷的提取研究以外,还应当对朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C等重要药理活性成分的提取进行研究。

淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C四种黄酮醇糖苷的化学结构相近,药理活性显著,被认为是淫羊藿药材的标志化合物（markercompound）〔5,34236〕。

比较研究这四种标志化合物的提取过程,有利于总结淫羊藿黄酮类化合物提取的共性规律,为提取工艺的优化和提取设备的改进提供思路。

在提取研究中,可以尝试开展多种药理活性成分的联合提取。

成本高、效率低是制约植物活性物质工业化提取的主要原因之一,也是影响淫羊藿黄酮类化合物大规模制备的重要因素之一〔37〕。

如果能够实现两种或以上淫羊藿活性物质的联合提取,那么很可能使提取成本大大降低。

Chen等〔38,39〕建立的加压溶剂提取法（pressurizedliquidextraction）能同时提取淫羊藿中的15种黄酮类化合物。

笔者开展了淫羊藿黄酮类化合物和多糖的联合提取研究（未发表数据）。

3.2　揭示淫羊藿黄酮类化合物的提取机理、改进提取设备　研究淫羊藿黄酮类化合物的超声波、微波辅助提取机理,不仅有助于解决植物次级代谢产物分离工程领域的基本理论问题〔2〕,而且有可能推动淫羊藿在医药、食品工业中的应用进程。

采用落射荧光显微镜技术（epifluorescentmicroscopy）和免疫定位实验（immuno2localizationexperiment）等揭示淫羊藿黄酮类化合物在细胞中的合成、贮藏部位〔40〕,采用光学显微镜技术、电子显微镜技术等观察超声波、微波处理对淫羊藿组织和细胞的效应,有助于阐明淫羊藿黄酮类化合物的外场辅助提取机理。

提取设备是中药材生物活性成分提取的核心装置。

设计、改进淫羊藿黄酮类化合物提取设备,对于提取工艺的优化、提取效率的提高以及工业化大规模提取的实现具有至关重要的作用。

罗马尼亚科学院设计的超声波提取装置（工作容积7002850L）已经在PLAFAR工厂的药用植物活性物质提取实践中得到应用〔1〕。

笔者设计出了一种新型超声波微波耦合提取装置,具有高效、节能、安全、耐用等优点,在中药材生物活性成分的外场辅助提取中具有一定的应用价值〔41〕。

3.3　全面考察遗传因素和环境因素对淫羊藿中黄酮类化合物含量的效应　系统研究品种、居群、日照、温度、降水量、湿度、土壤、水质、地势以及伴生群落植物等因素对淫羊藿中黄酮类化合物分布与水平的影响,有助于揭示黄酮类化合物的品种、居群间差异以及季节性、地域性变异规律,为淫羊藿黄酮类化合物提取所需药材原料的选择提供指导。

刘敏等〔12〕证明湖北省恩施市出产的箭叶淫羊藿中总黄酮的含量比福建省三明市高,更适合作为提取所需药材原料。

李玉山等〔16〕从四川省不同地区出产的11个淫羊藿样品中筛选出了1个淫羊藿苷含量较高的样品作为提取所需药材原料。

笔者考察了20个不同品种、不同产地野生淫羊藿中淫羊藿苷、朝藿定A、朝藿定B和朝藿定C的含量,最终选择陕西省出产的心叶淫羊藿作为提取所需药材原料,优化得到了四种标志化合物的提取工艺〔5〕。

遗传因素和环境因素对淫羊藿中黄酮类化合物含量的影响以及提取所需药材原料的筛选研究,关系到提取效率的高低和纯化环节的难易,值得深入探讨。

参考文献

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