HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察文档格式.docx
《HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察文档格式.docx》由会员分享，可在线阅读，更多相关《HPLC法测定非诺贝特含量的方法学考察文档格式.docx（23页珍藏版）》请在冰豆网上搜索。
fenofibrate2.750～24.750g/ml,G/mrangeinside（r=0.9999）,Thistestrequirements,withgoodprecision,Thisproductofmobilephasesolutionatroomtemperature,8hourswithgoodstability,determinationofrequirements,Conclusion:
themethodisrapid,accurate,reproducibleandcanbeusedforfenofibratecontentdetermination.
Keywordsfenofibrate,HPLC,contentandmethods
引言
随着人们生活水平的提高,血脂异常的病例近年有明显的上升趋势。
高脂血症是公认的高血压、冠心病和脑血管意外的主要危险因素，同时它又与许多疾病相关。
因此，纠正脂代谢紊乱，对改善冠心病、高血压及相关疾病的症状，降低脑血管意外的发生具有十分重要的意义。
而非诺贝特是临床常用的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平以及升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL）水平[1]。
第一章立题简介
1.1非诺贝特简介
非诺贝特（C20H21ClO4）是临床常用的调血脂药物,其主要作用是可显著降低血清甘油三酯（TG）、总胆固醇（TC）和低密度脂蛋白胆固醇（LDL）水平以及升高高密度脂蛋白胆固醇（HDL）水平。
其作用机制主要是通过激活脂蛋白酶，促进富含TG的乳糜微粒和极低密度脂蛋白（VLDL）的分解，并且还可抑制肝脏合成和分泌富含TG的VLDL，从而降低血浆中TG的水平；
还可通过减少羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-CoA）还原酶前体的合成而抑制HMG-CoA的作用，从而减少TC在肝脏的合成，并增加LDL受体的数量，加速LDL由血液转入肝细胞，使血清TC和LDL水平下降，是首选的降TG药物。
临床上主要用于治疗高胆固醇血症，高甘油三酯血症及混合型血症[2]。
目前,以TG升高为主的高脂血症治疗药物有苯氧芳酸类、烟酸及鱼油等,其中以苯氧芳酸类疗效为佳。
苯氧芳酸类中又首推非诺贝特降TG最有效,且非诺贝特对羟甲基戊二酰辅酶A（HMG-coA）还原酶有一定程度抑制作用[3]。
因此,非诺贝特能够降低TC,TG,LDL-C,sLDL,apoB及升高HDL-C血浆水平,多方面对脂质代谢紊乱起调脂作用。
然而,非诺贝特属难溶性药物,口服吸收较差。
近年来发展的微粒化非诺贝特剂型,因药粉粒度减小,其微粒直径均在50μm以下,而极大增加了药物和胃肠道的接触面积,与普通剂型相比,其优点为口服吸收好,生物利用度高,能保持较恒定的血药浓度，在临床使用时较小剂量即可达到与普通剂型相同的效果[4]。
1.2HPLC法简介
高效液相色谱（high
performance
liquid
chromatography
简称HPLC）是20
世纪70
年代迅速发展起来的一种高效、快速的新型分析分离技术,是目前应用最多的色谱分析方法.高效液相色谱系统由流动相储液体瓶、输液泵、进样器、色谱柱、检测器和记录器组成，其整体组成类似于气相色谱，但是针对其流动相为液体的特点作出很多调整。
HPLC的输液泵要求输液量恒定平稳；
进样系统要求进样便利切换严密；
由于液体流动相粘度远远高于气体，为了减低柱压高效液相色谱的色谱柱一般比较粗，长度也远小于气相色谱柱。
HPLC是以液体溶剂作为流动相的色谱技术,
它是结合经典液相色谱法及气相色谱法的分析分离原理,
进一步发展并迅速成长的新型液相色谱法。
该法具有高压、高速、高效、高灵敏性等优点[7]。
而且与气相色谱法相比,
只要求试剂能制成溶液,
而不需要气化,
因此不受试样挥发性的限制。
对于高沸点、热不稳定性差、相对分子质量大的有机物,
原则上都可用高效液相色谱法来进行分离、分析[8]。
HPLC因其独特的优点已经广泛应用于药物的含量测定、组成分析、质量控制等方面,
已成为天然药物有效成分分离、分析最重要的方法之一[12]。
现在HPLC经历近40年的发展，色谱工作者可对任何类型的分离提供适用的色谱柱及相应的分离条件，并可在短的时间内，利用计算机提供的软件计算程序，获得可包含40个组分的优化完全分离。
现在除低沸点化合物使用GC分析外，其他样品都可用HPLC进行分析。
但随着质谱分析技术的快速发展，可以预见质谱分析将在当代发展成为继色谱分析之后的，一种通用的分离和分析方法。
HPLC由于具有高选择性、高灵敏度,
并可同时用于有关物质检查与含量测定的特点,
已成为医药研究的有力工具[15]。
如在中草药有效成分的分离和纯度测定、人工合成药物成分的定性和定量测定、新型高效手性药物中手性对映体含量的测定以及药物代谢物的测定等方面
都需要用到HPLC的不同测定方法予以解决。
第二章实验部分
2.1检测波长选择
精密称取非诺贝特50mg，置100ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液2ml，置另一100ml量瓶中，加无水乙醇至刻度，摇匀，照紫外分光光度法（中国药典2010年版二部附录IVA）,测得非诺贝特的无水乙醇溶液在286nm附近有最大吸收，见图1，故选择286nm为含量测定的检测波长。
图1非诺贝特的吸光度与波长关系
Figure1Fenofibrateenhancestheabsorbencyandwavelength
2.2流动相选择
在实验过程中，根据其本身性质及参考相关文献，选择甲醇-水、乙腈－水为流动相组成，进行试验，优化流动相，经过对各组份比例的考察，具体见表1、图2～4，最终确定本品的流动相为甲醇-水，分离效果好，保留时间合适。
表1非诺贝特流动相的选择
Table1fenofibrateflowoftheselect
编号
流动相的选择
结论
A
甲醇-水（85：
15）
分离效果差，杂峰与主峰未完全分开
B
甲醇-水（81：
19）
分离效果好，分离度合格
C
乙腈-水（80：
20）
分离效果较好，分离度合格，但对小杂峰的分离不如甲醇系统
图2流动相甲醇-水（85:
Figure2mobilephasefisherchemalertguide（85:
图3流动相甲醇-水（81:
Figure3mobilephasefisherchemalertguide（81:
图4流动相乙腈-水（80:
Figure4mobilephaseanhydrousacetonitrile（80:
2.3实验仪器及色谱条件
仪器：
泵：
岛津LC-10ADvp高效液相色谱仪
检测器：
岛津SPD-10AVvp紫外检测器
工作站：
N2000色谱数据工作站
色谱条件：
流动相：
色谱柱：
十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂
检测波长：
286nm
流速：
1.0ml/min
进样体积：
20l
2.3方法学考察
2.3.1线性与范围
取经50℃减压干燥至恒重的非诺贝特对照品50mg，精密称定，置100ml量瓶中,用无水乙醇溶解并稀释至刻度,摇匀，作为储备液。
分别精密吸取储备液1、1.5、4、5、8ml置200ml量瓶中,用无水乙醇稀释至刻度，摇匀。
依色谱条件，分别精密量取20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，以浓度C（g/ml）为横坐标，峰面积A为纵坐标，进行线性回归，并计算回归方程和相关系数。
结果见表2，色谱图见图5～10。
表2线性相关性实验结果
Table2relevantresultsofthelinear
序号
1
2
3
4
5
浓度（g/ml）
2.750
5.500
12.375
15.097
24.750
峰面积
118996
237138
534909
653658
1064235
回归方程
A=43010X+1612R=0.9999（n=5）
线性范围
2.750～24.750g/ml
图5非诺贝特线性图
Figure5linearofFenofibrate
图62.750g/ml线性色谱图
Figure62.750g/mllinearthecolorspectrum
图75.500g/ml线性色谱图
Figure75.550g/mllinearthecolorspectrum
图812.375g/ml线性色谱图
Figure812.375g/mllinearthecolorspectrum
图915.097g/ml线性色谱图
Figure915.097g/mllinearthecolorspectrum
图1024.750g/ml线性色谱图
Figure1024.750g/mllinearthecolorspectrum
本品在2.750～24.750g/ml范围内呈良好的线性关系。
2.3.2进样精密度
取非诺贝特样品适量，用流动相溶解并稀释制成浓度为50g/ml的溶液，作为供试品溶液。
依法测定，连续进样5次，每次20l，记录峰面积，并对结果进行评价，结果见表3，色谱图见图11～15。
表3含量测定（HPLC法）进样精密度试验结果
Table2InthisexperimentinprecisionbyHPLC
进样次数
5272159
5266556
5253841
5248069
5258487
平均值±
SD
5260156±
9660
RSD
0.18
图11精密度试验色谱图1#
Figure11Refinedthecolorspectrumfigure1#
图12精密度试验色谱图2#
Figure12Refinedthecolorspectrumfigure2#
图13精密度试验色谱图3#
Figure13Refinedthecolorspectrumfigure3#
图14精密度试验色谱图4#
Figure14Refinedthecolorspectrumfigure4#
图15精密度试验色谱图5#
Figure15Refinedthecolorspectrumfigure5#
本法精密度良好，符合测试要求。
2.3.3溶液稳定性
置于室温于0、1、2、4、6、8和24小时，精密吸取20l，依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。
试验结果见表4，色谱图见图16～21。
表4含量测定（HPLC法）溶液稳定性试验结果
Table4InthestabilitytestresultsbyHPLC
时间（h）
6
8
5310500
5216191
5258941±
30621
0.58
图16稳定性0小时色谱图
Figure16Stability0hoursthecolorspectrum
图17稳定性1小时色谱图
Figure17Stability1hoursthecolorspectrum
图18稳定性2小时色谱图
Figure18Stability2hoursthecolorspectrum
图19稳定性4小时色谱图
Figure19Stability4hoursthecolorspectrum
图20稳定性6小时色谱图
Figure20Stability6hoursthecolorspectrum
图21稳定性8小时色谱图
Figure21Stability8hoursthecolorspectrum
由实验可知本品溶液在24小时内较稳定。
2.3.4准确度
分别精密称取非诺贝特（批号：
090901）50mg，置100ml量瓶中；
再分别加入非诺贝特对照品40mg,50mg，60mg，精密称定，用流动相溶解，再用流动相稀释制成40g/ml,50g/ml，60g/ml三个浓度的溶液，依色谱条件，分别精密量取20l，注入液相色谱仪，记录色谱图，计算测得量，根据测得量和加入量计算回收率。
试验结果见表5。
表5含量测定（HPLC法）准确度试验测定结果
Table5IndeterminingtheaccuracyofthetestresultsbyHPLC
浓度（%）
样品
加入量（g）
对照品
测得量（g）
回收率（%）
80
0.0501
0.04001
0.03990
99.73
99.66±
0.62
0.0503
0.04013
0.03943
98.26
0.0508
0.04082
0.04084
100.05
100
0.0498
0.05023
0.04983
99.20
0.0592
0.05102
0.05080
99.56
0.0506
0.05006
100.34
120
0.0499
0.06024
0.06022
99.96
0.0505
0.06003
0.06005
100.04
0.0504
0.06008
0.05994
99.77
本法准确度良好，符合测试要求。
2.3.5重复性试验
取非诺贝特样品适量，共5份，精密称定，用流动相溶解并稀释制成浓度为50g/ml的溶液，作为供试品溶液。
依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图。
并对结果进行评价。
试验结果见表6，色谱图见图22～26。
表6含量测定重复性试验结果
Table6Inthepresentexperiment
份数
含量（％）
99.8243
99.8209
99.8165
99.8144
99.8151
SD（％）
99.8182±
0.004
RSD（％）
0.17
图22重复性试验色谱图1#
Figure22Repetitivethecolorspectrumfigure1#
图23重复性试验色谱图2#
Figure23Repetitivethecolorspectrumfigure2#
图24重复性试验色谱图3#
Figure24Repetitivethecolorspectrumfigure3#
图25重复性试验色谱图4#
Figure25Repetitivethecolorspectrumfigure4#
图26重复性试验色谱图5#
Figure26Repetitivethecolorspectrumfigure5#
上述结果表明，本法重复性良好，符合测试要求。
2.3.6中间精密度试验
在不同的五天内取非诺贝特样品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成浓度为50g/ml的溶液，作供试品溶液。
依色谱条件，注入液相色谱仪，记录色谱图，并对结果进行评价。
结果见表7，色谱图见附图27～31。
表7含量测定中间精密度试验结果
Table7Intheoutcomeoftherefined
99.24
100.1
100.2
99.93
100.0
99.89±
0.38
图27中间精密度试验第一天色谱图
Figure27Oftheexperimentthefirstsettheprecision
图28中间精密度试验第二天色谱图
Figure28Thetestofthesecondsettheprecision
图29中间精密度试验第三天色谱图
Figure29Oftheexperimentthirdsettheprecision
图30中间精密度试验第四天色谱图
Figure30Thetestofthefourthsettheprecision
图31中间精密度试验第五天色谱图
Figure31Ofthespectrumofthefifththepreciseness
上述结果表明，本法精密度良好，符合测试要求。
2.3.7样品含量测定
取本品适量，精密称定，用流动相溶解并稀释制成每1ml中含50g的溶液，精密量取20l注入液相色谱仪，记录色谱图；
另取、对照品适量，同法测定。
按外标法以峰面积计算，即得。
结果见表8，色谱图见图32～34
表8三批样品含量测定结果
Table8Threeinthesample
批号
090901
090902
090903
99.89
99.83
99.84
图32090901批含量色谱图
Figure32090901ofthecontentofthecolorspectrum
图33090902批含量色谱图
Figure33090902ofthecontentofthecolorspectrum
图34090903批含量色谱图
Figure34090903ofthecontentofthecolorspectrum
第三章结果与讨论
非诺贝特在2.750～24.750g/m范围内线性关系良好（r=0.9999）；
HPLC法具有重现性好，专属性强、无干扰、分析快速准确的特点，可以用于非诺贝特含量测定。
致谢
我要特别的感谢给予我指导的徐兵老师和实习单位的程浩老师，在我写论文期间悉心指导，指出诸多不足之处并给了我很多建议。
老师们渊博的知识、踏实的治学风格和认真负责的精神让我受益匪浅，是我学习的榜样。
我还要感谢给予我大量帮助的同事朱叶，郭颖等，在我做实验期间，对一些问题的探讨和交流让我开拓了思路，也让我在写毕业论文时非常轻松，愉快。
同时我还要感谢给我实习机会的南京卡文迪许生物工程技术有限公司,给我提供做毕业论文和毕业实习的条件,让我学到更多实验实际中的知识，让我对本专业的知识有了更进一步的了解。
此外，一并感谢系科，各位老师，教务处以及为所有我提供过帮助的人！
参考文献：
[1]李佳杨;
李芳;
张洪飞;
郭兴杰高效液相色谱法测定非诺贝特渗透泵型控释片的含量[S].中国药学杂志.2009，44（10）:
799-800
[2]张招忠，项凡英，高效液相色谱法测定非诺贝特含量.分析测试技术与仪器，1999，5（3）:
155～156
[3]范国荣，林梅，张正行，人血浆中非诺贝特活性代谢物非诺贝酸的高效液相色谱法测定，药物分析杂志[J].2000,20（4）:
231-234
[4]李小燕，反相高效液相色谱法测定非诺贝特片的含量，中国医院药学杂志[J]2004,24（4）:
251-252
[5]何勇,夏涛，HPLC法测定非诺贝特胶囊的含量,安徽医药[J]2004，9
（2）:
118-119
[6]非诺贝特.中华人民共和国药典2010版二部
[7]张玉奎、张维冰、邹汉法。
液相色谱分析。
第二版。
北京：
化学工业出版社，2000.12
[8]于世林.高效液相色谱方法及应用。
化学工业出版社，2005.6
[9]高潮译.现代液相色谱法导论.北京:
化学工业出版社,1988.1
[10]战英民.英汉色谱技术词汇.第二版.北京:
科学出版社,1982
[11]曾元儿，张凌.高效液相色谱法.仪器分析：
234～258
[12]张健泓，陈优生.高效液相色谱法概论中国医药导报2008年第5卷第22期28～29
[13]董学畅,张甜.微柱高效液相色谱及其研究进展.云南化工2004年第31卷第5期
23～26
[14]冯利，庞静秋高效液相色谱法在药物分析专业的应用黑龙江医药2003，16，1.43～44
升级会员 