庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系.docx
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庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系
庆大霉素耳中毒后不同时刻耳蜗血管纹HSP70表达与ABR的关系
【摘要】观看庆大霉素（GM）耳中毒后不同时刻豚鼠耳蜗血管纹热休克蛋白70（HSP70）表达与ABR的关系。
方式：
选用健康白色红目豚鼠100只，体重200～250g，随机分为：
生理盐水组、GM组，各组皆持续用药10d。
各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。
在用药前和停药后一、3、7、14、30d别离检测ABR阈值，停药处身后应用SABC免疫组化技术，观看GM中毒后不同时刻豚鼠耳蜗血管纹HSP70表达情形。
结果：
GM组停药3d时耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物表达最多，ABR阈值最高。
以后随着停药时刻延长，染色慢慢变浅，ABR阈值慢慢降低，停药30d时染色接近正常，但ABR阈值仍明显高于正常，它们与正常对照组相较不同均有显著意义（P﹤）。
结论：
耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物灰度值与ABR之间呈线性关系，能够作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。
【关键词】耳毒性庆大霉素热休克蛋白耳蜗免疫组化
AbstractObjective：
Tostudytherelationshipofexpressionofheatshockprotein70（HSP70）instriavascularisandABRongentamicin（GM）ototoxicityinducedindifferenttimeofguineapigscochlea.Methods:
Atotalof100healthywhiteguineapigswithredeyeswerestudied.Theywereall200～250gweightanddividedintotwogroups,GMandsalinecontrol.Eachgroupweremedicatedcontinuitlyfor10auditorybrainstemresponse（ABR）thresholdonthe1st,3rd,7th,14th,30thdaybeforeadministrationandafterdiscontinuationwerestainingwasusedtoobserveGMototoxicityinducedexpressionofHSP70.Results:
TheexpressionofpositiveproductionofHSP70instriavascularisofcochleareachedthemaximumonthe3rddayafterdiscontinuationinGMgroup,aswellasthethresholdofABR.ThestainingtrunedtolightgraduallyandthethresholdofABRdegradedgraduallyaccompaniedwithextensionoftimeofdiscontinuation.Thestainingapproachednormollevelonthe30thdayafterdiscontinuation,butthethresholdofABRwasstillhigherthannormollevel,andtherewassignificancecomparedwiththecontrolgroup（P﹤.Conclusion:
TherewasalinearcorrelationbetweentheaveragegrayofHSP70instriavascularisandtheABRthresholds.HSPisalsotheindexofcellresumingafterstressstimuli.
Ｋｅｙ ｗｏｒｄｓdrugtoxity;gentamicins;heatshockprotein;striavascularis;immunohistochemistry
庆大霉素（gentamicin，GM）耳中毒后能够诱发耳蜗热休克反映,增加热休克蛋白（heatshockprotein,HSP）70在豚鼠耳蜗的表达,且ABR阈值转变与HSP70表达的转变高度负相关，HSP70具有爱惜听力的作用[1]。
用扫描电镜（scanningelectronmicroscopy，SEM）的方式结合听脑干反映（auditorybrainstemresponse，ABR）阈值的检测已经证明：
GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞损伤后存活30d者其耳蜗毛细胞形态上有所恢复，且ABR阈值也有必然程度的恢复，GM耳中毒后豚鼠耳蜗毛细胞具有再生修复能力[2]。
那么，HSP70在GM耳中毒后不同时刻是不是也表达并具有爱惜听力的作用呢？
HSP70的表达与ABR的关系如何呢？
目前尚不清楚。
本实验应用SABC免疫组化技术及图像分析技术并结合ABR测试，观看GM耳中毒不同时刻豚鼠耳蜗HSP70表达及HSP70表达与ABR的关系，进一步探讨HSP70表达与GM耳中毒毛细胞再生修复的关系及作用机制。
1材料与方式
实验动物分组及耳毒模型的复制耳廓反射灵敏的健康白色红目豚鼠100只（沈阳医学院动物室提供），体重200～250g，雌雄不拘，随机分成正常对照组、GM组，每组50只。
正常对照组：
每日腹腔注射GM等量的生理盐水kg（河南三九益民制药生产，批号：
0501）；GM组：
每日腹腔注射硫酸GM注射液100mg/kg（沈阳第一制药厂生产，批号：
0308021）。
各组皆持续用药10d。
各组动物混合饲养，每日测量体重调整药量。
ABR阈值检测在用药前和停药后第一、3、7、14、30天，用1%戊巴比妥钠（40mg/kg）腹腔麻醉，利用Danac7型声刺激器（日本ダナジャパン株式会社）发出主频率为2kHz的滤波click声刺激信号，滤波带宽50～3000Hz，距离时刻90ms，扫描时刻20ms，耳机距豚鼠外耳道约左右。
记录电极置颅顶正中，参考电极及接地电极别离置于给声耳及对侧耳后乳突部皮下，以DAT100型叠加仪（日本光电株式会社）进行叠加200次，以VC10示波器（日本光电株式会社）输出信号，观看时程为20ms，测试强度由95dBnHL开始，按10dB递减，接近阈值后按5dB逐档递减，听阈判定以刚显现ABR的P3波为准。
耳蜗冰冻切片的制备各组豚鼠在行第二次ABR检测后，将豚鼠快速断头，迅速掏出听泡。
打开听泡后，充分暴露耳蜗，在解剖显微镜下刺破圆窗膜，将镫骨底脱位暴露卵圆窗，在蜗顶钻一小孔，用微量注射器缓慢注入含40g/L多聚甲醛的磷酸缓冲液，再将标本置于上述固定液中4℃下2h。
磷酸盐缓冲液（phosphatebufferedsolution,PBS）冲洗后，放入100g/LEDTA中4℃下脱钙5～7d，再移入250g/L蔗糖磷酸缓冲液中，4℃留宿。
第二天用OCT包埋，行20μm恒冷冰冻切片。
免疫组织化学方式检测HSP70HSP70免疫组织化学方式检测试剂盒由武汉博士德生物工程提供。
切片干燥后，用蒸馏水洗3次。
将切片放入用甲醇稀释的5g/LH2O2中室温下浸泡30min，以灭活内源性过氧化物酶，蒸馏水洗3次。
滴加抗原修复液，室温10min，蒸馏水洗3次。
滴加正常血清封锁液，室温下孵育20min，甩去多余的液体，然后滴加稀释度为1：
150的一抗，4℃留宿。
用L的PBS（pH=）洗3次。
滴加二抗，室温孵育20min，用L的PBS洗3次。
滴加SABC溶液，室温孵育20min，L的PBS漂洗4次，DAB显色，脱水，透明，封片。
显微镜下观看。
阴性对照组，用L的PBS代替一抗，其他程序不变。
显微图像分析处置采纳MetaMorph/Coolsnapfx/AX70显微图像分析系统（美国、日本联合生产），每组随机抽取20张切片，将载玻片置于显微镜（10×40）下，呈现图像后，用数码照相机拍照后，将图像输入运算机，在一样条件下测量各组每张切片血管纹细胞HSP70阳性反映产物灰度值，别离计算各组血管纹细胞HSP70阳性反映产物平均灰度值。
统计分析将实验数据进行处置，数据以均值±标准差（x±s）表示，显著性查验采纳t查验及相关分析。
2结果
ABR阈值检测各组ABR结果如表1所示。
各组用药前ABR阈值不同无显著意义（P﹥）。
停药1d后，GM组的ABR阈值明显高于正常对照组（P﹤）；停药3d时，GM组的ABR阈值最高，以后随着停药时刻延长ABR阈值慢慢降低，但仍明显高于正常对照组（P﹤）。
表1各组豚鼠用药前后的ABR阈值注：
与用药前比较：
1）P﹤；与正常对照组比较：
2）P﹤HSP70免疫组织化学方式检测结果
光镜观看结果豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物呈棕黄色颗粒。
正常对照组细胞：
各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物均呈弱阳性；GM组的豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物明显强于正常对照组，随着时刻延长染色慢慢减弱，停药30d时染色接近于正常（如图1～3所示）。
图像分析各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值结果如表2所示。
GM组中停药后不同时刻豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物的平均灰度值均较正常对照组明显减少（P﹤），即GM能显著增强耳蜗HSP70的表达。
在各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值,停药3d组其HSP70阳性反映的平均灰度值最低。
停药30d时染色接近于正常，较正常对照组相较不同无显著意义（P＞）。
表2各组豚鼠耳蜗各部份HSP70阳性反映的平均灰度值比较：
与正常对照组比较：
1）P﹤；2）P﹤
豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值与ABR阈值的关系停药后不同时刻，随着各组豚鼠耳蜗HSP70阳性反映的平均灰度值的转变，ABR阈值也发生相应的转变，耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值越高，ABR阈值越低，它们之间呈负相关（表3）。
即HSP70表达越少，ABR阈值越低。
表3豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映平均灰度值与ABR阈值的相关分析注：
相关系数的假设查验：
1）P﹤
3讨论
实验结果说明，在各时刻组豚鼠耳蜗ABR阈值检测中，停药3d时，GM组的ABR阈值最高；在各时刻组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映的平均灰度值,停药3d组其阳性反映的平均灰度值最低。
这意味着GM耳中毒后，以停药3d组受损最重，且HSP70的表达和生理功能具有一致的表现。
HSP70的细胞爱惜作用是指在受到各类应激刺激时，产生HSP70能够增强细胞对损害的耐受程度，维持细胞的正常功能代谢，提高细胞生存率[3]。
在应激状态下，HSP70的表达及细胞爱惜作用与细胞的生理状态有关。
Gutsmann等证明，随着机体衰老和细胞老化，HSP70和HSP70mRNA的功能和合成均有所降低，因此HSP表达的改变不仅可能是机体衰老和细胞老化的一个重要因素，而且还能够作为判定细胞生理状态和应激能力的一个标准[4]。
实验结果说明，在GM耳中毒后HSP70表达增强，说明GM耳中毒耳蜗细胞生理功能状态良好。
实验结果还证明，随着GM耳中毒后停药时刻的延长，各组豚鼠耳蜗ABR阈值降低，且各组豚鼠耳蜗血管纹HSP70阳性反映产物减少、灰度值增加，HSP70阳性反映产物灰度值与ABR之间呈负相关。
咱们前期工作已经证明在停药30d时，GM耳中毒耳蜗毛细胞在形态和功能上都可有必然程度的恢复。
因此咱们以为，HSP还能够作为细胞受到应激刺激后细胞恢复程度的一个指标。
目前，大多数学者以为HSP在应激情形下表达具有使听觉细胞免受进一步损害，具有爱惜听力的作用[5]。
HSP的细胞爱惜作用与由于感染、中毒、缺血、缺氧引发毛细胞损伤，常伴有大量OH-·、O-·2和H2O2的产生，促使细胞内“Ca2+超载”，和细胞内蛋白质构型改变和功能障碍，由此引发细胞的应激反映。
HSP通过反馈作用减少自由基的产生以爱惜细胞免受进一步损害有关。
Na+/K+ATP酶是所有高等动物的大多数细胞膜的一个组成部份[6]，也是内耳能量代谢和离子转运的关键酶之一，它是耳蜗代谢改变和初期病理转变的基础[7]。
有文献报导AmAn耳毒性与耳蜗Na+/K+ATP酶活性降低有关[8]。
HSP可使严峻受损而难以恢复的蛋白迅速降低，恢复细胞膜上Na+/K+ATP酶活性[9]。
在GM各时刻组中，随着停药时刻的延长，豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映产物慢慢减少，且ABR阈值有所恢复，在停药30d时豚鼠耳蜗各部位HSP70阳性反映产物的灰度值和ABR阈值接近正常对照组。
推测HSP70在GM耳中毒耳蜗毛细胞再生修复中可能与通过恢复细胞膜上Na+/K+ATP酶活性，来降低GM的耳毒性，使耳蜗细胞恢复正常生理功能，增进耳蜗毛细胞的再生和修复有关。
【参考文献】
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