转g10epsps基因耐除草剂大豆ZUTS33转化体特异性检测方法的建立Word格式文档下载.docx
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1.2DNA提取与纯化
使用植物基因组DNA提取试剂盒提取并纯化所有材料的基因组DNA,具体步骤按照试剂盒使用说明书操作。
获得的基因组DNA用NanoDrop2000C核酸蛋白测定仪进行核酸质量分析。
为符合进一步检测的要求,所有材料基因组DNAOD260/OD280在1.7～2.0之间,浓度在30～70ng·
μL-1之间,于-20℃保存备用。
1.3实时荧光定量PCR方法建立
1.3.1引物和探针设计
根据转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33左右边界侧翼序列信息[13],通过PrimerPremier5.0软件设计转化体特异性引物和探针。
转化体特异性探针5′端修饰基团为6-羧基荧光素（6-carboxy-fluorescein,FAM）,3′端为黑洞淬灭基团（BHQ1）,内源基因为编码大豆凝集素的基因Lectin基因,引物探针引用欧盟CRLVL08/05VR[14]中的序列,具体信息见表1。
引物和探针均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。
Table1Primersandprobesusedinthisstudy
表1引物和探针引物/探针
序列（5′→3′）
扩增片段长度/bp
用途
ZUTS-33-LB-qF
5′-GCGTCAATTTGTCCGCAAG-3′
109
转化体特异性
ZUTS-33-LB-qR
5′-AGATGATGATTCATACATGGACACT-3′
ZUTS-33-LB-P
5′-FAM-CAGCTTCTTCTTCTCCGACGTTGT-BHQ1-3′
ZUTS-33-RB-qF1
5′-GCCTTGCCGGTAGTAGGATC-3′
124
ZUTS-33-RB-qR1
5′-AGATTGTCGTTTCCCGCCTT-3′
ZUTS-33-RB-P1
5′-FAM-TCGTAGCCGTGTCGCCTTGC-BHQ1-3′
ZUTS-33-RB-qF2
5′-CTTGCCGGTAGTAGGATCGAC-3′
141
ZUTS-33-RB-qR2
5′-GAGCAGCTTGAGCTTGGATCA-3′
ZUTS-33-RB-P2
5′-FAM-CAGGTGGTCTAGTGGCCAATGATCGTAG-BHQ1-3′
ZUTS-33-RB-qF3
5′-GATCGTAGCCGTGTCGCCT-3′
139
ZUTS-33-RB-qR3
5′-AGAGGCCCGCACCGATC-3′
ZUTS-33-RB-P3
5′-FAM-CCAAGCTCAAGCTGCTCTAGCATTCGCC-BHQ1-3′
Lec-F
5′-CCAGCTTCGCCGCTTCCTTC-3′
74
内源基因
Lec-R
5′-GAAGGCAAGCCCATCTGCAAGCC-3′
Lec-P
5′-FAM-CTTCACCTTCTATGCCCCTGACAC-BHQ1-3′
1.3.2引物探针适用性测试
以质量分数为1%的转基因大豆ZUTS-33基因组DNA为模板,采用通用的实时荧光定量PCR反应体系和程序进行扩增。
反应体系为:
2×
TaqManFastAdvancedMasterMix12.5μL,10μmol·
L-1上、下游引物各1.0μL,10μmol·
L-1探针0.5μL,25mg·
L-1
DNA2.0μL,补水至25μL。
反应程序为:
95℃预变性5min;
95℃变性15s,60℃退火/延伸1min（在此阶段收集荧光信号）,共40个循环。
根据荧光曲线的线性、相对Ct值等因素,确定引物和探针组合。
1.3.3实时荧光定量PCR方法反应体系优化
为获得最优的引物和探针反应浓度,将探针的浓度设置为0.10、0.20、0.25、0.30、0.40、0.50μmol·
6个探针浓度梯度,对应的引物浓度为探针浓度的2倍,采用通用的实时荧光定量PCR反应程序进行扩增。
根据荧光曲线的线性、相对Ct值等因素,确定体系中引物和探针的最优浓度。
1.4实验室内方法确认
1.4.1检测方法特异性
选用质量分数为1%的转基因大豆ZUTS-33、62种不同的主要商业化转化体、转基因大豆ZUTS-33阴性对照（即受体）、其他非转基因大豆作为测试对象,对1.3中建立的耐除草剂大豆ZUTS-33实时荧光PCR方法进行特异性测试,以验证候选引物和探针组合是否仅在阳性样品中获得预期的扩增。
1.4.2标准曲线绘制
根据EURL[15]对实时荧光定量PCR标准回归曲线的各项参数的详细规定,标准曲线的线性相关系数R2≥0.98,扩增效率E[Efficiency=10（-1/slope）-1]的范围为90%～110%,斜率（slope）范围为-3.1～-3.6。
提取质量分数为100%的ZUTS-33大豆样品的DNA,将基因组DNA（25ng·
μL-1）按6倍浓度梯度依次进行稀释,配制成了5个含量的标准样品,依次为22422、3737、623、104、17copies·
μL-1。
采用1.3中建立的最优体系和通用反应程序进行实时荧光定量PCR反应,每个PCR反应设置3个平行,重复3次实验。
根据标准DNA溶液PCR反应的Ct值及初始模板拷贝数的对数绘制ZUTS-33的标准曲线。
根据标准曲线的各项参数（R2、效率E、斜率）确认方法是否符合要求。
1.4.3准确度、精确度和重复性评价
将研磨好的转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33品系大豆和其受体材料（非转基因大豆）按照质量百分比进行混合,配制了3个不同转基因百分含量的样品,质量分数分别为5.0%、1.0%和0.5%。
采用1.3中建立的最优体系和通用反应程序进行内标准基因Lectin和转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33转化体特异性实时荧光定量PCR检测。
每次设3个平行,重复3次实验,计算多次测试的偏差（Bias）和相对标准偏差（relativestandarddeviation,RSD）,评价测试方法的准确度和精确度。
1.4.4检测极限和定量极限确定
根据《转基因植物及其产品成分检测实时荧光定量PCR方法制定指南》（农业部2259号公告-5-2015）的规定,转基因检测方法的检测极限（limitofdetection,LOD）应不高于目标浓度的1/20,定量极限（limitofquantity,LOQ）应不高于目标浓度的1/10。
根据《农业转基因生物标识管理办法》,我国目前对转基因食品实行强制标识管理制度,只要食品中检出转基因成分就需进行标识,并未设定阈值[15]。
本研究设定的目标浓度参考欧盟阈值0.9%,因此,检测极限LOD≤0.045%（相当于50ngDNA模板中含有约20拷贝的ZUTS-33转化体特异性序列）,定量极限LOQ≥0.09%（相当于50ngDNA模板中含有约40拷贝的ZUTS-33转化体特异性序列）。
本研究设置了反应体系中含有20拷贝和10拷贝2种ZUTS-33转化体特异性序列对方法LOD进行测试,设置了40拷贝和20拷贝2种ZUTS-33转化体特异性序列对方法LOQ进行测试,以确定方法的LOD和LOQ。
2结果与分析
2.1引物探针适用性测试
为了获得扩增效果最好的引物和探针,以质量分数为1%的转基因大豆ZUTS-33基因组DNA为模板进行适用性测试。
测试结果（图1）表明,4组引物探针组合扩增Ct值无明显差异,但组合A扩增曲线上升幅度最大,线型最好,即引物探针组合ZUTS-33-LB-qF/qR/P（以下文中定名为ZUTS-33-qF/qR/P）的扩增效果最好。
因此,选择ZUTS-33-qF/qR/P作为候选的实时荧光定量PCR引物进行进一步测试。
2.2实时荧光定量PCR反应体系优化
为了获得最优的反应体系,本研究对反应体系中引物和探针设置了不同的浓度进行测试。
结果表明（图2）,随着引物和探针浓度的增加,扩增曲线呈现上升的趋势,Ct值逐渐减小,0.20μmol·
L-1及以上浓度的Ct值无明显差异。
当反应体系中探针浓度为0.10μmol·
L-1时,Ct值约为33,当反应体系中探针浓度为0.20μmol·
L-1及以上时,Ct值约为32。
考虑内源基因扩增反应体系,最终确定检测的引物浓度为0.40μmol·
L-1,探针浓度为0.20μmol·
L-1。
反应体系确定为:
Mix12.5μL,10μmol·
图1实时荧光PCR引物的适用性测试
图2实时荧光PCR反应体系优化
2.3特异性测试
为了验证适应性试验筛选出的候选引物和探针组合是否仅在阳性材料中获得预期的扩增,采用质量分数为1%的转基因大豆ZUTS-33、62种不同的主要商业化转化体、转基因大豆ZUTS-33阴性对照（即受体）、其他非转基因大豆作为测试对象,进行了特异性试验。
测试结果（图3）显示,仅耐除草剂大豆ZUTS-33获得了典型的扩增曲线,其余转化体及ZUTS-33阴性对照、其他非转基因大豆均未出现扩增,表明建立的实时荧光PCR方法具有高度的特异性。
图3ZUTS-33转化体检测方法特异性测试
2.4标准曲线绘制
将质量分数为100%的转基因大豆ZUTS-33基因组DNA进行梯度稀释,以获得的5个浓度的基因组DNA为模板,利用优化后的反应体系和通用反应程序进行实时荧光定量PCR,构建转基因大豆ZUTS-33品系特异性序列的标准曲线。
3次重复实验中ZUTS-33检测反应标准曲线的回归系数R2、效率E、斜率、截距等所有指标全部满足了转基因定量检测的要求[17]（图4）。
表明ZUTS-33检测体系的Ct值与模板拷贝数间均具有良好的线性关系。
2.5准确度、精确度和重复性测试
为了验证建立的检测方法是否具有良好的准确度、精确度和重复性,利用预期转基因质量分数为5.0%、1.0%、0.5%的转基因大豆ZUTS-33材料基因组DNA对内源基因Lectin和转化体特异性序列进行扩增,计算多次测试的偏差（Bias）和相对标准偏差（RSD）以评估检测方法的准确度、精确度和重复性。
3次重复测试结果（表2）显示3个浓度的偏差（Bias）均小于25%,相对标准偏差（relativestandarddeviation,RSD）均小于25%,说明ZUTS-33检测方法的准确度与精确度均符合检测的要求,重复性较好。
图4ZUTS-33检测方法标准曲线
Table2AccuracyandprecisiontestofZUTS-33detectionmethod
表2ZUTS-33检测方法准确度和精确度测试
转化体预期浓度/%
实验结果/%
平均值/%
Bias
SD
RSD/%
重复1
重复2
重复3
5.0
4.68
4.78
4.79
4.75
5.00
0.06
1.28
1.0
0.95
0.87
0.96
0.93
7.00
0.05
5.32
0.5
0.47
0.44
0.42
12.00
0.03
5.68
2.6检测极限和定量极限测试
2.6.1LOD测试
为了确定本研究建立的检测方法的LOD,分别设置反应体系中含20拷贝和10拷贝2种转化体特异性序列对方法LOD进行60个平行测试。
测试结果（图5）显示,反应体系中2种目标浓度60个平行反应均有扩增信号。
为有更好的适应性,本方法LOD设定为20拷贝。
图5ZUTS-33LOD测试扩增曲线
2.6.2LOQ测试
为了确定本研究建立的检测方法的LOQ,分别设置反应体系中含40拷贝和20拷贝2种转化体特异性序列对方法LOQ进行15个平行测试。
LOQ测试结果见表3。
当反应体系中含有20拷贝ZUTS-33转化体特异性序列（相当于ZUTS-33含量为0.045%）时,15次测试结果的偏差为2.0%,小于25%;
RSD为18.3%,小于25%。
当DNA模板中含有40拷贝ZUTS-33转化体特异性序列（相当于ZUTS-33含量为0.09%）时,15次测试结果的偏差为7.8%,小于25%;
RSD为10.6%,小于25%。
因此,由实验室内的验证估测本检测方法的LOQ不高于20拷贝,为了有更好的适应性,本方法LOQ设定为40拷贝。
3讨论
目前中国已经批准了12种转基因大豆品系（A2704-12、DP356043、DP305423、GTS40-3-2、A5547-127、MON87705、MON89788、MON87751、DAS44406-6、DAS-81419-2、305323×
GTS40-3-2、SYHT0H2）作为加工原料进口。
为了规范转基因产品的生产和销售,正确引导转基因产品的消费,保护消费者的知情权,建立准确、快速、高效的转基因大豆检测技术十分重要[18-19]。
2019年上海交通大学的转基因大豆SHZD32-01获得了农业转基因生物安全证书[农基安证字（2019）第293号],目前浙江大学自主研发的转基因大豆品系ZUTS-33也进入生产性试验。
但到目前为止尚未发布针对该转化体的检测方法。
Table3ZUTS-33detectionmethodLOQtest
表3ZUTS-33检测方法LOQ测试
转化体预期浓度/拷贝
15次测试结果
平均值
Bias/%
40
43
47
42
43.1
7.8
4.6
10.6
37
49
35
52
46
44
20
27
26
19
20.4
2.0
3.7
18.3
15
14
21
23
24
22
16
转基因成分实行阈值标识管理需要相应的精准定量检测技术支持,目前,实时荧光定量PCR法被国内外用作对转基因成分定量检测的“金标准”。
本研究基于实时荧光PCR法,首先在转基因大豆ZUTS-33外源基因插入位点旁侧序列设计引物和探针并对引物和探针的适用性进行确认,然后对获得的候选引物和探针进行条件优化,最后对建立的方法从特异性、准确度和精确度等方面进行确认。
研究结果表明建立的转基因大豆ZUTS-33转化体特异性实时荧光定量PCR检测方法具有良好的特异性、准确性、稳定性,方法的LOD为20拷贝,LOQ为40拷贝。
本研究建立的转g10-epsps基因耐除草剂大豆ZUTS-33定量检测方法可为耐除草剂大豆ZUTS-33大豆及其衍生产品的精准检测、标准制定、标准物质和试剂盒等衍生产品的开发提供技术支持。
然而,实时荧光定量PCR作为一种相对定量方法也有其局限性,在定量过程中需要依赖标准品建立标准曲线来达到对未知样品的相对定量。
数字PCR作为一种核酸绝对定量技术,它最大的特点是无需借助标准物质构建标准曲线来实现定量目的,可以有效地解决实时荧光定量PCR法的局限性。
本研究开发的引物和探针具有良好的适用性和特异性,为开发数字PCR定量检测方法提供了研究基础。
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